Name: Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Poznaj metodę indukcji malformacji jamistych mózgu u myszy noworodków i obrazowania mikro-CT do pomiaru obciążenia chorobą. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę zmian naczyniowych w modelu zwierzęcym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują za udogodnienia oraz naukową i techniczną pomoc Sydney Microscopy & Microanalysis Research Facility (AMMRF) oraz Australian Centre for Microscopy & Microanalysis (ACMM) na Uniwersytecie w Sydney. Badania te były wspierane przez australijską Narodową Radę Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) w ramach grantu 161558 i APP1124011 (XZ).

Wszystkie zasady etyki i protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt Lokalnego Okręgu Zdrowia w Sydney oraz Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Medycznego w Tianjin. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi/przepisami Centenary Institute, University of Sydney i Tianjin Medical University
1. Indukcja wad rozwojowych jamistych mózgu w modelach mysich
<ol>
	<li>Krzyż CDH5-CreErt2; Ccm2fl/fl myszy z Ccm2fl/fl do generowania miotów z Cdh5-CreErt2; Ccm2fl/fl (Ccm2iECKO) młode i kontrolne z miotu (Ccm2fl/fl). Zwierzęta Cdh5-CreErt2 i Ccm2 fl/fl zostały wcześniej opisane19.</li>
	<li>Rozpuścić 4HT w 100% etanolu i przechowywać w temperaturze -80 °C w porcjach 30 μl (stężenie 4HT: 10 mg/mL). W dniu stosowania rozcieńczyć porcję 4HT w oleju kukurydzianym (0,5 mg/ml).</li>
	<li>Wstrzyknąć dożołądkowo 50 μl 4HT (0,5 mg/ml) nowonarodzonym szczeniętom w P1 w celu wywołania eksperymentalnych zmian CCM za pomocą strzykawki insulinowej.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki do badań mikrotomografią komputerową
<ol>
	<li>Eutanazja nowonarodzonych szczeniąt w P8 poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Wykonaj perfuzję wewnątrzsercową, wprowadzając igłę o rozmiarze 29 z 3 ml 2% paraformaldehydu w PBS w strzykawce o pojemności 10 ml do komory serca myszy. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Odłącz głowę od ciała za pomocą nożyczek. Usuń całą skórę z głowy za pomocą nożyczek i oderwij czaszkę za pomocą kleszczy, aby wypreparować cały mózg.</li>
	<li>Rób zdjęcia mózgu za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy powiększeniu 7,82x, wzmocnieniu 1x, gamma 0,6 i czasie naświetlania 20 ms.</li>
	<li>Napraw wypreparowane mózgi za pomocą 4% paraformaldehydu w roztworze PBS przez noc. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny; Nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Następnego dnia odłącz tyłomózgowie za pomocą kleszczy i przemyj roztworem PBS.</li>
	<li>Inkubować tyłomózgowie w roztworze jodu Lugola przez 48 godzin.</li>
	<li>Po inkubacji należy krótko wysuszyć tyłomózgowie na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu jodu Lugola.</li>
	<li>Zapakuj poplamione jodem tyłomózgowie Lugola do probówek mikrowirówek o pojemności 0,65 ml i całkowicie uszczelnij plastikową folią parafinową, aby uniknąć kurczenia się tkanek (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Umieść probówki do mikrowirówek w plastikowych probówkach o pojemności 5 ml z gąbkami, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas skanowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
</ol>
3. Mikrotomografia komputerowa CCM w mózgu myszy
<ol>
	<li>Zamontuj pionowo tyłomózgowie zapakowane w rurkę na aluminiowym uchwycie w systemie micro-CT.</li>
	<li>Ustaw parametry skanowania na 540 projekcji i czas naświetlania 2 s przy warunkach źródła 50 kV i 10 W, aby uzyskać zestawy danych tomograficznych (rozdzielczość obrazu 9,5 μm/piksel).</li>
	<li>Zdjęcia rentgenowskie ze skanu są rekonstruowane automatycznie przez sprzętowe oprogramowanie do rekonstrukcji projekcyjnej dostarczone przez system micro-CT, tworząc serię obrazów 16-bitowych wycinków osiowych (plik "TXM").</li>
</ol>
4. Analiza zbiorów danych Micro-CT
<ol>
	<li>Otwórz zrekonstruowany plik obrazu (plik "TXM") w oprogramowaniu do analizy 3D i zwizualizuj mózg za pomocą funkcji "renderowania objętości".</li>
	<li>Przekształć tyłomózgowie do pożądanej orientacji za pomocą funkcji "obwiedni" i "płaszczyzny tnącej".</li>
	<li>Ponownie próbkuj przekształcony obraz w trybie rozszerzonym i zachowaj rozmiar wokseli.</li>
	<li>Utwórz "edytuj nowe pole etykiety" na przekształconym obrazie (4.3) i podświetl tylko tyłomózgowie za pomocą intensywności skali szarości.</li>
	<li>Dodaj podświetlone obszary i uruchom "analizę etykiety", aby uzyskać pomiary całego tyłomózgowia (tj. całkowitej objętości i obszaru). Eksport pomiarów do pliku Excel.</li>
	<li>Wizualizuj tyłomózgowie za pomocą funkcji "renderowania izopowierzchni".</li>
	<li>Utwórz kolejne "edytuj nowe pole etykiety" na przekształconym obrazie i podświetl obszary ze zmianami za pomocą intensywności skali szarości.</li>
	<li>Dodaj podświetlone obszary i przeprowadź analizę "etykiety", aby uzyskać pomiary zmian w tyłomózgowiu (tj. całkowitej objętości i obszaru). Eksport pomiarów do pliku Excel.</li>
	<li>Wizualizacja zmian chorobowych za pomocą funkcji "generuj powierzchnię" i "widok powierzchni".</li>
	<li>Zrób migawkę obrazu tyłomózgowia w żądanej orientacji lub wygeneruj film, aby uzyskać wizualizację 3D zmian chorobowych.</li>
</ol>

<ol><li>Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations%3A+from+CCM+genes+to+endothelial+cell+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis.</a> Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).</li>
<li>Liquori, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+gene+encoding+a+novel+protein+containing+a+phosphotyrosine-binding+domain+cause+type+2+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).</li>
<li>Laberge-le Couteulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+mutations+in+CCM1%2C+encoding+KRIT1%2C+cause+hereditary+cavernous+angiomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas.</a> Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).</li>
<li>Sahoo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+gene+encoding+KRIT1%2C+a+Krev-1%2Frap1a+binding+protein%2C+cause+cerebral+cavernous+malformations+%28CCM1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1).</a> Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).</li>
<li>Denier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+MGC4607+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).</li>
<li>Bergametti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+within+the+programmed+cell+death+10+gene+cause+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+cerebral+cavernous+malformations+based+on+the+two-hit+mutation+hypothesis+recapitulates+the+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease.</a> Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).</li>
<li>Boulday, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+timing+of+CCM2+loss+influences+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).</li>
<li>Chan, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+2+distinct+genetic+pathways+result+in+cerebral+cavernous+malformations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice.</a> J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+independent+of+the+heart+of+glass+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor.</a> Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).</li>
<li>McDonald, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasudil+decreases+lesion+burden+in+a+murine+model+of+cerebral+cavernous+malformation+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease.</a> Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Gibson, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategy+for+identifying+repurposed+drugs+for+the+treatment+of+cerebral+cavernous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation.</a> Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).</li>
<li>Choi, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+Imaging+Reveals+Mekk3+Heterozygosity+Prevents+Cerebral+Cavernous+Malformations+in+Ccm2-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice.</a> PLoS One. 11 (8), 0160833(2016).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+cavernous+malformations+arise+from+endothelial+gain+of+MEKK3-KLF2%2F4+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling.</a> Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiol. 9, 11(2009).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping.</a> PLoS Genet. 2 (4), 61(2006).</li>
<li>Anderson, R., Maga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Procedure+for+Rapid+Imaging+of+Adult+Mouse+Brains+with+MicroCT+Using+Iodine-Based+Contrast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast.</a> PLoS One. 10 (11), 0142974(2015).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+cerebral+cavernous+malformation+pathway+controls+vascular+stability+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth.</a> Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

CCM jest powszechną malformacją naczyniową, która dotyka do 0,5% osób1. CCM może występować w postaci sporadycznej lub rodzinnej. Rokowanie pacjenta jest często niejasne, ponieważ zmiany CCM mogą nieoczekiwanie pęknąć, powodując udar mózgu i inne konsekwencje neurologiczne. Obecnie jedyną opcją leczenia jest chirurgiczne usunięcie zmian, którym towarzyszy duże ryzyko.
Warunki CCM u ludzi zostały ostatnio odtworzone w modelach zwierzęcych</su...

CCM to cienkościenne, rozszerzone malformacje naczyniowe w mózgu, których częstość występowania w populacji ludzkiej wynosi do 0,5%1. CCM może być dziedziczone jako zaburzenie dominujące z powodu mutacji powodujących utratę funkcji w jednym z trzech genów: CCM1 (aka Krit1), CCM2 i CCM3 (zwane również PDCD10)2,3,4,5,6. Geny te są obecne w pojedynczym kompleksie sygnałowym.
Różne modele zostały opracowane do modelowania ludzkiej choroby CCM i zrozumienia dalszych ścieżek genów CCM, które są odpowiedzialne za CCM7,8,9,10. Najbardziej niezawodnym modelem jest warunkowe usunięcie dowolnego z genów Ccm z indukowanym tamoksyfenem Cdh5-CreERT2 w P1 u nowonarodzonych szczeniąt8,10. U tych szczeniąt rozwijają się zmiany CCM w mózgu od P6 i oczekuje się, że będą idealnym modelem do badań przedklinicznych w poszukiwaniu mechanizmów i środków terapeutycznych w leczeniu chorób CCM.
Obciążenie zmianami CCM w mózgu myszy zostało zmierzone głównie za pomocą metod opartych na histologii, podejścia, które jest niezwykle czasochłonne i podlega stronniczości badacza10,11,12. Metody oparte na MRI zostały wykorzystane do oceny obciążenia zmianami CCM w modelu dorosłej myszy9,13. Jednak wysoce specjalistyczny instrument MRI małych zwierząt i długi czas skanowania wynoszący od kilku godzin do nocy są wymagane, aby osiągnąć zadowalającą rozdzielczość w celu zidentyfikowania zmian CCM. Nie podano również, czy MRI może być stosowany do wykrywania zmian CCM u nowonarodzonych myszy, a ustąpienie może ograniczać czułość.
Niedawno opracowaliśmy technikę mikro-tomografii komputerowej do obrazowania i analizy zmian CCM14,15. Ta metoda o wysokiej rozdzielczości, efektywna czasowo i kosztowo znacznie zwiększyła wartość modelu choroby CCM w badaniach mechanistycznych i terapeutycznych. Do obrazowania mikro-tomografii komputerowej tkanek miękkich i zarodków myszy zastosowano metody barwienia całego wierzchołka wzmacniające kontrast i zarodki myszy16,17. Wcześniej używaliśmy barwienia na bazie osmu w celu zwiększenia kontrastu do obrazowania mikro-CT zmian CCM w brain14. W tym artykule użyliśmy mniej toksycznego, nieniszczącego i ekonomicznego odczynnika, roztworu Lugola na bazie jodu, w celu zwiększenia kontrastu w obrazowaniu mikro-CT. Jod może dyfundować po całym mózgu i ma wysokie powinowactwo do krwi18.
Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony do indukcji zmian CCM w modelu myszy noworodkowej wraz z obrazowaniem i analizą zmian CCM za pomocą mikro-CT opartego na kontraście. Ta metoda oparta na mikro-CT zapewnia ilościowy globalny pomiar objętości zmian CCM, dokładnie identyfikuje liczbę i lokalizację 3D zmian CCM w mózgu myszy oraz znacznie zmniejsza koszty i czas wymagany do fenotypu tych zwierząt.

<table><tbody><tr><td>4-hydroksytamoksyfen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6278</td><td>Aby aktywować Cdh5-CreErt2</td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>Do rozcieńczania 4-hydroksytamoksyfenu</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M205FA</td><td>Do wykonywania zdjęć makroskopowych</td></tr><tr><td>Płyn jodu Lugola</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6146</td><td>Do barwienia próbek do kontrastu mikro-CT</td></tr><tr><td>Folia parafinowa z tworzywa sztucznego</td><td>Parafilm</td><td>PM992</td><td>Do pakowania próbek</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Xradia</td><td>MicroXCT-400</td><td>Oprogramowanie</td></tr> do <tr><td>renderowania 3D</td> Micro-CT <td>FEI Visualization Grupa naukowa</td><td>Avizo Oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D</td><td>Do analizy skanów mikro-CT</td></tr></tbody></table>

indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutacje w genie CCM1 (aka KRIT1), CCM2 lub CCM3 (aka PDCD10) powodują malformację jamistą mózgu (CCM) u ludzi. Mysie modele choroby CCM zostały stworzone na podstawie indukowanej tamoksyfenem delecji genów CCM u zwierząt po urodzeniu. Te mysie modele dostarczają nieocenionych narzędzi do badania mechanizmów molekularnych i podejść terapeutycznych w chorobie CCM. Dokładna i ilościowa metoda oceny obciążenia zmianami i ich progresji jest niezbędna, aby w pełni wykorzystać wartość tych modeli zwierzęcych. Tutaj pokazujemy indukcję choroby CCM w modelu mysim i zastosowanie metody mikrotomografii komputerowej rentgenowskiej ze wzmocnieniem kontrastowym (mikro-CT) do pomiaru obciążenia zmianami CCM w mózgach myszy. W 1. dniu po urodzeniu (P1) użyliśmy 4-hydroksytamoksyfenu (4HT) do aktywacji aktywności rekombinazy Cre z transgenu Cdh5-CreErt2 w celu rozszczepienia floksowanego allelu Ccm2. Zmiany CCM w mózgach myszy analizowano w P8. W przypadku mikrotomografii komputerowej zastosowano płyn Lugola na bazie jodu w celu zwiększenia kontrastu w tkance mózgowej. Zoptymalizowaliśmy parametry skanowania i wykorzystaliśmy wymiar woksela 9,5 μm, co doprowadziło do minimalnego rozmiaru obiektu wynoszącego około 25 μm. Rozdzielczość ta jest wystarczająca do globalnego i dokładnego pomiaru objętości i liczby zmian CCM oraz zapewnienia wysokiej jakości mapowania 3D zmian CCM w mózgach myszy. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii CCM i innych chorób naczyń mózgowych.

Pojedyncza iniekcja 4HT w dniu P1 była wystarczająca do wywołania zmian CCM w móżdżku. Kontrastowanie jodkiem Lugola w mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) pozwoliło na skuteczne wykrycie zmian CCM oraz określenie ich liczby i objętości. Wykorzystując zoptymalizowany protokół micro-CT, obrazowano zmiany CCM w tylnej części mózgu myszy Ccm2iECKO. Przeskanowane obrazy rentgenowskie poddano rekonstrukcji w celu uzyskania obrazów 3D mózgu myszy, co umożliwiło wizualiza...

Ten protokół demonstruje indukcję choroby malformacji jamistych mózgu w modelu mysim i wykorzystuje mikrotomografię komputerową wzmocnioną kontrastem do pomiaru obciążenia zmianami. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii malformacji jamistych mózgu i innych chorób naczyń mózgowych.

Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie malformacji jamistych mózgu u nowonarodzonych myszy i zmierzenie obciążenia chorobą za pomocą mikrotomografii komputerowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób naczyń mózgowych, takie jak malformacje jamiste mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że obciążenie chorobami jamistymi mózgu w modelach noworodków myszy można dokładnie i skutecznie określić w porównaniu z istniejącymi metodami.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ indukcja malformacji jamistych mózgu i etapy analizy mikro-CT są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają doświadczenia i użycia zaawansowanego oprogramowania. Zacznij od rozpuszczenia 4-HT w 100% etanolu do stężenia 10 miligramów na mililitr. Przygotuj 30 mikrolitrów alaquadów, a następnie przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.W dniu użycia rozcieńczyć alaquad w 4-HT w oleju kukurydzianym do 0,5 miligrama na mililitr. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć śródżołądkowo 50 mikrolitrów 4-HT nowonarodzonym szczeniętom P1 w celu wywołania eksperymentalnych zmian CCM. Przygotowanie próbki należy rozpocząć od napełnienia 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 29 trzema mililitrami 2% paraformaldehydu i PBS.Następnie wykonaj obfitość wewnątrzsercową na eutenizowanym szczenię P8, wkładając igłę do komory serca myszy i powoli wstrzykując pełną objętość paraformaldehydu. Po użyciu nożyczek do oderwania głowy, usuń skórę z głowy i oderwij czaszkę za pomocą kleszczy, aby wypreparować cały mózg na 4% paraformaldehyd i PBS. Po naprawie mózgu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.Następnego dnia odłącz tylne mózgowie za pomocą kleszczy i spłucz roztworem PBS. Następnie inkubuj tylne mózgowie w roztworze jodu Lugola przez 48 godzin. Po inkubacji należy krótko wysuszyć tylne mózgowia na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu jodu Lugola.Następnie zapakuj poplamione jodem tylne mózgowie Lugola w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,65 mikrolitra i całkowicie uszczelnij plastikową folią parafinową, aby uniknąć kurczenia się tkanek. Umieść probówki mikrowirówkowe w pięciomililitrowych plastikowych probówkach z gąbkami, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas skanowania. Zamontuj pionowo rurkę zawierającą tylny mózg na aluminiowym uchwycie w systemie micro-CT.Ustaw parametry skanowania. Użyj 540 projekcji i dwusekundowego czasu naświetlania przy warunkach źródłowych 50 kilowoltów i 10 watów, aby uzyskać zestawy danych tomograficznych. Wykresy radiowe ze skanu są rekonstruowane automatycznie przez sprzętowe oprogramowanie do rekonstrukcji projekcyjnej, dostarczane przez system mikro-CT, tworząc serię obrazów 16-bitowych wycinków osiowych.Kontrast z jodem Lugola w mikrotomografii komputerowej dostatecznie wykrył zmiany CCM. Zeskanowane obrazy rentgenowskie zrekonstruowano w celu uzyskania obrazów 3D mózgu myszy, co pozwoliło na wizualizację całych zmian w miąższu mózgu, na różnych głębokościach i orientacjach, oraz ocenę struktury w lokalizacji 3D zmian w mózgu. Poniższa tabela przedstawia przykładową wydajność ilościową oznakowanych poszczególnych zmian.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami naczyniowymi do zbadania mechanizmów i opcji terapeutycznych malformacji jamistych mózgu w modelach mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zmianę CCM w modelach mysich oraz jak uzyskać i przeanalizować obciążenie zmianami CCM za pomocą techniki mikro-CT.

induction-micro-ct-imaging-cerebral-cavernous-malformations-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

W niniejszym artykule przedstawiamy prostą i praktyczną technikę odlewu naczyniowego mózgu, która jest łatwa w wykonaniu i może być wykorzystana do obrazowania drzewa naczyniowego mózgu dorosłej myszy.

Odlewanie naczyń mózgowych dorosłej myszy do obrazowania 3D i analizy morfologicznej

Źródło: Xavier, A. L. R., et al. Implantacja kaniuli do Cisterna Magna gryzoni. J. Vis. Exp. (2018)Ten film pokazuje procedurę wszczepiania kaniuli do cisterna magna znieczulonej myszy. Technika polega na przeprowadzeniu kaniuli zamontowanej na igle przez oponę twardą do odwróconego trójkątnego cisterna magna i zabezpieczeniu jej w celu ukierunkowanego dostarczenia do płynu mózgowo-rdzeniowego.

Implantacja kaniuli do Cisterna Magna w modelu mysim

W tym filmie, genetycznie zmodyfikowane mysie szczenię z genem Ccm2 otoczonym miejscami loxP i rekombinazą Cre połączonej z receptorem estrogenowym jest używane do wywoływania mózgowych malformacji jamistych (CCM). Podanie 4-hydroksytamoksyfenu aktywuje Cre w komórkach śródbłonka, prowadząc do delecji Ccm2 i powstania CCM w mózgu.

Indukcja wad rozwojowych jamistych mózgu za pośrednictwem Cre-LoxP w modelu mysim

Źródło: Choi, J. P. et al. Obrazowanie indukcji i mikrotomografii komputerowej malformacji jamistych mózgu na modelu mysim. J. vis. exp. ( 2017)Ten film pokazuje zastosowanie obrazowania mikro-CT do wizualizacji zmian w malformacji jamistych mózgu (CCM) w mózgu myszy. Szczegółowo opisano w nim etapy przygotowania próbki, obrazowania i rekonstrukcji obrazu 3D w celu oceny gęstości i lokalizacji zmian CCM w tkance mózgowej.

Obrazowanie mikrotomografii komputerowej ze wzmocnieniem kontrastowym zmian w malformacjach jamistych mózgu w mózgu myszy

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest...

Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Ten protokół opisuje zastosowanie połączonego obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni (NIRF) i mikrotomografii komputerowej (microCT) do wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. Technika ta pozwala na ilościowe określenie obciążenia skrzepliną i ewolucji. Technika obrazowania NIRF wizualizuje znakowaną fluorescencyjnie skrzeplinę w wyciętym mózgu, podczas gdy technika mikroCT wizualizuje skrzeplinę wewnątrz żywych zwierząt za pomocą nanocząstek złota.

Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i tomografia mikrokomputerowa do bezpośredniej wizualizacji choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu

Celem tego artykułu jest przedstawienie metody, która pozwala na trójwymiarową rekonstrukcję drzewa naczyniowo-mózgowego u myszy po mikrotomografii komputerowej i określeniu objętości całych segmentów naczynia, które mogą być użyte do ilościowego określenia skurczu naczyń mózgowych w mysich modelach krwotoku podpajęczynówkowego.

Wolumetryczna metoda ilościowego oznaczania skurczu naczyń mózgowych w mysim modelu krwotoku podpajęczynówkowego

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia modelu dystalnej niedrożności tętnicy środkowej mózgu (dMCAO) poprzez przezczaszkową elektrokoagulację u myszy C57BL/6J i oceny późniejszego zachowania neurologicznego i cech histopatologicznych.

Indukcja ostrego udaru niedokrwiennego u myszy przy użyciu techniki niedrożności dystalnej tętnicy środkowej

Protokół opisuje metodę wstrzykiwania komórek nowotworowych drogą przezskórnego nakłucia do cisterna magna, która silnie indukuje przerzuty opon mózgowo-rdzeniowych u myszy, zmniejszając uraz i obciążenie guzem pozaczaszkowym.

Minimalnie inwazyjny model iniekcji Cisterna Magna do badań przerzutów opon mózgowo-rdzeniowych u myszy

Poznaj metodę indukcji malformacji jamistych mózgu u myszy noworodków i obrazowania mikro-CT do pomiaru obciążenia chorobą. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę zmian naczyniowych w modelu zwierzęcym.

Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim

Przeglądaj więcej filmów