Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim
September 4th, 2017
Ten protokół demonstruje indukcję choroby malformacji jamistych mózgu w modelu mysim i wykorzystuje mikrotomografię komputerową wzmocnioną kontrastem do pomiaru obciążenia zmianami. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii malformacji jamistych mózgu i innych chorób naczyń mózgowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie malformacji jamistych mózgu u nowonarodzonych myszy i zmierzenie obciążenia chorobą za pomocą mikrotomografii komputerowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób naczyń mózgowych, takie jak malformacje jamiste mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że obciążenie chorobami jamistymi mózgu w modelach noworodków myszy można dokładnie i skutecznie określić w porównaniu z istniejącymi metodami.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ indukcja malformacji jamistych mózgu i etapy analizy mikro-CT są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają doświadczenia i użycia zaawansowanego oprogramowania. Zacznij od rozpuszczenia 4-HT w 100% etanolu do stężenia 10 miligramów na mililitr. Przygotuj 30 mikrolitrów alaquadów, a następnie przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
W dniu użycia rozcieńczyć alaquad w 4-HT w oleju kukurydzianym do 0,5 miligrama na mililitr. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć śródżołądkowo 50 mikrolitrów 4-HT nowonarodzonym szczeniętom P1 w celu wywołania eksperymentalnych zmian CCM. Przygotowanie próbki należy rozpocząć od napełnienia 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 29 trzema mililitrami 2% paraformaldehydu i PBS.
Następnie wykonaj obfitość wewnątrzsercową na eutenizowanym szczenię P8, wkładając igłę do komory serca myszy i powoli wstrzykując pełną objętość paraformaldehydu. Po użyciu nożyczek do oderwania głowy, usuń skórę z głowy i oderwij czaszkę za pomocą kleszczy, aby wypreparować cały mózg na 4% paraformaldehyd i PBS. Po naprawie mózgu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odłącz tylne mózgowie za pomocą kleszczy i spłucz roztworem PBS. Następnie inkubuj tylne mózgowie w roztworze jodu Lugola przez 48 godzin. Po inkubacji należy krótko wysuszyć tylne mózgowia na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu jodu Lugola.
Następnie zapakuj poplamione jodem tylne mózgowie Lugola w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,65 mikrolitra i całkowicie uszczelnij plastikową folią parafinową, aby uniknąć kurczenia się tkanek. Umieść probówki mikrowirówkowe w pięciomililitrowych plastikowych probówkach z gąbkami, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas skanowania. Zamontuj pionowo rurkę zawierającą tylny mózg na aluminiowym uchwycie w systemie micro-CT.
Ustaw parametry skanowania. Użyj 540 projekcji i dwusekundowego czasu naświetlania przy warunkach źródłowych 50 kilowoltów i 10 watów, aby uzyskać zestawy danych tomograficznych. Wykresy radiowe ze skanu są rekonstruowane automatycznie przez sprzętowe oprogramowanie do rekonstrukcji projekcyjnej, dostarczane przez system mikro-CT, tworząc serię obrazów 16-bitowych wycinków osiowych.
Kontrast z jodem Lugola w mikrotomografii komputerowej dostatecznie wykrył zmiany CCM. Zeskanowane obrazy rentgenowskie zrekonstruowano w celu uzyskania obrazów 3D mózgu myszy, co pozwoliło na wizualizację całych zmian w miąższu mózgu, na różnych głębokościach i orientacjach, oraz ocenę struktury w lokalizacji 3D zmian w mózgu. Poniższa tabela przedstawia przykładową wydajność ilościową oznakowanych poszczególnych zmian.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami naczyniowymi do zbadania mechanizmów i opcji terapeutycznych malformacji jamistych mózgu w modelach mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zmianę CCM w modelach mysich oraz jak uzyskać i przeanalizować obciążenie zmianami CCM za pomocą techniki mikro-CT.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół demonstruje indukcję choroby zmian jasnych w mózgu u myszy noworodków i wykorzystuje mikro-TK do pomiaru obciążenia zmianami. Ta metoda poprawia zrozumienie podstawy molekularnej i potencjalnych terapii zmian jasnych w mózgu oraz innych chorób naczyń mózgowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia naczyniowa
- Modele myszy
Tło
- Zmiany jasne w mózgu (CCM) to zmiany naczyniowe, które mogą prowadzić do znacznych problemów neurologicznych.
- Istniejące metody pomiaru obciążenia chorobą w modelach mysich są często nieefektywne.
- Mikro-TK oferuje nieinwazyjny sposób wizualizowania i ilościowego określania zmian.
- Rozumienie CCM może dostarczyć wglądu w inne choroby naczyń mózgowych.
Cel badania
- Indukowanie zmian jasnych w mózgu u myszy noworodków.
- Dokładne pomiar obciążenia chorobą za pomocą mikro-TK.
- Poprawa metodologii badania chorób naczyń mózgowych.
Zastosowane metody
- Rozpuszczanie 4-HT w etaolu w celu stworzenia roztworu do indukowania CCM.
- Przygotowanie alikwotów do przechowywania w temperaturze -80 stopni Celsjusza.
- Wykorzystanie kontrastowo wzmocnionego mikro-TK do obrazowania.
- Wizyjna demonstracja procesu indukcji i analizy.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na dokładne i efektywne określenie obciążenia chorobą CCM.
- Mikro-TK zapewnia jasne obrazowanie zmian w modelach mysich.
- Indukcja CCM została pomyślnie osiągnięta u myszy noworodków.
- To podejście może ułatwić dalsze badania nad potencjalnymi terapiami.
Wnioski
- Ten protokół zwiększa wartość modeli mysich do badania CCM.
- Mikro-TK jest potężnym narzędziem do oceny obciążenia chorobą naczyń mózgowych.
- Przyszłe badania mogą budować na tej metodologii, aby zbadać opcje terapeutyczne.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative micro-CT imaging of cerebral cavernous malformations (CCMs) in genetically engineered mouse models enables precise assessment of lesion burden, supporting mechanistic de-risking and target validation in cerebrovascular disease research. This approach enhances predictive confidence for early-stage therapeutic hypothesis testing and informs portfolio triage by providing robust, reproducible lesion quantification. Integration of high-resolution imaging with genetic disease models positions this workflow as a critical inflection point for translational continuity in vascular biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous interrogation of CCM gene function and pathway involvement in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying lesion formation following targeted gene deletion.
- Provides functional target validation through direct measurement of disease-relevant phenotypes.
- Facilitates predictive confidence in selecting or deprioritizing molecular targets for further study.
Screening & Assay Development
- Establishes validated mouse models and imaging protocols for downstream compound screening.
- Delivers standardized, quantitative lesion metrics suitable for assay development and reproducibility assessment.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of therapeutic interventions in preclinical settings.
- Supports reliable comparison of experimental conditions through consistent imaging outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease genetics for translational biomarker development.
- Ensures continuity from genetic discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces translational risk by providing quantitative endpoints for disease progression and intervention efficacy.
- Strengthens mechanistic understanding of cerebrovascular pathology relevant to clinical translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven genetic manipulation and quantitative phenotyping in mouse models, supporting lead identification and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing and pathway clarification through genetic lesion induction and quantification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging outputs for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Delivers volumetric and numerical lesion data to support statistical comparison across experimental groups.
- Translational Research: Connects genetic models to disease-relevant endpoints for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse cerebrovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes lesion quantification and imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust preclinical data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of vascular disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in genetic mouse model handling and micro-CT imaging protocols.
- Demands access to high-resolution micro-CT instrumentation and specialized analysis software.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data interpretation.
- May require adaptation of protocols for different genetic backgrounds or lesion types.
- Dependent on precise sample preparation and imaging conditions to ensure data quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
