Zastosowanie szybkiej mikroskopii superrozdzielczej SPEED w żywej rzęsce pierwotnej
16 stycznia 2018
Ostatnio zmapowaliśmy trójwymiarowe (3D) przestrzenne lokalizacje tras transportowych dla różnych białek przemieszczających się wewnątrz rzęsek pierwotnych w żywych komórkach. W tym artykule szczegółowo opisano konfigurację eksperymentalną, proces pobierania próbek biologicznych i analizy danych dla podejścia do obrazowania fluorescencji 3D o wysokiej rozdzielczości, nowo zastosowanego w żywych rzęskach pierwotnych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest identyfikacja dróg transportu białek w rzęskach pierwotnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rzęsek, takie jak różnice w trasie transportu białek w normalnych i dysfunkcyjnych rzęskach. Główną zaletą tej techniki jest to, że ma wystarczająco wysoką rozdzielczość, aby zobaczyć drogi transportu białek subdyfrakcyjnych w żywych komórkach.
Na początek rozmrozić zamrożony zapas specjalnie zaprojektowanych komórek NIH-3T3 w temperaturze 37 stopni Celsjusza, półtora tygodnia przed eksperymentem. Przenieś rozmrożone komórki do kolby z hodowlą komórkową o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych zawierającej trzy mililitry wstępnie podgrzanej pożywki. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla.
Hoduj komórki, aż osiągną 80% zbieżności, a następnie podziel komórki. Aby podzielić komórki, trypsynizuj je 0,25% trypsyny przez dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po krótkiej inkubacji odessać trypsynę i zastąpić ją dwoma mililitrami wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
Odpipetować pożywkę, aby rozbić wszelkie skupiska komórek, a następnie usunąć 75% komórek z kolby i przywrócić całkowitą objętość pożywki do trzech mililitrów. Podziel komórki co najmniej trzy razy przed eksperymentem, aby zapewnić jednorodność ich cyklu komórkowego. Dwa dni przed eksperymentem podziel komórki i umieść je w 60-70% konfluencji na 35-milimetrowej szklanej płytce dolnej z 1,5 mililitra tej samej pożywki hodowlanej.
Następnie, na dzień przed eksperymentem, należy dokonać chemicznej transfekcji komórek pożądanym plazmidem. Wymieszaj 500-1000 nanogramów plazmidu w stosunku jeden do 2,5 z odczynnikiem do transfekcji i 0,25 mililitra zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków przez 30 minut. Po utworzeniu kompleksu transfekcyjnego odessać pożywkę z 35-milimetrowego naczynia ze szklanym dnem i zastąpić ją mieszaniną transfekcji o średnicy 0,25 milimetra i dodatkowymi 1,25 milimetra zredukowanej pożywki surowicy bez antybiotyków i włożyć płytkę z powrotem do inkubatora.
W przypadku komórek z zewnętrznie znakowanym konstruktem SSTR3, należy usunąć pożywkę z naczynia ze szklanym dnem na godzinę przed eksperymentem. Umyj komórki pięciokrotnie jednym mililitrem PBS i dodaj jeden mililitr zredukowanej pożywki surowicy uzupełnionej jednym mikromolem sprzężonej streptawidyny Alexa 647. Nie więcej niż 15 minut przed eksperymentem wyjmij pożywkę z naczynia ze szklanym dnem i umyj komórki pięć razy jednym mililitrem PBS.
Następnie dodaj jeden mililitr buforu do obrazowania do naczynia ze szklanym dnem. Przymocuj szklaną dolną płytkę do stolika w mikroskopie. Znajdź komórkę ekspresyjną GFP za pomocą zestawu filtrów GFP i zlokalizuj komórkę, która prawidłowo wyraża SSTR3-GFP w rzęskach pierwotnych.
Po znalezieniu odpowiedniej komórki wyrównaj plamkę NPHP4-mCherry u podstawy rzęsek pierwotnych z miejscem na płaszczyźnie obrazowania, które odpowiada jednopunktowemu oświetleniu lasera. Korzystając z funkcji przyciągania, na karcie aparatu w oknie sterowania ostrością, uchwyć obraz epifluorescencyjny białek NPHP4-mCherry i SSTR3 oznaczonych zielonym białkiem fluorescencji. Po uzyskaniu obrazów referencyjnych należy lokalnie zmniejszyć stężenie znakowanych pojedynczych cząsteczek poprzez fotowybielanie strefy przejściowej za pomocą oświetlenia laserowego o mocy jednego miliwata przez 20 sekund.
Aby przygotować się do śledzenia pojedynczych cząsteczek, zmniejsz moc oświetlenia lasera do 0,5 miliwata dla cząsteczek oznaczonych Alexa 647. Ustaw wzmocnienie i intensyfikację na maksimum, a liczbę klatek na sekundę na dwie milisekundy. Następnie kliknij przycisk strumienia na karcie aparatu w oknie sterowania ostrością i włącz odpowiedni laser oświetleniowy.
Rejestruj pojedyncze cząsteczki, które nie zostały fotobielone, gdy są transportowane przez fotobielony obszar strefy przejściowej. I pamiętaj, aby nagrać nie więcej niż dwie minuty filmu, aby uniknąć skutków dryfu rzęskowego. Po przechwyceniu pojedynczych cząsteczek przetwórz filmy za pomocą algorytmu dopasowania Gaussa 2D, takiego jak Glimpse firmy Gelles, który precyzyjnie lokalizuje środek ciężkości punktu wzbudzenia każdej pojedynczej cząsteczki, funkcję rozprzestrzeniania się i otaczający obszar zainteresowania.
Na koniec wybierz wszystkie lokalizacje pojedynczej cząsteczki z precyzją lepszą niż 10 nanometrów i skoryguj środek rzęsek w oparciu o rozkład lokalizacji pojedynczych cząsteczek wyposażonych w funkcję Gaussa 2D. Jak opisano w tym filmie, oświetlenie jednopunktowe może być wykorzystane do śledzenia cząsteczki SSTR3 oznaczonej AF647 przez strefę przejściową oznaczoną przez NPHP4-mCherry. Przed analizą danych nałożenie wideo pojedynczej cząsteczki na oświetlenie o szerokim polu jest przydatnym krokiem walidacji, aby upewnić się, że laser jest prawidłowo ustawiony i że istnieje odpowiedni stosunek sygnału do szumu.
Na zdjęciu znajduje się komórka z rzęską pierwotną zidentyfikowana przez barwienie. IFT20 jest składnikiem kompleksu transportu wewnątrzwiciowego, który przenosi ładunek wzdłuż mikrotubul wewnątrz rzęsek pierwotnych, oznaczonych symbolem Arl13b-mCherry. Po zidentyfikowaniu mikroskopia prędkości jest wykorzystywana do śledzenia poszczególnych białek IFT20-GFP.
Następnie algorytm transformacji 2D do 3D służy do wytworzenia przestrzennego rozkładu gęstości prawdopodobieństwa białka wewnątrz rzęsek pierwotnych wzdłuż jednego wymiaru. Ten obszar o dużej gęstości prawdopodobnie kolokalizuje się z mikrotubulami aksonomalnymi zgodnie ze znaną lokalizacją drogi transportu wewnątrzwiciowego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby precyzyjnie wyrównać próbkę z laserem, aby zminimalizować błędy systematyczne.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak śledzić pojedyncze cząsteczki za pomocą mikroskopii szybkościowej i będziesz wiedział, jak uzyskać trasę transportu pojedynczej cząsteczki w rzęskach pierwotnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na mapowaniu trójwymiarowego (3D) rozmieszczenia przestrzennego szlaków transportu białek w rzęskach pierwotnych z wykorzystaniem obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości. Układ doświadczalny oraz analizy danych zostały szczegółowo opisane, aby dostarczyć informacji na temat transportu białek w żywych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Obrazowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Rzęski pierwotne odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie szlaków transportu białek może ujawnić różnice między rzęskami prawidłowymi a dysfunkcyjnymi.
- Techniki obrazowania o wysokiej rozdzielczości są niezbędne do badania tych procesów w żywych komórkach.
- Niniejsze badanie przyczynia się do szerszego zrozumienia funkcji i dysfunkcji rzęsek.
Cel badania
- Identyfikacja szlaków transportu białek w rzęskach pierwotnych.
- Zbadanie różnic w szlakach transportu pomiędzy rzęskami prawidłowymi a dysfunkcyjnymi.
- Zastosowanie nowatorskiej techniki obrazowania w celu zwiększenia rozdzielczości w badaniach żywych komórek.
Zastosowane metody
- Fluorescencyjne obrazowanie super-rozdzielcze 3D.
- Przygotowanie komórek NIH-3T3 do obrazowania na żywo.
- Rozmrażanie i hodowla komórek w kontrolowanych warunkach.
- Analiza danych w celu mapowania szlaków transportu białek.
Główne wyniki
- Skuteczne mapowanie szlaków transportu białek w żywych rzęskach pierwotnych.
- Identyfikacja kluczowych różnic w szlakach transportu w różnych warunkach.
- Wykazanie skuteczności zastosowanej techniki obrazowania.
- Wgląd w dynamikę transportu białek w rzęskach.
Wnioski
- Badanie dostarcza nowej perspektywy na transport białek w rzęskach pierwotnych.
- Obrazowanie o wysokiej rozdzielczości może dostarczyć kluczowych informacji na temat funkcji rzęsek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania dysfunkcji rzęsek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Mapowanie szlaków transportu białek w rzęskach pierwotnych pozwala wypełnić krytyczną lukę w zrozumieniu mechanizmów sygnalizacji rzęskowej, mających znaczenie dla ciliopatii oraz zaburzeń neurorozwojowych. Szybka mikroskopia superrozdzielcza SPEED umożliwia śledzenie pojedynczych cząsteczek w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, dostarczając ilościowych danych przestrzennych, które wspierają walidację celów oraz minimalizację ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji punktów uchwytu dla leków w obrębie szlaków sygnalizacji rzęskowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację trójwymiarowych map gęstości prawdopodobieństwa przestrzennego szlaków transportu białek rzęskowych w żywych rzęskach pierwotnych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez rozdzielenie transportowych ścieżek poniżej granicy dyfrakcji dla białek cytozolowych i błonowych zaangażowanych w transport wewnątrzrzęskowy.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia biologiczne ograniczanie ryzyka dzięki bezpośredniej obserwacji dynamiki białek w modelach komórkowych istotnych dla danej jednostki chorobowej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Gotowość testu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne (komórki NIH-3T3 wykazujące ekspresję białek rzęskowych znakowanych białkami fluorescencyjnymi) do późniejszego przesiewania związków oraz badań zaangażowania celu.
- Wynik ilościowy: Generuje trójwymiarowe mapy gęstości prawdopodobieństwa przestrzennego, które służą jako zestandaryzowane i powtarzalne odczyty do oceny wpływu związków na transport białek.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla wielu białek rzęskowych (np. SSTR3, IFT20) oraz modeli chorób dzięki spójnym protokołom przygotowania próbek i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Łączy z dopasowaniem biomarkerów translacyjnych poprzez identyfikację różnic w drogach transportu między rzęskami prawidłowymi a dysfunkcyjnymi, co pomaga w wyborze modelu przedklinicznego.
- Ciągłość translacyjna: Stanowi pomost między odkryciem a walidacją przedkliniczną, dostarczając wglądu w mechanizmy transportu ładunku wzdłuż mikrotubul aksonemalnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuowaniu lub przerwaniu badań (go/no-go), ujawniając defekty transportu, które korelują z fenotypami dysfunkcji rzęsek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Umiiejscowiona w kontinuum procesu odkrywania, mikroskopia SPEED wspiera testowanie hipotez na wczesnym etapie badań, umożliwia tworzenie systemów gotowych do testów w procesach screeningu oraz dostarcza ilościowych analiz przestrzennych, które pomagają w identyfikacji związków wiodących i rozwoju badań przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez mapowanie trójwymiarowych tras transportu białek rzęskowych w żywych komórkach.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu modeli żywych rzęsek pierwotnych oraz powtarzalnym wynikom śledzenia pojedynczych cząsteczek.
- Analityka: Dostarcza wysokoprecyzyjnych pomiarów przestrzennych (lokalizacja poniżej 10 nm) i rozkładów gęstości prawdopodobieństwa, co umożliwia porównanie warunków i kwantyfikację efektów.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez powiązanie obserwowanych tras transportu ze znanymi mechanizmami transportu wewnątrzrzęskowego i fenotypami związanymi z chorobami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku metoda obrazowania dla wielu celów i linii komórkowych dzięki swojej adaptacyjności do różnych białek rzęskowych znakowanych fluorescencyjnie.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w transporcie białek rzęskowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia odtwarzalność i standaryzację dzięki zdefiniowanym protokołom przygotowania komórek, transfekcji oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie wad związanych z transportem, co redukuje ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów rzęskowych skorygowaną o ryzyko, w oparciu o dane dotyczące transportu funkcjonalnego z modeli żywych komórek.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii superrozdzielczej, śledzenia pojedynczych cząsteczek oraz technik obrazowania żywych komórek.
- Zależny od specjalistycznej aparatury, w tym szybkich układów oświetlenia laserowego, czułych kamer (np. EMCCD) oraz systemów kontroli środowiskowej do utrzymania żywych komórek.
- Wymaga międzyzespołowej standaryzacji wydajności transfekcji, poziomów ekspresji oraz protokołów fotowybielania w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody przy zastosowaniu jej do różnych białek rzęskowych lub typów komórek ze względu na zmienność wydajności transfekcji i formowania się rzęsek.
- Ograniczony koniecznością precyzyjnego wyrównania lasera z próbką w celu zminimalizowania błędów systematycznych podczas transformacji 2D na 3D oraz zapewnienia dokładności mapowania przestrzennego.
