Test biotynylacji na powierzchni komórki
Znakowanie białek powierzchniowych komórek biotyną stanowi potężne narzędzie do badania szlaków transportu komórkowego zaangażowanych w regulację białek błonowych. Komórka utrzymuje ściśle regulowany zestaw białek na powierzchni, dzięki czemu może odbierać i reagować na informacje zewnątrzkomórkowe za pośrednictwem kilku ścieżek sygnałowych. Sugeruje się, że endocytoza, proces pochłaniania, bierze udział w regulacji tych białek powierzchniowych komórek, powodując ich internalizację. Dlatego znakowanie tych białek przed ich endocytozją środkami takimi jak biotyna pomaga naukowcom określić ilościowo ich internalizację i zbadać ich rolę w szlakach komórkowych.
W tym filmie omówimy zasady i metodologię testów biotynylacji na powierzchni komórki oraz zbadamy niektóre sposoby, w jakie naukowcy dostosowują tę metodę dzisiaj.
Przyjrzyjmy się najpierw zasadom stojącym za testem biotynylacji na powierzchni komórki.
Jak wspomniano wcześniej, komórki wykorzystują szlaki endocytarne do regulacji gęstości czasoprzestrzennej i dystrybucji białek powierzchniowych. Zinternalizowane białka są transportowane przez określone szlaki komórkowe, po których mogą być albo przetaczane do lizosomu w celu degradacji, albo zawracane z powrotem na powierzchnię komórki w celu kontynuowania aktywności. Biotynylacja powierzchni komórki ma na celu pomiar tych procesów.
Znacznik używany w tym teście, biotyna - znana również jako witamina H - jest małą, rozpuszczalną w wodzie cząsteczką. Powszechnie stosowaną pochodną biotyny do eksperymentów znakowania powierzchni jest sulfo-NHS-SS-biotyna, która składa się z grupy sulfo, grupy estrowej N-hydroksysukcynimidu, wiązania dwusiarczkowego i oczywiście biotyny. Uprość tę ogromną strukturę, zastępując biotynę literą "B."
Grupa sulfonowa w tej strukturze nadaje silny ładunek, który sprawia, że ta forma błony biotyny jest nieprzepuszczalna. Znakowanie białek powierzchniowych komórek odbywa się poprzez dodanie sulfo-NHS-SS-biotyny do komórek utrzymywanych w temperaturze ograniczającej endocytozę. Grupa NHS reaguje z aminami pierwszorzędowymi na białkach powierzchniowych, tworząc wiązania kowalencyjne.
Następnie znakowane komórki są przenoszone do temperatury pozwalającej na endocytozę, podczas której niektóre z znakowanych białek zostaną zinternalizowane. Na koniec komórki są przenoszone z powrotem do restrykcyjnej temperatury, aby zatrzymać endocytozę. W celu specyficznego ilościowego określenia zinternalizowanych białek dodaje się hydrofilowy, nieprzepuszczalny dla błony środek redukujący - taki jak L-glutation. Będzie to reagować z wiązaniami dwusiarczkowymi na nieendocytozowanej biotynie sulfo-NHS-SS i rozszczepiać grupy biotyny. W tym momencie pozostałe białka biotynylowane to te, których etykiety były chronione przed czynnikiem redukującym, ponieważ zostały wcześniej zinternalizowane.
Komórki są następnie poddawane lizie, a endocytozowane biotynylowane białka są izolowane w celu określenia ilościowego. Izolację przeprowadza się zwykle przez dodanie lizatów komórkowych do syntetycznych kulek pokrytych streptawidyną. Ponieważ streptawidyna ma niezwykle wysokie powinowactwo do biotyny, biotynylowane białka przyczepiają się do powlekanych kulek. Przeprowadza się szereg etapów płukania w celu usunięcia zanieczyszczających białek, a na koniec etap elucji w celu uwolnienia związanych białek. Białka docelowe mogą być następnie analizowane za pomocą technik takich jak Western blotting.
Ponieważ znasz już koncepcje stojące za testem biotynylacji, spójrzmy na uogólniony protokół pokazujący, jak wykonać tę procedurę w celu pomiaru endocytozy białek powierzchniowych.
Zacznij od hodowanych komórek schłodzonych do 4°C. Umieść je na lodzie, aby utrzymać temperaturę ograniczającą endocytozę. Następnie dodaje się nieprzepuszczalny dla błony odczynnik sulfo-NHS-SS-biotyny, a komórki inkubuje się w ciemności przez około 30 minut. Daje to wystarczająco dużo czasu, aby etykiety biotyny kowalencyjnie przyłączyły się do białek powierzchniowych. Komórki są następnie wyjmowane z lodu i inkubowane w temperaturze 37°C przez około 30 minut. W tej temperaturze biotynylowane białka powierzchniowe są endocytozyzowane. Po inkubacji komórki schładza się do temperatury 4°C i dodaje hydrofilowy środek redukujący, taki jak L-glutation. Reaguje to z wiązaniami dwusiarczkowymi i uwalnia grupy biotyny ze znakowanych, nieendocytozowanych białek.
Następnie komórki są poddawane lizie przez wirowanie, przerywając w ten sposób błony komórkowe i odsłaniając biotynylowane białka. Następnie lizaty są dodawane do kulek pokrytych streptawidyną, a biotynylowane białka mogą się wiązać. Kulki przemywa się zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i eluuje buforem zawierającym detergenty i środki redukujące. Odczynniki te denaturują związane białka z kulek i umożliwiają ich odzysk w eluacie. Białka w eluacie są rozdzielane na podstawie ich masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy żelowej. Wreszcie, Western blotting i sondowanie blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla białka pozwala na wizualizację docelowego białka. Procentową zawartość białka endocytozowanego można określić ilościowo na podstawie uzyskanych gęstości pasm.
Teraz, gdy rozumiesz metodologię biotynylacji komórek, przyjrzyjmy się, jak jest ona wykorzystywana w konkretnych eksperymentach.
Najczęstszym zastosowaniem tego protokołu biotynylacji jest pomiar szybkości endocytarnej określonych białek powierzchniowych komórek. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani oceną internalizacji transportera dopaminy lub DAT. Postępując zgodnie ze standardowym protokołem, naukowcy byli w stanie zmierzyć odsetek endocytozowanych DAT. Jest to reprezentatywna plama immunologiczna pokazująca linię T, odpowiadającą "całkowitej" ilości białka przed internalizacją, linia S jest przeznaczona dla "rozebranych" próbek, w których komórkom nigdy nie pozwolono przejść przez endocytozę, ale potraktowano środkiem redukującym, a pas I reprezentuje wyniki "zinternalizowanych" białek.
Oprócz samego pomiaru endocytozy białek powierzchniowych, naukowcy badają również wpływ leków na ten proces. W tym badaniu naukowcy ocenili gęstość powierzchniową DAT w odpowiedzi na leczenie aktywatorem kinazy białkowej C (PKC), którego działanie sugeruje indukowanie internalizacji DAT. Naukowcy potwierdzili to, dostosowując protokół biotynylacji in vitro do zastosowania w teście ex vivo na tkance mózgowej myszy. Dane wykazały około 30% utratę DAT z błony komórkowej w odpowiedzi na aktywację PKC.
Wreszcie, ulepszając test biotynylacji, naukowcy mogą również mierzyć recykling białek błonowych. Naukowcy badali białko kanału powierzchniowego, CFTR, odpowiedzialne za przewodzenie jonów chlorkowych. Aby ocenić recykling, naukowcy przeprowadzili standardowy protokół biotynylacji w jednej grupie komórek i zmodyfikowali protokół dla drugiej grupy komórek, dodając etapy po rozszczepieniu biotyny z nieendocytozowanych białek powierzchniowych. Te dodatkowe kroki obejmowały podniesienie temperatury z powrotem do 37°C, aby umożliwić recykling niektórych zinternalizowanych, znakowanych biotyną białek receptorowych. Obliczając różnicę między zinternalizowanymi białkami przed i po recyklingu, naukowcy byli w stanie określić ilościowo procent CFTR zawracanego z powrotem do membrany.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do testu biotynylacji na powierzchni komórki. Film opisywał etapy proceduralne tego testu i wyjaśniał reakcję zachodzącą na każdym etapie. Na koniec przeanalizowaliśmy kilka przykładowych eksperymentów, które wykazały możliwość zastosowania tej metody. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Komórka może regulować ilość poszczególnych białek na błonie komórkowej poprzez endocytozę, po której białka powierzchniowe komórki są skutecznie sekw…
Znakowanie białek powierzchniowych komórek biotyną stanowi potężne narzędzie do badania szlaków transportu komórkowego zaangażowanych w regulację białek błonowych. Komórka utrzymuje ściśle regulowany zestaw białek na powierzchni, dzięki czemu może odbierać i reagować na informacje zewnątrzkomórkowe za pośrednictwem kilku ścieżek sygnałowych. Sugeruje się, że endocytoza, proces pochłaniania, bierze udział w regulacji tych białek powierzchniowych komórek, powodując ich internalizację. Dlatego znakowanie tych białek przed ich endocytozją środkami takimi jak biotyna pomaga naukowcom określić ilościowo ich internalizację i zbadać ich rolę w szlakach komórkowych.
W tym filmie omówimy zasady i metodologię testów biotynylacji na powierzchni komórki oraz zbadamy niektóre sposoby, w jakie naukowcy dostosowują tę metodę dzisiaj.
Przyjrzyjmy się najpierw zasadom stojącym za testem biotynylacji na powierzchni komórki.
Jak wspomniano wcześniej, komórki wykorzystują szlaki endocytarne do regulacji gęstości czasoprzestrzennej i dystrybucji białek powierzchniowych. Zinternalizowane białka są transportowane przez określone szlaki komórkowe, po których mogą być albo przetaczane do lizosomu w celu degradacji, albo zawracane z powrotem na powierzchnię komórki w celu kontynuowania aktywności. Biotynylacja powierzchni komórki ma na celu pomiar tych procesów.
Znacznik używany w tym teście, biotyna - znana również jako witamina H - jest małą, rozpuszczalną w wodzie cząsteczką. Powszechnie stosowaną pochodną biotyny do eksperymentów znakowania powierzchni jest sulfo-NHS-SS-biotyna, która składa się z grupy sulfo, grupy estrowej N-hydroksysukcynimidu, wiązania dwusiarczkowego i oczywiście biotyny. Uprość tę ogromną strukturę, zastępując biotynę literą "B."
Grupa sulfonowa w tej strukturze nadaje silny ładunek, który sprawia, że ta forma błony biotyny jest nieprzepuszczalna. Znakowanie białek powierzchniowych komórek odbywa się poprzez dodanie sulfo-NHS-SS-biotyny do komórek utrzymywanych w temperaturze ograniczającej endocytozę. Grupa NHS reaguje z aminami pierwszorzędowymi na białkach powierzchniowych, tworząc wiązania kowalencyjne.
Następnie znakowane komórki są przenoszone do temperatury pozwalającej na endocytozę, podczas której niektóre z znakowanych białek zostaną zinternalizowane. Na koniec komórki są przenoszone z powrotem do restrykcyjnej temperatury, aby zatrzymać endocytozę. W celu specyficznego ilościowego określenia zinternalizowanych białek dodaje się hydrofilowy, nieprzepuszczalny dla błony środek redukujący - taki jak L-glutation. Będzie to reagować z wiązaniami dwusiarczkowymi na nieendocytozowanej biotynie sulfo-NHS-SS i rozszczepiać grupy biotyny. W tym momencie pozostałe białka biotynylowane to te, których etykiety były chronione przed czynnikiem redukującym, ponieważ zostały wcześniej zinternalizowane.
Komórki są następnie poddawane lizie, a endocytozowane biotynylowane białka są izolowane w celu określenia ilościowego. Izolację przeprowadza się zwykle przez dodanie lizatów komórkowych do syntetycznych kulek pokrytych streptawidyną. Ponieważ streptawidyna ma niezwykle wysokie powinowactwo do biotyny, biotynylowane białka przyczepiają się do powlekanych kulek. Przeprowadza się szereg etapów płukania w celu usunięcia zanieczyszczających białek, a na koniec etap elucji w celu uwolnienia związanych białek. Białka docelowe mogą być następnie analizowane za pomocą technik takich jak Western blotting.
Ponieważ znasz już koncepcje stojące za testem biotynylacji, spójrzmy na uogólniony protokół pokazujący, jak wykonać tę procedurę w celu pomiaru endocytozy białek powierzchniowych.
Zacznij od hodowanych komórek schłodzonych do 4°C. Umieść je na lodzie, aby utrzymać temperaturę ograniczającą endocytozę. Następnie dodaje się nieprzepuszczalny dla błony odczynnik sulfo-NHS-SS-biotyny, a komórki inkubuje się w ciemności przez około 30 minut. Daje to wystarczająco dużo czasu, aby etykiety biotyny kowalencyjnie przyłączyły się do białek powierzchniowych. Komórki są następnie wyjmowane z lodu i inkubowane w temperaturze 37°C przez około 30 minut. W tej temperaturze biotynylowane białka powierzchniowe są endocytozyzowane. Po inkubacji komórki schładza się do temperatury 4°C i dodaje hydrofilowy środek redukujący, taki jak L-glutation. Reaguje to z wiązaniami dwusiarczkowymi i uwalnia grupy biotyny ze znakowanych, nieendocytozowanych białek.
Następnie komórki są poddawane lizie przez wirowanie, przerywając w ten sposób błony komórkowe i odsłaniając biotynylowane białka. Następnie lizaty są dodawane do kulek pokrytych streptawidyną, a biotynylowane białka mogą się wiązać. Kulki przemywa się zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i eluuje buforem zawierającym detergenty i środki redukujące. Odczynniki te denaturują związane białka z kulek i umożliwiają ich odzysk w eluacie. Białka w eluacie są rozdzielane na podstawie ich masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy żelowej. Wreszcie, Western blotting i sondowanie blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla białka pozwala na wizualizację docelowego białka. Procentową zawartość białka endocytozowanego można określić ilościowo na podstawie uzyskanych gęstości pasm.
Teraz, gdy rozumiesz metodologię biotynylacji komórek, przyjrzyjmy się, jak jest ona wykorzystywana w konkretnych eksperymentach.
Najczęstszym zastosowaniem tego protokołu biotynylacji jest pomiar szybkości endocytarnej określonych białek powierzchniowych komórek. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani oceną internalizacji transportera dopaminy lub DAT. Postępując zgodnie ze standardowym protokołem, naukowcy byli w stanie zmierzyć odsetek endocytozowanych DAT. Jest to reprezentatywna plama immunologiczna pokazująca linię T, odpowiadającą "całkowitej" ilości białka przed internalizacją, linia S jest przeznaczona dla "rozebranych" próbek, w których komórkom nigdy nie pozwolono przejść przez endocytozę, ale potraktowano środkiem redukującym, a pas I reprezentuje wyniki "zinternalizowanych" białek.
Oprócz samego pomiaru endocytozy białek powierzchniowych, naukowcy badają również wpływ leków na ten proces. W tym badaniu naukowcy ocenili gęstość powierzchniową DAT w odpowiedzi na leczenie aktywatorem kinazy białkowej C (PKC), którego działanie sugeruje indukowanie internalizacji DAT. Naukowcy potwierdzili to, dostosowując protokół biotynylacji in vitro do zastosowania w teście ex vivo na tkance mózgowej myszy. Dane wykazały około 30% utratę DAT z błony komórkowej w odpowiedzi na aktywację PKC.
Wreszcie, ulepszając test biotynylacji, naukowcy mogą również mierzyć recykling białek błonowych. Naukowcy badali białko kanału powierzchniowego, CFTR, odpowiedzialne za przewodzenie jonów chlorkowych. Aby ocenić recykling, naukowcy przeprowadzili standardowy protokół biotynylacji w jednej grupie komórek i zmodyfikowali protokół dla drugiej grupy komórek, dodając etapy po rozszczepieniu biotyny z nieendocytozowanych białek powierzchniowych. Te dodatkowe kroki obejmowały podniesienie temperatury z powrotem do 37°C, aby umożliwić recykling niektórych zinternalizowanych, znakowanych biotyną białek receptorowych. Obliczając różnicę między zinternalizowanymi białkami przed i po recyklingu, naukowcy byli w stanie określić ilościowo procent CFTR zawracanego z powrotem do membrany.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do testu biotynylacji na powierzchni komórki. Film opisywał etapy proceduralne tego testu i wyjaśniał reakcję zachodzącą na każdym etapie. Na koniec przeanalizowaliśmy kilka przykładowych eksperymentów, które wykazały możliwość zastosowania tej metody. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Znakowanie białek powierzchniowych komórek biotyną stanowi potężne narzędzie do badania szlaków transportu komórkowego zaangażowanych w regulację białek błonowych. Komórka utrzymuje ściśle regulowany zestaw białek na powierzchni, dzięki czemu może odbierać i reagować na informacje zewnątrzkomórkowe za pośrednictwem kilku ścieżek sygnałowych. Sugeruje się, że endocytoza, proces pochłaniania, bierze udział w regulacji tych białek powierzchniowych komórek, powodując ich internalizację. Dlatego znakowanie tych białek przed ich endocytozją środkami takimi jak biotyna pomaga naukowcom określić ilościowo ich internalizację i zbadać ich rolę w szlakach komórkowych.
W tym filmie omówimy zasady i metodologię testów biotynylacji na powierzchni komórki oraz zbadamy niektóre sposoby, w jakie naukowcy dostosowują tę metodę dzisiaj.
Przyjrzyjmy się najpierw zasadom stojącym za testem biotynylacji na powierzchni komórki.
Jak wspomniano wcześniej, komórki wykorzystują szlaki endocytarne do regulacji gęstości czasoprzestrzennej i dystrybucji białek powierzchniowych. Zinternalizowane białka są transportowane przez określone szlaki komórkowe, po których mogą być albo przetaczane do lizosomu w celu degradacji, albo zawracane z powrotem na powierzchnię komórki w celu kontynuowania aktywności. Biotynylacja powierzchni komórki ma na celu pomiar tych procesów.
Znacznik używany w tym teście, biotyna - znana również jako witamina H - jest małą, rozpuszczalną w wodzie cząsteczką. Powszechnie stosowaną pochodną biotyny do eksperymentów znakowania powierzchni jest sulfo-NHS-SS-biotyna, która składa się z grupy sulfo, grupy estrowej N-hydroksysukcynimidu, wiązania dwusiarczkowego i oczywiście biotyny. Uprość tę ogromną strukturę, zastępując biotynę literą "B."
Grupa sulfonowa w tej strukturze nadaje silny ładunek, który sprawia, że ta forma błony biotyny jest nieprzepuszczalna. Znakowanie białek powierzchniowych komórek odbywa się poprzez dodanie sulfo-NHS-SS-biotyny do komórek utrzymywanych w temperaturze ograniczającej endocytozę. Grupa NHS reaguje z aminami pierwszorzędowymi na białkach powierzchniowych, tworząc wiązania kowalencyjne.
Następnie znakowane komórki są przenoszone do temperatury pozwalającej na endocytozę, podczas której niektóre z znakowanych białek zostaną zinternalizowane. Na koniec komórki są przenoszone z powrotem do restrykcyjnej temperatury, aby zatrzymać endocytozę. W celu specyficznego ilościowego określenia zinternalizowanych białek dodaje się hydrofilowy, nieprzepuszczalny dla błony środek redukujący - taki jak L-glutation. Będzie to reagować z wiązaniami dwusiarczkowymi na nieendocytozowanej biotynie sulfo-NHS-SS i rozszczepiać grupy biotyny. W tym momencie pozostałe białka biotynylowane to te, których etykiety były chronione przed czynnikiem redukującym, ponieważ zostały wcześniej zinternalizowane.
Komórki są następnie poddawane lizie, a endocytozowane biotynylowane białka są izolowane w celu określenia ilościowego. Izolację przeprowadza się zwykle przez dodanie lizatów komórkowych do syntetycznych kulek pokrytych streptawidyną. Ponieważ streptawidyna ma niezwykle wysokie powinowactwo do biotyny, biotynylowane białka przyczepiają się do powlekanych kulek. Przeprowadza się szereg etapów płukania w celu usunięcia zanieczyszczających białek, a na koniec etap elucji w celu uwolnienia związanych białek. Białka docelowe mogą być następnie analizowane za pomocą technik takich jak Western blotting.
Ponieważ znasz już koncepcje stojące za testem biotynylacji, spójrzmy na uogólniony protokół pokazujący, jak wykonać tę procedurę w celu pomiaru endocytozy białek powierzchniowych.
Zacznij od hodowanych komórek schłodzonych do 4°C. Umieść je na lodzie, aby utrzymać temperaturę ograniczającą endocytozę. Następnie dodaje się nieprzepuszczalny dla błony odczynnik sulfo-NHS-SS-biotyny, a komórki inkubuje się w ciemności przez około 30 minut. Daje to wystarczająco dużo czasu, aby etykiety biotyny kowalencyjnie przyłączyły się do białek powierzchniowych. Komórki są następnie wyjmowane z lodu i inkubowane w temperaturze 37°C przez około 30 minut. W tej temperaturze biotynylowane białka powierzchniowe są endocytozyzowane. Po inkubacji komórki schładza się do temperatury 4°C i dodaje hydrofilowy środek redukujący, taki jak L-glutation. Reaguje to z wiązaniami dwusiarczkowymi i uwalnia grupy biotyny ze znakowanych, nieendocytozowanych białek.
Następnie komórki są poddawane lizie przez wirowanie, przerywając w ten sposób błony komórkowe i odsłaniając biotynylowane białka. Następnie lizaty są dodawane do kulek pokrytych streptawidyną, a biotynylowane białka mogą się wiązać. Kulki przemywa się zimnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem i eluuje buforem zawierającym detergenty i środki redukujące. Odczynniki te denaturują związane białka z kulek i umożliwiają ich odzysk w eluacie. Białka w eluacie są rozdzielane na podstawie ich masy cząsteczkowej za pomocą elektroforezy żelowej. Wreszcie, Western blotting i sondowanie blot za pomocą przeciwciał specyficznych dla białka pozwala na wizualizację docelowego białka. Procentową zawartość białka endocytozowanego można określić ilościowo na podstawie uzyskanych gęstości pasm.
Teraz, gdy rozumiesz metodologię biotynylacji komórek, przyjrzyjmy się, jak jest ona wykorzystywana w konkretnych eksperymentach.
Najczęstszym zastosowaniem tego protokołu biotynylacji jest pomiar szybkości endocytarnej określonych białek powierzchniowych komórek. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani oceną internalizacji transportera dopaminy lub DAT. Postępując zgodnie ze standardowym protokołem, naukowcy byli w stanie zmierzyć odsetek endocytozowanych DAT. Jest to reprezentatywna plama immunologiczna pokazująca linię T, odpowiadającą "całkowitej" ilości białka przed internalizacją, linia S jest przeznaczona dla "rozebranych" próbek, w których komórkom nigdy nie pozwolono przejść przez endocytozę, ale potraktowano środkiem redukującym, a pas I reprezentuje wyniki "zinternalizowanych" białek.
Oprócz samego pomiaru endocytozy białek powierzchniowych, naukowcy badają również wpływ leków na ten proces. W tym badaniu naukowcy ocenili gęstość powierzchniową DAT w odpowiedzi na leczenie aktywatorem kinazy białkowej C (PKC), którego działanie sugeruje indukowanie internalizacji DAT. Naukowcy potwierdzili to, dostosowując protokół biotynylacji in vitro do zastosowania w teście ex vivo na tkance mózgowej myszy. Dane wykazały około 30% utratę DAT z błony komórkowej w odpowiedzi na aktywację PKC.
Wreszcie, ulepszając test biotynylacji, naukowcy mogą również mierzyć recykling białek błonowych. Naukowcy badali białko kanału powierzchniowego, CFTR, odpowiedzialne za przewodzenie jonów chlorkowych. Aby ocenić recykling, naukowcy przeprowadzili standardowy protokół biotynylacji w jednej grupie komórek i zmodyfikowali protokół dla drugiej grupy komórek, dodając etapy po rozszczepieniu biotyny z nieendocytozowanych białek powierzchniowych. Te dodatkowe kroki obejmowały podniesienie temperatury z powrotem do 37°C, aby umożliwić recykling niektórych zinternalizowanych, znakowanych biotyną białek receptorowych. Obliczając różnicę między zinternalizowanymi białkami przed i po recyklingu, naukowcy byli w stanie określić ilościowo procent CFTR zawracanego z powrotem do membrany.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do testu biotynylacji na powierzchni komórki. Film opisywał etapy proceduralne tego testu i wyjaśniał reakcję zachodzącą na każdym etapie. Na koniec przeanalizowaliśmy kilka przykładowych eksperymentów, które wykazały możliwość zastosowania tej metody. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Q1: What is biotin and why is it used in cell-surface labeling experiments?
Biotin, also known as vitamin H, is a small, water-soluble molecule ideal for labeling cell surface proteins. The sulfo-NHS-SS-biotin derivative used in these assays contains a sulfo group that imparts strong charge, making it membrane impermeant so it labels only surface proteins. This allows scientists to track protein internalization without the label entering the cell prematurely.
Q2: How does temperature control regulate the biotinylation assay protocol?
The assay uses temperature shifts to control endocytosis timing. Cells are maintained at 4°C, a restrictive temperature preventing endocytosis, during initial biotin labeling. They are then moved to 37°C, a permissive temperature allowing endocytosis of labeled proteins. Finally, cells return to 4°C to halt endocytosis, ensuring precise measurement of internalized proteins during the defined window.
Q3: What role does L-glutathione play in distinguishing internalized from surface proteins?
L-glutathione is a hydrophilic, membrane-impermeant reducing agent that cleaves disulfide bonds on the biotin label. It removes biotin from unendocytosed surface proteins but cannot penetrate the cell membrane to reach internalized proteins. This selective cleavage leaves only biotinylated proteins that were protected inside the cell, enabling quantification of internalized proteins.
Q4: How are biotinylated proteins isolated and identified in the cell-surface biotinylation assay?
After cell lysis, biotinylated proteins are isolated using streptavidin-coated beads, which bind biotin with extremely high affinity. Following washing steps to remove contaminants, proteins are eluted using detergents and reducing agents. The recovered proteins are then separated by gel electrophoresis and analyzed using Western blotting with protein-specific antibodies for visualization and quantification.
Q5: What can scientists learn by measuring dopamine transporter endocytosis using biotinylation?
By applying the cell-surface biotinylation assay to dopamine transporter (DAT), scientists can quantify the percentage of DAT proteins internalized from the cell membrane. This measurement reveals how cells regulate neurotransmitter transporter availability and can show how drugs like protein kinase C activators affect transporter internalization, providing insights into cellular signaling and drug responses.
Q6: How can the biotinylation assay be modified to measure protein recycling?
To measure recycling, researchers perform the standard biotinylation protocol, then add steps after cleaving biotin from unendocytosed surface proteins. They raise temperature back to 37°C to allow internalized, biotin-tagged proteins to recycle back to the membrane. By comparing internalized protein amounts before and after recycling, scientists quantify the percentage of proteins recycled, as demonstrated with CFTR channel protein studies.
Q7: Why is the cell-surface biotinylation assay important for studying endocytosis and exocytosis pathways?
The biotinylation assay directly measures how cells regulate surface protein density through an introduction to endocytosis and exocytosis mechanisms. By tracking labeled proteins through internalization, degradation, and recycling pathways, scientists can quantify the spatiotemporal distribution of membrane proteins and understand how cells respond to extracellular signals and regulate cellular transport processes.
Videos from this collection: