Name: Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED do mapowania tras transportu białek w żywych pierwotnych rzęskach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek w komórkach NIH-3T3 z rozdzielczością subdyfrakcyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy dr Kristen Verhey (University of Michigan, Ann Arbor) i dr Gregory'emu Pazourowi (University of Massachusetts Medical School) za dostarczenie plazmidów. Projekt został wsparty grantami z National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 i GM122552 do W.Y.).

1. Przygotowanie komórek NIH-3T3 do mikroskopii SPEED ze stocku
<ol>
	<li>1,5 tygodnia przed eksperymentem odzyskać świeżą kulturę komórek NIH-3T3 z zamrożonego materiału podstawowego poprzez rozmrożenie w temperaturze 37 °C i przeniesienie komórek do kolby do hodowli komórkowej o średnicy 25 cm z 3 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 110 mg/ml pirogronianu sodu, 2 mM glutaminy, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% penicyliny/streptomycyny.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .</li>
	<li>Podziel komórki przy 80% zbieganiu, mniej więcej co dwa dni, co najmniej trzy razy przed dniem eksperymentalnym, aby zapewnić jednorodność cyklu komórkowego. Trypsynizować komórki 0,25% trypsyny przez 2 minuty w temperaturze 37 °C, odessać trypsynę i zastąpić ją 2 ml pożywki. Kilkakrotnie pipetować pożywkę, aby rozbić skupiska komórek, usunąć żądaną liczbę komórek i przywrócić całkowitą objętość pożywki do 3 ml. 
	UWAGA: NIH-3T3 zostały wcześniej genetycznie zmodyfikowane do ekspresji NPHP-4, białka, które lokalizuje się w klasie TZ26, połączonej na końcu C do mCherry. mCherry to fluorofor, który może być wzbudzony oświetleniem o długości fali 561 nm w celu ilościowego zlokalizowania bariery selektywności TZ i zorientowania rzęsek pierwotnych.</li>
	<li>Dwa dni przed eksperymentem umieść komórki w szklanym naczyniu o średnicy 35 mm przy 60-70% zbiegu z 1,5 ml tej samej pożywki, co w kroku 1,1 i włóż komórki z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Na dzień przed eksperymentem należy dokonać chemicznej transfekcji komórek pożądanym plazmidem. Zmieszać 500 - 1000 ng pożądanego plazmidu (patrz uwaga poniżej) w stosunku 1:2,5 z odczynnikiem do transfekcji w 0,25 ml zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków przez 30 min. Odessać pożywkę z naczynia o szklanym dnie 35 mm i zastąpić ją mieszanką 0,25 ml plazmidu/odczynnika do transfekcji oraz dodatkowymi 1,25 ml zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków. Zredukowana pożywka surowicy służy do ułatwiania udanej transfekcji, indukowania pierwotnego wzrostu rzęsek, a także utrzymywania komórek przy życiu wystarczająco długo, aby można było przeprowadzić eksperyment. Następnego dnia należy zwrócić komórki do inkubatora w celu przeprowadzenia eksperymentu. 
	UWAGA: Podczas śledzenia pojedynczej cząsteczki IFT20 używany jest plazmid zawierający genetycznie zmodyfikowany IFT20 połączony na swoim końcu C z GFP25. Podczas śledzenia pojedynczej cząsteczki SSTR3 używany jest plazmid zawierający genetycznie zmodyfikowany SSTR3 połączony na swoim końcu N z domeną peptydu akceptorowego (AP) i końcem C z GFP22. Oprócz konstruktu SSTR3 plazmid zawierający ligazę biotyny BirA musi ulec koekspresji, a pożywka transfekcyjna musi zostać uzupełniona biotyną o stężeniu 10 μM. Następnie BirA przyłącza biotynę do domeny AP nowo zsyntetyzowanych cząsteczek AP-SSTR3-GFP na poziomie ER. Alexa647 sprzężona z trzema z czterech miejsc wiązania biotyny na streptawidynie, średnio, może być następnie uzupełniona do pożywki przed obrazowaniem w celu fluorescencyjnego znakowania cząsteczek AP-SSTR3-GFP na zewnętrznej powierzchni komórki22, 27. W tej metodzie stosuje się GFP i AlexaFluor647; Jednak inne sondy fluorescencyjne mogą być używane, jeśli mają podobnie wysoką fotostabilność i wydajność kwantową.</li>
	<li>W przypadku stosowania zewnętrznie znakowanego konstruktu SSTR3, wyjmij pożywkę ze szklanego naczynia na 1 godzinę przed eksperymentem, przemyj komórkę 5 razy 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i dodaj 1 ml zredukowanej pożywki surowicy uzupełnionej 1 μM Alexa647 sprzężoną streptawidyną.</li>
	<li>Nie więcej niż 15 minut przed eksperymentem wyjmij pożywkę z naczynia ze szklanym dnem i umyj transfekowane i oznakowane komórki 5 razy 1 ml PBS.</li>
	<li>Umieścić 1 ml buforu do obrazowania (20 mM HEPES, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA, pH 7,3) w naczyniu ze szklanym dnem. 
	UWAGA: W buforze obrazowania komórki są żywotne nie dłużej niż 3 godziny. Dlatego na każdym daniu przeprowadza się tylko 2 godziny eksperymentów.</li>
</ol>
2. Mikroskopia SPEED
Uwaga: Zestaw mikroskopii SPEED obejmuje odwrócony mikroskop fluorescencyjny wyposażony w apochromatyczny obiektyw 1,4-NA 100× zanurzeniowy w oleju, laser He-Ne o długości fali 35 mW 633 nm, lasery półprzewodnikowe 488 nm i 561 nm o mocy 50 mW, kamerę z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem oraz pakiet oprogramowania mikroskopowego do akwizycji i przetwarzania danych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W przypadku obrazowania poszczególnych kanałów GFP, mCherry i Alexa647 są wzbudzane odpowiednio przez lasery 488 nm, 561 nm lub 633 nm. Do śledzenia pojedynczych cząsteczek stosuje się oświetlenie jednopunktowe do śledzenia pojedynczych cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie. W przypadku obrazowania epifluorescencyjnego wklęsła soczewka jest umieszczana na ścieżce oświetlenia laserowego, aby rozszerzyć wiązkę do jednolitego pola oświetlenia. Emisje fluorescencji są zbierane przez ten sam obiektyw, filtrowane przez filtr dichroiczny (405/488/561/635) i filtr emisyjny (405/488/561/635) i obrazowane za pomocą powyższej kamery CCD działającej z częstotliwością 500 Hz dla śledzenia pojedynczej cząsteczki lub 2 Hz dla obrazowania epifluorescencyjnego.
<ol>
	<li>Przymocuj szklaną płytkę dolną do stolika mikroskopu i zlokalizuj komórkę, która prawidłowo wyraża pożądane konstrukty. Po znalezieniu odpowiedniej komórki wyrównaj plamkę NPHP4-mCherry u podstawy rzęsek pierwotnych z miejscem na płaszczyźnie obrazowania, które odpowiada jednopunktowemu oświetleniu lasera.</li>
	<li>Przechwyć obraz epifluorescencji NPHP4-mCherry i IFT20-GFP lub AP-SSTR3-GFP za pomocą funkcji "Snap" w zakładce "Kamera" w oknie "Kontrola ostrości", jeśli korzystasz z pakietu oprogramowania do mikroskopii cyfrowej (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Obrazy te będą działać jako odniesienie dla kolejnych lokalizacji pojedynczych cząsteczek.</li>
	<li>Po uzyskaniu obrazów referencyjnych należy lokalnie zmniejszyć stężenie znakowanych pojedynczych cząsteczek. Wybielanie fotograficzne TZ za pomocą oświetlenia laserowego o mocy 1 mW przez 20 s lub do momentu, gdy intensywność fluorescencji będzie zbliżona do intensywności fluorescencji tła. 
	UWAGA: Gdy można kontrolować dokładne stężenie, stosuje się pojedyncze cząsteczki znakowane 0,1-1 nM.</li>
	<li>Aby przygotować się do śledzenia pojedynczych cząsteczek, zmniejsz moc oświetlenia lasera do ~0,15 mW dla pojedynczych cząsteczek znakowanych GFP lub ~0,5 mW dla cząsteczek znakowanych Alexa647.</li>
	<li>Jak tylko moc lasera i parametry obrazowania zostaną ustawione, maksymalne wzmocnienie i intensyfikacja oraz częstotliwość odświeżania 2 ms, w przypadku obrazowania pojedynczej cząsteczki włącz odpowiedni laser oświetleniowy i zarejestruj niefotobielone, znakowane pojedyncze cząsteczki, gdy są transportowane przez fotowybielany obszar TZ, klikając przycisk "Strumień" w zakładce "Kamera" w oknie "Sterowanie ostrością". 
UWAGA: Nie należy nagrywać więcej niż 2 minuty filmu, aby zminimalizować skutki dryfu rzęsek do znikomego poziomu.</li>
	<li>Po przechwyceniu filmu z pojedynczą cząsteczką, przetwórz filmy za pomocą algorytmu dopasowania Gaussa 2D, takiego jak Glimpse firmy Gelles Lab, który precyzyjnie lokalizuje środek ciężkości wzbudzenia PSF każdej pojedynczej cząsteczki w obszarze zainteresowania (AOI).</li>
	<li>Zaznacz wszystkie lokalizacje pojedynczych cząsteczek z precyzją <10 nm i skoryguj środek rzęsek na podstawie rozkładu lokalizacji pojedynczych cząsteczek wyposażonych w funkcję Gaussa 2D. 
	UWAGA: Dzięki zastosowaniu algorytmu transformacji 2D do 3D, trasy transportowe 3D tras IFT20-GFP i AP-SSTR3 są wyraźnie pokazane odpowiednio na błonie rzęskowej aksonemalnej lub rzęskowej.</li>
</ol>
3. Transformacja 2D do 3D
<ol>
	<li>Po zebraniu kilku tysięcy lokalizacji cząsteczek tranzytujących (stosunek sygnału do szumu > 11) w rzęsce, wybierz długą oś rzęski jako wymiar X. Wykonaj histogram wymiaru Y lokalizacji i uzyskaj sumy przedziałów w krokach co 10 nm. 
	UWAGA: Transformacja 2D do 3D może być oceniana ręcznie lub za pomocą dowolnego oprogramowania lub języka programowania. Autorzy z powodzeniem zaimplementowali transformację zarówno w Matlabie, jak i w Pythonie 2.7.</li>
</ol>

<ol><li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li>
<li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li>
<li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440, 935-939 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li>
<li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li>
<li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li>
<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Akey, C. W., Radermacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+Xenopus+nuclear+pore+complex+revealed+by+three-dimensional+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Architecture of the Xenopus nuclear pore complex revealed by three-dimensional cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 122, 1-19 (1993).</li>
<li>Akey, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+and+structure+of+the+nuclear+pore+complex+revealed+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions and structure of the nuclear pore complex revealed by cryo-electron microscopy.</a> J Cell Biol. 109, 955-970 (1989).</li>
<li>Czarnecki, P. G., Shah, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+transition+zone%3A+from+morphology+and+molecules+to+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The ciliary transition zone: from morphology and molecules to medicine.</a> Trends Cell Biol. 22, 201-210 (2012).</li>
<li>Elf, J., Li, G. -W., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+transcription+factor+dynamics+at+the+single-molecule+level+in+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing transcription factor dynamics at the single-molecule level in a living cell.</a> Science. 316, 1191-1194 (2007).</li>
<li>Anzalone, A., Annibale, P., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+orbital+tracking+in+a+modified+two-photon+microscope%3A+an+application+to+the+tracking+of+intracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">3D orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitscheck, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PloS one. 5, 11639(2010).</li>
<li>Marshall, W. F., Nonaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia%3A+tuning+in+to+the+cell%27s+antenna%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia: tuning in to the cell's antenna.</a> Curr Biol. 16, 604-614 (2006).</li>
<li>Scholey, J. M., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraflagellar+transport+and+cilium-based+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intraflagellar transport and cilium-based signaling.</a> Cell. 125, 439-442 (2006).</li>
<li>Yang, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+pattern+recognition+reveals+the+architectural+map+of+the+ciliary+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Superresolution pattern recognition reveals the architectural map of the ciliary transition zone.</a> Sci Rep. 5, 14096(2015).</li>
<li>Craige, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEP290+tethers+flagellar+transition+zone+microtubules+to+the+membrane+and+regulates+flagellar+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CEP290 tethers flagellar transition zone microtubules to the membrane and regulates flagellar protein content.</a> J Cell Biol. 190, 927-940 (2010).</li>
<li>Kee, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+size-exclusion+permeability+barrier+and+nucleoporins+characterize+a+ciliary+pore+complex+that+regulates+transport+into+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A size-exclusion permeability barrier and nucleoporins characterize a ciliary pore complex that regulates transport into cilia.</a> Nat Cell Biol. 14, 431-437 (2012).</li>
<li>Najafi, M., Maza, N. A., Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steric+volume+exclusion+sets+soluble+protein+concentrations+in+photoreceptor+sensory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Steric volume exclusion sets soluble protein concentrations in photoreceptor sensory cilia.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 203-208 (2012).</li>
<li>Nachury, M. V., Seeley, E. S., Jin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+to+the+ciliary+membrane%3A+how+to+get+across+the+periciliary+diffusion+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Trafficking to the ciliary membrane: how to get across the periciliary diffusion barrier.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 59-87 (2010).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+imaging+reveals+a+major+role+for+diffusion+in+the+exploration+of+ciliary+space+by+signaling+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single molecule imaging reveals a major role for diffusion in the exploration of ciliary space by signaling receptors.</a> Elife. 2, 00654(2013).</li>
<li>Ross, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genetics%22%5BJournal%5D)">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li>
<li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li>
<li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li>
<li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li>
<li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikroskopii SPEED do badania rzęski pierwotnej, organelli sygnałowej komórki, która w dużym stopniu polega na wydajnym transporcie białek. Mikroskopia SPEED umożliwia wyznaczenie lokalizacji cząsteczek znakowanych fluorescencyjnie z wysoką rozdzielczością (&lt; 10 nm) w momencie, gdy przechodzą one przez punkt oświetlenia skoncentrowany na strefie przejścia (TZ). Wcześniej metoda ta była stosowana do badania transportu białek przez kompleks porowy jądra komórkowego (NPC)<sup class=...

Od czasu sformułowania tej tezy przez Ernsta Abbego w 1873 roku uważano, że rozdzielczość konwencjonalnej mikroskopii świetlnej jest ograniczona do około 200 nm ze względu na dyfrakcję światła w obiektywie1,2. Obecnie techniki mikroskopii świetlnej o superrozdzielczości przełamują to ograniczenie i pozwalają na rejestrowanie dynamicznych obrazów z rozdzielczością poniżej limitu dyfrakcyjnego (&#60; 200 nm). Techniki te dzielą się zazwyczaj na dwie szerokie kategorie: podejścia oparte na mikroskopii z wygaszaniem emisji stymulowanej (STED), które generują objętość oświetlenia poniżej limitu dyfrakcyjnego dzięki nieliniowej odpowiedzi optycznej fluoroforów w próbkach3; oraz techniki superrozdzielczości oparte na mikroskopii fotoaktywowanej (PALM) i stochastycznej optycznej rekonstrukcji mikroskopowej (STORM), które wykorzystują funkcje matematyczne do lokalizacji centroidów fluoroforów, a następnie rekonstruują te centroidy w celu utworzenia obrazów o superrozdzielczości4,5. Obecnie, ze względu na stosunkowo prostą konfigurację optyczną, PALM i STORM są szeroko stosowane poprzez aktywację jedynie niewielkiej podgrupy fluoroforów w każdej klatce długiego nagrania wideo preparatu biologicznego. Pozwala to na dokładniejszą lokalizację białek znakowanych fluorescencyjnie w każdej klatce wideo poprzez dwuwymiarowe dopasowanie funkcji Gaussa do plamki fluorescencyjnej, określanej jako funkcja rozproszenia punktu (PSF). Dwuwymiarowa lokalizacja każdej cząsteczki znakowanej fluorescencyjnie może być następnie nałożona na jedną płaszczyznę obrazowania, aby uzyskać obraz o superrozdzielczości preparatu biologicznego1,2. Chociaż te podejścia do mikroskopii oparte na lokalizacji pojedynczych cząsteczek i superrozdzielczości z pewnością zrewolucjonizowały sposób obrazowania próbek biologicznych, wciąż istnieją wyzwania do pokonania. Na przykład STORM i PALM osiągają najlepszą rozdzielczość przestrzenną po utrwaleniu próbek biologicznych, a zatem przedstawiają statyczny obraz białek znakowanych fluorescencyjnie, co jest ograniczeniem podobnym do tego w mikroskopii elektronowej. Dodatkowo, aby uzyskać wysoką rozdzielczość przestrzenną dla każdego białka znakowanego fluorescencyjnie w żywych komórkach, próbki muszą być obrazowane z bardzo niską częstotliwością klatek, co uniemożliwia rejestrację dynamiki białek. Dlatego konieczne jest pokonanie tych głównych przeszkód technicznych.
Aby uzyskać wysoką rozdzielczość czasowo-przestrzenną, która jest odpowiednia do wykrywania szybko poruszających się białek lub RNA w żywych komórkach, opracowaliśmy w naszym laboratorium mikroskopię superrozdzielczą SPEED (Rysunek 1)6,7,8. Kilka głównych postępów technicznych w mikroskopii SPEED umożliwiło nam wcześniej pomyślne śledzenie transportu nukleocytoplazmatycznego małych cząsteczek, białek, mRNA i wirusów przez rodzime kompleksy porów jądrowych (NPC)6,7,8. W skrócie, następujące cechy mikroskopii SPEED będą wykorzystywane do śledzenia szybko poruszających się makrocząsteczek przez submikrometrowe struktury symetryczne obrotowo w żywych komórkach, takie jak NPC i rzęski pierwotne: (1) Pochyła lub pionowa PSF oświetlenia umożliwia wzbudzenie pojedynczych cząsteczek w niewielkiej objętości ograniczonej dyfrakcją w płaszczyźnie ogniskowania (Rysunek 1); (2) Pochyła PSF pozwala w znacznym stopniu uniknąć fluorescencji poza ogniskiem, a tym samym poprawić stosunek sygnału do szumu. (3) Gęstość optyczna rzędu 100-500 kW/cm2 w PSF oświetlenia pozwala na zebranie tysięcy fotonów z pojedynczych fluoroforów przy szybkich prędkościach detekcji (&gt; 500 Hz). (4) Szybka prędkość detekcji znacznie redukuje również błąd lokalizacji przestrzennej pojedynczych cząsteczek (&lt; 10 nm) przy wyznaczaniu trajektorii przestrzennych ruchomych cząsteczek fluorescencyjnych w żywych komórkach, ponieważ dyfuzja molekularna jest jednym z głównych czynników powodujących niedoskonałości lokalizacji pojedynczych ruchomych cząsteczek. (5) Dobrze opracowane algorytmy transformacji 2D na 3D pozwalają nam tworzyć trójwymiarowe mapy gęstości prawdopodobieństwa przestrzennego szlaków transportu cząsteczek w NPC lub rzęsce pierwotnej. Warto zauważyć, że nasz proces konwersji między układem współrzędnych kartezjańskich a cylindrycznymi jest wykorzystywany do generowania 3D mapy gęstości prawdopodobieństwa przestrzennego, a nie do 3D śledzenia pojedynczych cząsteczek (Rysunek 2). Wcześniej dane z mikroskopii elektronowej ujawniły, że zarówno NPC9,10, jak i rzęska pierwotna11 posiadają strukturę symetryczną obrotowo. W zasadzie losowo dyfundujące cząsteczki poruszające się przez NPC lub rzęskę pierwotną powinny również wykazywać rozkłady symetryczne obrotowo. Jak pokazano na Rysunku 2, duża liczba losowo dyfundujących cząsteczek wewnątrz cylindra generowałaby rozkłady symetryczne obrotowo w przekroju poprzecznym, podobnie jak w przypadku NPC, co w konsekwencji prowadziłoby do w przybliżeniu jednorodnego rozkładu przestrzennego w każdym bardzo małym podregionie między dwoma sąsiadującymi pierścieniami (Rysunek 2E). Taki jednorodny rozkład sprawia, że rozkład przestrzenny wzdłuż wymiaru θ w układzie cylindrycznym jest stały. Wówczas współrzędne 3D (R, X, θ) można uprościć do współrzędnych 2D (R, X, stała). W rzeczywistości nasz proces konwersji między układem kartezjańskim a cylindrycznym przebiega z 2D (X, Y) na 2D (R, X, stała). Stała wartość θ, odnosząca się do gęstości przestrzennej p na Rysunku 2E, jest obliczana przy użyciu równania A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg" />.
W ostatecznym rozrachunku śledzenie pojedynczych cząsteczek znajduje szerokie zastosowanie w badaniach biologicznych, zatem naturalne jest, że opracowano wiele technik, aby wypełnić specyficzne nisze biologiczne12,13,14. Tak jest w przypadku mikroskopii SPEED. Wcześniej technika ta, w połączeniu z algorytmem transformacji 3D, została opracowana w celu rozdzielenia trójwymiarowych dróg transportu cząsteczek przechodzących przez NPC, czyli struktury biologiczne o rozmiarach poniżej limitu dyfrakcyjnego i symetrii obrotowej6. W niniejszej pracy wykazano, że rzęski pierwotne również stanowią doskonałe organella modelowe. Rzęski pierwotne to cylindryczne, przypominające anteny organella (promień ~125 nm), które wystają z powierzchni większości komórek ssaków15,16,17. Są one odpowiedzialne za odbieranie sygnałów zewnętrznych i przekazywanie odpowiedzi wewnątrzkomórkowej, zazwyczaj związanej z wzrostem i metabolizmem15,16. Zatem przepływ białek strukturalnych, recykling receptorów transbłonowych oraz przekazywanie posłańców wewnątrzkomórkowych są kluczowymi funkcjami rzęsek pierwotnych. Na styku między rzęską pierwotną a ciałem komórki znajduje się krytyczna bariera selektywności, nazywana strefą przejścia lub TZ, przez którą musi odbywać się cały ten transport białek11,18,19,20. Oprócz funkcji bramkującej TZ, uważa się, że za ruch białek przez ten obszar odpowiadają co najmniej dwa procesy transportowe: transport wewnątrzflagellarny oraz dyfuzja pasywna16,21,22. Z punktu widzenia zdrowia człowieka utrata rzęsek pierwotnych i następująca po niej deregulacja sygnalizacji downstream jest charakterystyczna dla wielu nowotworów. Ponadto wiele chorób genetycznych, takich jak zespół Bardeta-Biedla i wielotorbielowatość nerek, wiąże się z wadliwym transportem białek23. Zarówno rozmiar poniżej limitu dyfrakcyjnego, jak i złożony proces selektywnego transportu białek przez TZ sprawiają, że rzęski pierwotne są głównym celem dla tej techniki. W niniejszej pracy metodologicznej zademonstrujemy śledzenie rzęskowego białka transbłonowego, receptora somatostatyny 3 (SSTR3)24, znakowanego zewnętrznie Alexa Fluor 647, oraz komponentu IFT, białka IFT2025, znakowanego za pomocą fuzji z cząsteczką GFP.

<table><tbody><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 25 cm2</td><td>Corning</td><td>VV-01936-00</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>ThermoFisher</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>Transit LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szklana naczynie dolne</td><td>MatTek</td><td>P35GCOL-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647-sprzężona streptawidyna</td><td>ThermoFisher</td><td>S21374</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501-100MG</td><td></td></tr><tr><td>633 nm Laser He-Ne</td><td>Melles Griot</td><td>25-LHP-928-249</td><td></td></tr><tr><td>Laser półprzewodnikowy 561 nm</td><td>Coherent</td><td>OBIS 561-50 LS</td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser półprzewodnikowy</td><td>Coherent</td><td>1185053</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>1,4-NA 100 i razy; obiektyw apochromatyczny zanurzeniowy w oleju</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 100 i razy;</td><td></td></tr><tr><td>Wbudowana kamera ze sprzężeniem ładowania ze wzmocnieniem zwielokrotnienia</td><td>Roper</td><td>Scientific Cascade 128 +</td><td></td></tr> <tr><td>filtr dichroiczny</td><td>Semrock</td><td>Di01- R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtr emisyjny</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/561/635-25X5.0</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6.0</td><td>Intelligent Imaging Innovations</td><td></td><td>oprogramowanie do mikroskopii cyfrowej</td></tr></tbody></table>

zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej speed w żywej rzęsce pierwotnej

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Rzęska pierwotna jest wypukłością opartą na mikrotubulach na powierzchni wielu komórek eukariotycznych i zawiera unikalny zestaw białek, które pełnią kluczową rolę w ruchliwości komórek i sygnalizacji. Ponieważ rzęski nie są zdolne do syntezy własnego białka, prawie 200 unikalnych białek rzęskowych musi być transportowanych między cytozolem a rzęskami pierwotnymi. Jednak mapowanie trójwymiarowych (3D) lokalizacji szlaków transportu tych białek w żywych rzęskach pierwotnych nadal stanowi wyzwanie techniczne ze względu na ograniczenia obecnie istniejących technik. Aby sprostać temu wyzwaniu, niedawno opracowaliśmy i zastosowaliśmy szybką wirtualną mikroskopię 3D o wysokiej rozdzielczości, zwaną jednopunktową mikroskopią subdyfrakcyjną wzbudzenia krawędziowego (SPEED), w celu określenia przestrzennej lokalizacji 3D szlaków transportowych zarówno dla białek cytozolowych, jak i błonowych w pierwotnych rzęskach żywych komórek. W tym artykule zademonstrujemy szczegółową konfigurację mikroskopii SPEED, przygotowanie komórek wyrażających białka rzęskowe znakowane białkiem fluorescencyjnym, śledzenie pojedynczych cząsteczek pojedynczych białek w żywej rzęsce w czasie rzeczywistym oraz osiągnięcie przestrzennych map gęstości prawdopodobieństwa 3D tras transportu białek rzęskowych.

W tej sekcji zaprezentowano dane uzyskane podczas wykonywania mikroskopii SPEED w obrębie TZ (strefy przejścia) rzęsek pierwotnych w celu zbadania drogi transportu białka SSTR3, połączonego łącznikiem zewnętrznym o długości ~15 nm z Alexa647 (Rysunek 3A). Służy to podwójnemu celowi: weryfikacji algorytmu transformacji 3D oraz potwierdzeniu lokalizacji. Alexa647 powinna znakować wyłącznie zewnętrzną powierzchnię rzęski pierwotnej, zatem trójwy...

Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest identyfikacja dróg transportu białek w rzęskach pierwotnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rzęsek, takie jak różnice w trasie transportu białek w normalnych i dysfunkcyjnych rzęskach. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby zobaczyć drogi transportu białek subdyfrakcyjnych w żywych komórkach.Na początek rozmrozić zamrożony zapas specjalnie zaprojektowanych komórek NIH-3T3 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, półtora tygodnia przed eksperymentem. Przenieś rozmrożone komórki do kolby z hodowlą komórkową o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych zawierającej trzy mililitry wstępnie podgrzanej pożywki. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.Hoduj komórki, aż osiągną 80% zbieżności, a następnie podziel komórki. Aby podzielić komórki, trypsynizuj je 0,25% trypsyny przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po krótkiej inkubacji odessać trypsynę i zastąpić ją dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.Odpipetować pożywkę, aby rozbić wszelkie skupiska komórek, a następnie usunąć 75% komórek z kolby i pr

application-high-speed-super-resolution-speed-microscopy-live-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

W tym badaniu, szczegółowa technika mikroskopii świetlnej została zoptymalizowana do obserwacji i analizy ruchu rzęsek CPEC w czasie rzeczywistym ex vivo wraz z metodą mikroskopii elektronowej do analizy ultrastrukturalnej.

Obserwacja ruchu rzęsek komórek nabłonka splotu naczyniówkowego ex vivo

Pierwotne rzęski to struktury zewnątrzkomórkowe związane z centriolem. Pierwotne wykrywanie rzęsek za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego jest stosunkowo prostą procedurą, która pozwala uzyskać obrazy o niezwykle wysokiej jakości. W tym protokole fibroblasty wyrażające rzęski pierwotne zostały utrwalone, wybarwione immunologicznie i zobrazowane w mikroskopie fluorescencyjnym lub konfokalnym.

Proste wykrywanie rzęsek pierwotnych za pomocą immunofluorescencji

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj prezentujemy powtarzalny protokół elektroporacji in vitro do manipulacji genetycznej pierwotnych prekursorów komórek ziarnistych móżdżku (GCP), który jest opłacalny, wydajny i opłacalny. Co więcej, protokół ten demonstruje również prostą metodę badania molekularnego pierwotnych szlaków sygnałowych Hedgehog zależnych od rzęsek w pierwotnych komórkach GCP.

Wydajna i ekonomiczna metoda elektroporacji do badania pierwotnych szlaków sygnałowych zależnych od rzęsek w prekursorze komórek ziarnistych

Szybka analiza mikroskopii wideo jest stosunkowo łatwym do przeprowadzenia, szybkim, opłacalnym i, w doświadczonych rękach, znacznie niezawodnym narzędziem do diagnostyki pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek, które powinno być dostępne w każdym ośrodku zajmującym się diagnostyką i leczeniem ciężkich chorób płuc.

Szybka analiza wideomikroskopii w diagnostyce pierwszego rzutu pierwotnej dyskinezy rzęsek

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Ta metoda opisuje wykorzystanie endogennego sygnału w transgenicznym modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2 do obrazowania pierwotnych rzęsek in situ, w trzech wymiarach na dużych obszarach zmineralizowanej tkanki, od pobrania tkanki do analizy organizacji rzęsek. Protokół ten może być również stosowany do innych rodzajów tkanek.

Obrazowanie wolumetryczne i analiza rzęsek pierwotnych w tkance mięśniowo-szkieletowej przy użyciu modelu myszy ARL13B-CENTRIN-2

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj metodę szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED do mapowania tras transportu białek w żywych pierwotnych rzęskach. Technika ta umożliwia badanie dynamiki białek w komórkach NIH-3T3 z rozdzielczością subdyfrakcyjną.

Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej

Przeglądaj więcej filmów