Test biotynylacji na powierzchni komórki

Znakowanie białek powierzchniowych komórek biotyną stanowi potężne narzędzie do badania szlaków transportu komórkowego zaangażowanych w regulację białek błonowych. Komórka utrzymuje ściśle regulowany zestaw białek na powierzchni, dzięki czemu może odbierać i reagować na informacje zewnątrzkomórkowe za pośrednictwem kilku ścieżek sygnałowych. Sugeruje się, że endocytoza, proces pochłaniania, bierze udział w regulacji tych białek powierzchniowych komórek, powodując ich internalizację. Dlatego znakowanie tych białek przed ich endocytozją środkami takimi jak biotyna pomaga naukowcom określić ilościowo ich internalizację i zbadać ich rolę w szlakach komórkowych.

W tym filmie omówimy zasady i metodologię testów biotynylacji na powierzchni komórki oraz zbadamy niektóre sposoby, w jakie naukowcy dostosowują tę metodę dzisiaj.

Przyjrzyjmy się najpierw zasadom stojącym za testem biotynylacji na powierzchni komórki.

Jak wspomniano wcześniej, komórki wykorzystują szlaki endocytarne do regulacji gęstości czasoprzestrzennej i dystrybucji białek powierzchniowych. Zinternalizowane białka są transportowane przez określone szlaki komórkowe, po których mogą być albo przetaczane do lizosomu w celu degradacji, albo zawracane z powrotem na powierzchnię komórki w celu kontynuowania aktywności. Biotynylacja powierzchni komórki ma na celu pomiar tych procesów.

Znacznik używany w tym teście, biotyna - znana również jako witamina H - jest małą, rozpuszczalną w wodzie cząsteczką. Powszechnie stosowaną pochodną biotyny do eksperymentów znakowania powierzchni jest sulfo-NHS-SS-biotyna, która składa się z grupy sulfo, grupy estrowej N-hydroksysukcynimidu, wiązania dwusiarczkowego i oczywiście biotyny. Uprość tę ogromną strukturę, zastępując biotynę literą "B."

Grupa sulfonowa w tej strukturze nadaje silny ładunek, który sprawia, że ta forma błony biotyny jest nieprzepuszczalna. Znakowanie białek powierzchniowych komórek odbywa się poprzez dodanie sulfo-NHS-SS-biotyny do komórek utrzymywanych w temperaturze ograniczającej endocytozę. Grupa NHS reaguje z aminami pierwszorzędowymi na białkach powierzchniowych, tworząc wiązania kowalencyjne.

Następnie znakowane komórki są przenoszone do temperatury pozwalającej na endocytozę, podczas której niektóre z znakowanych białek zostaną zinternalizowane. Na koniec komórki są przenoszone z powrotem do restrykcyjnej temperatury, aby zatrzymać endocytozę. W celu specyficznego ilościowego określenia zinternalizowanych białek dodaje się hydrofilowy, nieprzepuszczalny dla błony środek redukujący - taki jak L-glutation. Będzie to reagować z wiązaniami dwusiarczkowymi na nieendocytozowanej biotynie sulfo-NHS-SS i rozszczepiać grupy biotyny. W tym momencie pozostałe białka biotynylowane to te, których etykiety były chronione przed czynnikiem redukującym, ponieważ zostały wcześniej zinternalizowane.

Komórki są następnie poddawane lizie, a endocytozowane biotynylowane białka są izolowane w celu określenia ilościowego. Izolację przeprowadza się zwykle przez dodanie lizatów komórkowych do syntetycznych kulek pokrytych streptawidyną. Ponieważ streptawidyna ma niezwykle wysokie powinowactwo do biotyny, biotynylowane białka przyczepiają się do powlekanych kulek. Przeprowadza się szereg etapów płukania w celu usunięcia zanieczyszczających białek, a na koniec etap elucji w celu uwolnienia związanych białek. Białka docelowe mogą być następnie analizowane za pomocą technik takich jak Western blotting.

Ponieważ znasz już koncepcje stojące za testem biotynylacji, spójrzmy na uogólniony protokół pokazujący, jak wykonać tę procedurę w celu pomiaru endocytozy białek powierzchniowych.

Zacznij od hodowanych komórek schłodzonych do 4°C. Umieść je na lodzie, aby utrzymać temperaturę ograniczającą endocytozę. Następnie dodaje się nieprzepuszczalny dla błony odczynnik sulfo-NHS-SS-biotyny, a komórki inkubuje się w ciemności przez około 30 minut. Daje to wystarczająco dużo czasu, aby etykiety biotyny kowalencyjnie przyłączyły się do białek powierzchniowych. Komórki są następnie wyjmowane z lodu i inkubowane w temperaturze 37°C przez około 30 minut. W tej temperaturze biotynylowane białka powierzchniowe są endocytozyzowane. Po inkubacji komórki schładza się do temperatury 4°C i dodaje hydrofilowy środek redukujący, taki jak L-glutation. Reaguje to z wiązaniami dwusiarczkowymi i uwalnia grupy biotyny ze znakowanych, nieendocytozowanych białek.

Następnie komórki są poddawane lizie przez wirowanie, przerywając w ten sposób błony komórkowe i odsłaniając biotynylowane białka. Następnie lizaty są dodawane do kulek pokrytych streptawidyną, a biotynylowane białka mogą się wiązać. Kulki przemywa się zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i eluuje buforem zawierającym detergenty i środki redukujące. Odczynniki te denaturują związane białka z kulek i umożliwiają ich odzysk w eluacie. Białka w eluacie są rozdzielane na podstawie ich masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy żelowej. Wreszcie, Western blotting i sondowanie blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla białka pozwala na wizualizację docelowego białka. Procentową zawartość białka endocytozowanego można określić ilościowo na podstawie uzyskanych gęstości pasm.

Teraz, gdy rozumiesz metodologię biotynylacji komórek, przyjrzyjmy się, jak jest ona wykorzystywana w konkretnych eksperymentach.

Najczęstszym zastosowaniem tego protokołu biotynylacji jest pomiar szybkości endocytarnej określonych białek powierzchniowych komórek. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani oceną internalizacji transportera dopaminy lub DAT. Postępując zgodnie ze standardowym protokołem, naukowcy byli w stanie zmierzyć odsetek endocytozowanych DAT. Jest to reprezentatywna plama immunologiczna pokazująca linię T, odpowiadającą "całkowitej" ilości białka przed internalizacją, linia S jest przeznaczona dla "rozebranych" próbek, w których komórkom nigdy nie pozwolono przejść przez endocytozę, ale potraktowano środkiem redukującym, a pas I reprezentuje wyniki "zinternalizowanych" białek.

Oprócz samego pomiaru endocytozy białek powierzchniowych, naukowcy badają również wpływ leków na ten proces. W tym badaniu naukowcy ocenili gęstość powierzchniową DAT w odpowiedzi na leczenie aktywatorem kinazy białkowej C (PKC), którego działanie sugeruje indukowanie internalizacji DAT. Naukowcy potwierdzili to, dostosowując protokół biotynylacji in vitro do zastosowania w teście ex vivo na tkance mózgowej myszy. Dane wykazały około 30% utratę DAT z błony komórkowej w odpowiedzi na aktywację PKC.

Wreszcie, ulepszając test biotynylacji, naukowcy mogą również mierzyć recykling białek błonowych. Naukowcy badali białko kanału powierzchniowego, CFTR, odpowiedzialne za przewodzenie jonów chlorkowych. Aby ocenić recykling, naukowcy przeprowadzili standardowy protokół biotynylacji w jednej grupie komórek i zmodyfikowali protokół dla drugiej grupy komórek, dodając etapy po rozszczepieniu biotyny z nieendocytozowanych białek powierzchniowych. Te dodatkowe kroki obejmowały podniesienie temperatury z powrotem do 37°C, aby umożliwić recykling niektórych zinternalizowanych, znakowanych biotyną białek receptorowych. Obliczając różnicę między zinternalizowanymi białkami przed i po recyklingu, naukowcy byli w stanie określić ilościowo procent CFTR zawracanego z powrotem do membrany.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do testu biotynylacji na powierzchni komórki. Film opisywał etapy proceduralne tego testu i wyjaśniał reakcję zachodzącą na każdym etapie. Na koniec przeanalizowaliśmy kilka przykładowych eksperymentów, które wykazały możliwość zastosowania tej metody. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!