Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej
January 16th, 2018
Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest identyfikacja dróg transportu białek w rzęskach pierwotnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rzęsek, takie jak różnice w trasie transportu białek w normalnych i dysfunkcyjnych rzęskach. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby zobaczyć drogi transportu białek subdyfrakcyjnych w żywych komórkach.
Na początek rozmrozić zamrożony zapas specjalnie zaprojektowanych komórek NIH-3T3 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, półtora tygodnia przed eksperymentem. Przenieś rozmrożone komórki do kolby z hodowlą komórkową o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych zawierającej trzy mililitry wstępnie podgrzanej pożywki. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
Hoduj komórki, aż osiągną 80% zbieżności, a następnie podziel komórki. Aby podzielić komórki, trypsynizuj je 0,25% trypsyny przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po krótkiej inkubacji odessać trypsynę i zastąpić ją dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
Odpipetować pożywkę, aby rozbić wszelkie skupiska komórek, a następnie usunąć 75% komórek z kolby i przywrócić całkowitą objętość pożywki do trzech mililitrów. Podziel komórki co najmniej trzy razy przed eksperymentem, aby zapewnić jednorodność ich cyklu komórkowego. Dwa dni przed eksperymentem podziel komórki i umieść je w 60-70% konfluencji na 35-milimetrowej szklanej płytce dolnej z 1,5 mililitra tej samej pożywki hodowlanej.
Następnie, na dzień przed eksperymentem, należy dokonać chemicznej transfekcji komórek pożądanym plazmidem. Wymieszaj 500-1000 nanogramów plazmidu w stosunku jeden do 2,5 z odczynnikiem do transfekcji i 0,25 mililitra zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków przez 30 minut. Po utworzeniu kompleksu transfekcyjnego odessać pożywkę z 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem i zastąpić ją mieszaniną transfekcji o średnicy 0,25 milimetra i dodatkowymi 1,25 milimetra zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora.
W przypadku komórek z zewnętrznie znakowanym konstruktem SSTR3, należy usunąć pożywkę z naczynia ze szklanym dnem na godzinę przed eksperymentem. Umyj komórki pięciokrotnie jednym mililitrem PBS i dodaj jeden mililitr zredukowanej pożywki surowicy uzupełnionej jednym mikromolem sprzężonej streptawidyny Alexa 647. Nie więcej niż 15 minut przed eksperymentem wyjmij pożywkę z naczynia ze szklanym dnem i umyj komórki pięć razy jednym mililitrem PBS.
Następnie dodaj jeden mililitr buforu do obrazowania do naczynia ze szklanym dnem. Przymocuj szklaną dolną płytkę do stolika w mikroskopie. Znajdź komórkę ekspresyjną GFP za pomocą zestawu filtrów GFP i zlokalizuj komórkę, która prawidłowo wyraża SSTR3-GFP w rzęskach pierwotnych.
Po znalezieniu odpowiedniej komórki wyrównaj plamkę NPHP4-mCherry u podstawy rzęsek pierwotnych z miejscem na płaszczyźnie obrazowania, które odpowiada jednopunktowemu oświetleniu lasera. Korzystając z funkcji przyciągania, na karcie aparatu w oknie sterowania ostrością, uchwyć obraz epifluorescencyjny białek NPHP4-mCherry i SSTR3 oznaczonych zielonym białkiem fluorescencji. Po uzyskaniu obrazów referencyjnych należy lokalnie zmniejszyć stężenie znakowanych pojedynczych cząsteczek poprzez fotowybielanie strefy przejściowej za pomocą oświetlenia laserowego o mocy jednego miliwata przez 20 sekund.
Aby przygotować się do śledzenia pojedynczych cząsteczek, zmniejsz moc oświetlenia lasera do 0,5 miliwata dla cząsteczek oznaczonych Alexa 647. Ustaw wzmocnienie i intensyfikację na maksimum, a liczbę klatek na sekundę na dwie milisekundy. Następnie kliknij przycisk strumienia na karcie aparatu w oknie sterowania ostrością i włącz odpowiedni laser oświetleniowy.
Rejestruj pojedyncze cząsteczki, które nie zostały fotobielone, gdy są transportowane przez fotobielony obszar strefy przejściowej. I pamiętaj, aby nagrać nie więcej niż dwie minuty filmu, aby uniknąć skutków dryfu rzęskowego. Po przechwyceniu pojedynczych cząsteczek przetwórz filmy za pomocą algorytmu dopasowania Gaussa 2D, takiego jak Glimpse firmy Gelles, który precyzyjnie lokalizuje środek ciężkości punktu wzbudzenia każdej pojedynczej cząsteczki, funkcję rozprzestrzeniania się i otaczający obszar zainteresowania.
Na koniec wybierz wszystkie lokalizacje pojedynczej cząsteczki z precyzją lepszą niż 10 nanometrów i skoryguj środek rzęsek w oparciu o rozkład lokalizacji pojedynczych cząsteczek wyposażonych w funkcję Gaussa 2D. Jak opisano w tym filmie, oświetlenie jednopunktowe może być wykorzystane do śledzenia cząsteczki SSTR3 oznaczonej AF647 przez strefę przejściową oznaczoną przez NPHP4-mCherry. Przed analizą danych nałożenie wideo pojedynczej cząsteczki na oświetlenie o szerokim polu jest przydatnym krokiem walidacji, aby upewnić się, że laser jest prawidłowo ustawiony i że istnieje odpowiedni stosunek sygnału do szumu.
Na zdjęciu znajduje się komórka z rzęską pierwotną zidentyfikowana przez barwienie. IFT20 jest składnikiem kompleksu transportu wewnątrzwiciowego, który przenosi ładunek wzdłuż mikrotubul wewnątrz rzęsek pierwotnych, oznaczonych symbolem Arl13b-mCherry. Po zidentyfikowaniu mikroskopia prędkości jest wykorzystywana do śledzenia poszczególnych białek IFT20-GFP.
Następnie algorytm transformacji 2D do 3D służy do wytworzenia przestrzennego rozkładu gęstości prawdopodobieństwa białka wewnątrz rzęsek pierwotnych wzdłuż jednego wymiaru. Ten obszar o dużej gęstości prawdopodobnie kolokalizuje się z mikrotubulami aksonomalnymi zgodnie ze znaną lokalizacją drogi transportu wewnątrzwiciowego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby precyzyjnie wyrównać próbkę z laserem, aby zminimalizować błędy systematyczne.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić pojedyncze cząsteczki za pomocą mikroskopii szybkościowej i będziesz wiedział, jak uzyskać trasę transportu pojedynczej cząsteczki w rzęskach pierwotnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na mapowaniu trójwymiarowych (3D) przestrzennych lokalizacji szlaków transportu białek w rzęskach pierwotnych za pomocą superrezolucjonalnego obrazowania fluorescencyjnego. Zestaw eksperymentalny i analizy danych są szczegółowo opisane, aby zapewnić wgląd w transport białek w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Obrazowanie fluorescencyjne
Tło
- Rzęski pierwotne odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Rozumienie szlaków transportu białek może ujawnić różnice między normalnymi a dysfunkcjonalnymi rzęskami.
- Wysokorozdzielcze techniki obrazowania są niezbędne do badania tych procesów w żywych komórkach.
- To badanie przyczynia się do szerszej wiedzy o funkcji i dysfunkcji rzęsek.
Cel badania
- Zidentyfikować szlaki transportu białek w rzęskach pierwotnych.
- Zbadać różnice w szlakach transportu między normalnymi a dysfunkcjonalnymi rzęskami.
- Zastosować nowatorską technikę obrazowania dla lepszej rozdzielczości w badaniach na żywych komórkach.
Zastosowane metody
- 3D superrezolucjonalne obrazowanie fluorescencyjne.
- Przygotowanie komórek NIH-3T3 do obrazowania na żywo.
- Rozmrażanie i hodowanie komórek w kontrolowanych warunkach.
- Analiza danych w celu smapowania szlaków transportu białek.
Główne wyniki
- Udane smapowanie szlaków transportu białek w żywych rzęskach pierwotnych.
- Identyfikacja kluczowych różnic w szlakach transportu w różnych warunkach.
- Demonstracja skuteczności techniki obrazowania.
- Wgląd w dynamikę transportu białek w rzęskach.
Wnioski
- Badanie zapewnia nową perspektywę na transport białek w rzęskach pierwotnych.
- Wysokorozdzielcze obrazowanie może ujawnić kluczowe informacje o funkcji rzęsek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zbadać dysfunkcję rzęsek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Mapping protein transport routes in primary cilia addresses a critical gap in understanding ciliary signaling mechanisms relevant to ciliopathies and neurodevelopmental disorders. High-speed super-resolution SPEED microscopy enables real-time single-molecule tracking in live cells, providing quantitative spatial data that supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This capability enhances predictive confidence in identifying druggable nodes within ciliary signaling pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing 3D spatial probability density maps of ciliary protein transport routes in live primary cilia.
- Operational Value: Supports functional target validation by resolving subdiffraction transport pathways of cytosolic and membrane proteins involved in intraflagellar transport.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking through direct observation of protein dynamics in disease-relevant cellular models.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (NIH-3T3 cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins) for downstream compound screening and target engagement studies.
- Quantitative Output: Generates 3D spatial probability density maps that serve as standardized, reproducible readouts for assessing compound effects on protein trafficking.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple ciliary proteins (e.g., SSTR3, IFT20) and disease models through consistent sample preparation and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects to translational biomarker alignment by identifying transport route differences between normal and dysfunctional cilia, informing preclinical model selection.
- Translational Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing mechanistic insights into cargo transport along axonemal microtubules.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing transport defects that correlate with ciliary dysfunction phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
Positioned within the discovery continuum, SPEED microscopy supports hypothesis testing in early discovery, enables assay-ready systems for screening, and provides quantitative spatial analytics that inform lead identification and preclinical progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping 3D transport routes of ciliary proteins in live cells.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized preparation of live primary cilia models and reproducible single-molecule tracking outputs.
- Analytics: Provides high-precision spatial measurements (sub-10 nm localization) and probability density distributions that enable condition comparison and effect quantification.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking observed transport routes to known intraflagellar transport mechanisms and disease-associated phenotypes.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging capability across multiple targets and cell lines due to its adaptability to various fluorescence-tagged ciliary proteins.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ciliary protein trafficking.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through defined cell preparation, transfection, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of transport-related liabilities, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of ciliary targets based on functional transport data from live-cell models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy, single-molecule tracking, and live-cell imaging techniques.
- Depends on specialized instrumentation including high-speed laser illumination, sensitive cameras (e.g., EMCCD), and environmental control for live-cell maintenance.
- Necessitates cross-team standardization of transfection efficiency, expression levels, and photobleaching protocols to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ciliary proteins or cell types due to variability in transfection efficiency and cilia formation.
- Limited by the need for precise laser-sample alignment to minimize systematic error in 2D-to-3D transformation and spatial mapping accuracy.
