Indukcja i obrazowanie mikro-tomografią malformacji jamistych mózgu w modelu mysim
4 września 2017
Ten protokół demonstruje indukcję choroby malformacji jamistych mózgu w modelu mysim i wykorzystuje mikrotomografię komputerową wzmocnioną kontrastem do pomiaru obciążenia zmianami. Metoda ta zwiększa wartość uznanych modeli mysich w celu zbadania podstaw molekularnych i potencjalnych terapii malformacji jamistych mózgu i innych chorób naczyń mózgowych.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie malformacji jamistych mózgu u nowonarodzonych myszy i zmierzenie obciążenia chorobą za pomocą mikrotomografii komputerowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie chorób naczyń mózgowych, takie jak malformacje jamiste mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że obciążenie chorobami jamistymi mózgu w modelach noworodków myszy można dokładnie i skutecznie określić w porównaniu z istniejącymi metodami.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ indukcja malformacji jamistych mózgu i etapy analizy mikro-CT są trudne do nauczenia, ponieważ wymagają doświadczenia i użycia zaawansowanego oprogramowania. Zacznij od rozpuszczenia 4-HT w 100% etanolu do stężenia 10 miligramów na mililitr. Przygotuj 30 mikrolitrów alaquadów, a następnie przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
W dniu użycia rozcieńczyć alaquad w 4-HT w oleju kukurydzianym do 0,5 miligrama na mililitr. Następnie za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć śródżołądkowo 50 mikrolitrów 4-HT nowonarodzonym szczeniętom P1 w celu wywołania eksperymentalnych zmian CCM. Przygotowanie próbki należy rozpocząć od napełnienia 10-mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 29 trzema mililitrami 2% paraformaldehydu i PBS.
Następnie wykonaj obfitość wewnątrzsercową na eutenizowanym szczenię P8, wkładając igłę do komory serca myszy i powoli wstrzykując pełną objętość paraformaldehydu. Po użyciu nożyczek do oderwania głowy, usuń skórę z głowy i oderwij czaszkę za pomocą kleszczy, aby wypreparować cały mózg na 4% paraformaldehyd i PBS. Po naprawie mózgu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza.
Następnego dnia odłącz tylne mózgowie za pomocą kleszczy i spłucz roztworem PBS. Następnie inkubuj tylne mózgowie w roztworze jodu Lugola przez 48 godzin. Po inkubacji należy krótko wysuszyć tylne mózgowia na powietrzu, aby usunąć nadmiar roztworu jodu Lugola.
Następnie zapakuj poplamione jodem tylne mózgowie Lugola w probówkach do mikrowirówek o pojemności 0,65 mikrolitra i całkowicie uszczelnij plastikową folią parafinową, aby uniknąć kurczenia się tkanek. Umieść probówki mikrowirówkowe w pięciomililitrowych plastikowych probówkach z gąbkami, aby zapobiec ich przesuwaniu się podczas skanowania. Zamontuj pionowo rurkę zawierającą tylny mózg na aluminiowym uchwycie w systemie micro-CT.
Ustaw parametry skanowania. Użyj 540 projekcji i dwusekundowego czasu naświetlania przy warunkach źródłowych 50 kilowoltów i 10 watów, aby uzyskać zestawy danych tomograficznych. Wykresy radiowe ze skanu są rekonstruowane automatycznie przez sprzętowe oprogramowanie do rekonstrukcji projekcyjnej, dostarczane przez system mikro-CT, tworząc serię obrazów 16-bitowych wycinków osiowych.
Kontrast z jodem Lugola w mikrotomografii komputerowej dostatecznie wykrył zmiany CCM. Zeskanowane obrazy rentgenowskie zrekonstruowano w celu uzyskania obrazów 3D mózgu myszy, co pozwoliło na wizualizację całych zmian w miąższu mózgu, na różnych głębokościach i orientacjach, oraz ocenę struktury w lokalizacji 3D zmian w mózgu. Poniższa tabela przedstawia przykładową wydajność ilościową oznakowanych poszczególnych zmian.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami naczyniowymi do zbadania mechanizmów i opcji terapeutycznych malformacji jamistych mózgu w modelach mysich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać zmianę CCM w modelach mysich oraz jak uzyskać i przeanalizować obciążenie zmianami CCM za pomocą techniki mikro-CT.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół demonstruje indukcję choroby naczyniowych malformacji jaskiniowatych mózgu u noworodkowych myszy oraz wykorzystanie mikro-tomografii komputerowej (micro-CT) do pomiaru obciążenia zmian chorobowych. Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie podstaw molekularnych oraz potencjalnych terapii naczyniowych malformacji jaskiniowatych mózgu oraz innych chorób naczyniowo-mózgowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyniowa
- Modele mysie
Wstęp
- Mózgowe malformacje kawernozy (CCMs) to zmiany naczyniowe, które mogą prowadzić do istotnych problemów neurologicznych.
- Istniejące metody pomiaru obciążenia chorobowego w modelach mysich są często nieefektywne.
- Mikrotomografia komputerowa (micro-CT) oferuje nieinwazyjny sposób wizualizacji i ilościowego określania zmian.
- Zrozumienie CCMs może dostarczyć wiedzy na temat innych chorób naczyniowo-mózgowych.
Cel badania
- W celu wywołania malformacji jamistych splotu naczyniowego mózgu u noworodkowych myszy.
- W celu dokładnego pomiaru obciążenia chorobowego przy użyciu mikro-CT.
- W celu udoskonalenia metodologii badania chorób naczyniowych mózgu.
Zastosowane metody
- Rozpuszczanie 4-HT w etanolu w celu przygotowania roztworu do indukowania CCMs.
- Przygotowanie alikwotów do przechowywania w temperaturze -80 °C.
- Wykorzystanie mikro-CT z kontrastem do obrazowania.
- Wizualna demonstracja procesu indukcji i analizy.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na dokładne i wydajne określenie stopnia obciążania organizmu chorobą CCM.
- Mikro-CT zapewnia wyraźną wizualizację zmian w modelach mysich.
- Indukcja CCMs została pomyślnie przeprowadzona u noworodków myszy.
- Podejście to może ułatwić dalsze badania nad potencjalnymi terapiami.
Wnioski
- Niniejszy protokół zwiększa wartość modeli mysich w badaniach nad CCM.
- Mikro-CT jest potężnym narzędziem do oceny obciążenia chorobami naczyniowymi mózgu.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodologii w celu eksploracji opcji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe obrazowanie mikro-CT w obrębie naczyniowych malformacji jamistych (CCM) w genetycznie zmodyfikowanych modelach mysich umożliwia precyzyjną ocenę obciążenia zmianami, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego oraz walidację celów w badaniach nad chorobami naczyniowymi mózgu. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną podczas wczesnych etapów testowania hipotez terapeutycznych i pozwala na optymalizację portfela projektów poprzez dostarczenie solidnej, powtarzalnej kwantyfikacji zmian. Integracja obrazowania o wysokiej rozdzielczości z genetycznymi modelami chorób sprawia, że ten schemat postępowania stanowi kluczowy punkt zwrotny dla ciągłości translacyjnej w badaniach nad biologią naczyń.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę funkcji genów CCM oraz ich udziału w szlakach sygnałowych w modelach chorób.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez kwantyfikację powstawania zmian po ukierunkowanej delecji genów.
- Zapewnia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośredni pomiar fenotypów istotnych dla przebiegu choroby.
- Ułatwia zwiększenie pewności prognostycznej przy wyborze lub odrzucaniu celów molekularnych do dalszych badań.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Tworzy zwalidowane modele mysie oraz protokoły obrazowania do późniejszego screeningu związków.
- Dostarcza standaryzowane, ilościowe parametry zmian chorobowych, odpowiednie do opracowywania testów i oceny powtarzalności.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę interwencji terapeutycznych w warunkach przedklinicznych.
- Wspiera wiarygodne porównywanie warunków eksperymentalnych dzięki spójnym wynikom obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie modeli przedklinicznych do genetyki chorób ludzkich w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć genetycznych do przedklinicznej walidacji hipotez terapeutycznych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez dostarczenie ilościowych punktów końcowych dla progresji choroby i skuteczności interwencji.
- Wzmacnia zrozumienie mechanizmów patologii naczyniowej mózgu istotnych dla translacji klinicznej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta łączy wczesny etap odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając sterowaną hipotezą manipulację genetyczną oraz ilościowe fenotypowanie w modelach mysich, co wspiera identyfikację wiodących związków oraz dostosowanie biomarkerów translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez indukcję i kwantyfikację uszkodzeń genetycznych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki obrazowania do oceny gotowości testów i ewaluacji związków.
- Analityka: Dostarcza wolumetryczne i numeryczne dane o uszkodzeniach w celu wsparcia porównań statystycznych między grupami eksperymentalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy modele genetyczne z punktami końcowymi istotnymi dla przebiegu choroby w celu zachowania ciągłości badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania i analizy dla różnych programów badań naczyniowo-mózgowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje kwantyfikację zmian chorobowych oraz procesy obrazowania w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez dostarczenie rzetelnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badań nad chorobami naczyniowymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z genetycznymi modelami mysimi oraz w protokołach obrazowania mikro-CT.
- Wymaga dostępu do wysokorozdzielczego sprzętu mikro-CT oraz specjalistycznego oprogramowania analitycznego.
- Konieczna jest standaryzacja parametrów obrazowania i interpretacji danych pomiędzy zespołami.
- Może wymagać dostosowania protokołów do różnychy tła genetycznego lub typów zmian chorobowych.
- Zależne od precyzyjnego przygotowania próbek i warunków obrazowania w celu zapewnienia jakości danych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:57
Induction of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Models
1:38
Sample Preparation for Micro-CT Scans
3:15
Micro-CT Scan of CCM in the Neonatal Mouse Brain
3:57
Results: Rendered 3-D Images Showing CCM Lesions in the Neonatal Mouse
4:34
Conclusion
