4.9: Barwniki FM w recyklingu pęcherzyków

Barwniki FM to barwniki membranowe, które są szeroko stosowane do obrazowania recyklingu pęcherzyków. Jest to proces, w którym komórka tworzy pęcherzyki z własnej błony, aby zachować rozmiar komórki, ponownie wykorzystać drogie białka i kolejno transportować cząsteczki do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Proces ten jest najczęściej badany w synapsach neuronalnych, gdzie bierze udział w uwalnianiu neuroprzekaźników. Oprócz badania recyklingu pęcherzyków, barwniki FM są wykorzystywane do badania kilku innych zjawisk, takich jak wydzielanie w komórkach chromochłonnych i naprawa błony komórkowej po urazie.

Ten film skupi się na zastosowaniu barwników FM w eksperymencie badającym recykling pęcherzyków. Omówimy krok po kroku protokół, który wykorzystuje barwniki FM do ilościowego określenia procesu recyklingu w stymulowanych neuronach. Na koniec przyjrzymy się kilku przykładowym eksperymentom, które wykorzystują tę unikalną cząsteczkę na różne sposoby.

Zanim przejdziemy do procedury, przyjrzyjmy się najpierw właściwościom biochemicznym barwników FM, które pomogą nam zrozumieć ich funkcję w eksperymentach z recyklingiem pęcherzyków.

Strukturalnie barwniki FM to cząsteczki styrylu, które swoją nazwę zawdzięczają naukowcowi, który je zsyntetyzował - Fei Mao. Barwniki te mają trzy główne cechy strukturalne: głowę, ogon i mostek. Mostek składa się z dwóch aromatycznych pierścieni ze zmiennym podwójnym obszarem wiązania między nimi. Cała ta sekcja tworzy fluorofor.

Naturą każdego fluoroforu jest to, że po uderzeniu przez przychodzące światło o określonej długości fali wzbudzenia, jego atomy pochłaniają tę energię i podnoszą jego elektrony do stanu wzbudzonego. Elektrony te powracają do stanu podstawowego, emitując energię wibracyjnie, a ostatecznie jako światło o długości fali emisyjnej. Hydrofobowy ogon umożliwia cząsteczki FM podział na dwuwarstwy lipidowe błony komórkowej, a jej hydrofilowa głowa ma ładunek, który ogranicza jej lokalizację do zewnętrznej ulotki błony.

Dlatego jedynym sposobem, w jaki może dostać się do komórki, jest endocytoza. Barwniki FM są bardzo wrażliwe na środowisko i wykazują słabą fluorescencję w rozpuszczalnikach polarnych, ale silną fluorescencję w środowiskach hydrofobowych, takich jak membrany. W ten sposób powstaje etykietowanie membranowe o wysokim kontraście, które można wizualizować i określać ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Te właściwości sprawiają, że barwniki FM są szczególnie odpowiednie do oceny recyklingu pęcherzyków w synapsach. Krótko mówiąc, proces polega na inkubacji kultur za pomocą barwnika FM. Część cząsteczek FM przyczepia się do błon, co znacznie zwiększa ich intensywność fluorescencji. Następnie bodziec inicjuje proces internalizacji błony. Dlatego niektóre cząsteczki FM są uwięzione w błonie pęcherzyka, a reszta zewnętrznych zlokalizowanych cząsteczek barwnika jest wypłukiwana.

Przy drugiej stymulacji zinternalizowane barwione pęcherzyki łączą się z błoną komórkową, aby uwolnić swoją zawartość, a barwnik szybko ulega rozkładowi, co powoduje szybki spadek intensywności fluorescencji. To odbarwienie można określić ilościowo za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Teraz, gdy jesteś już zaznajomiony z biochemicznymi zasadami barwników FM, przyjrzyjmy się procedurze, jak przeprowadzić eksperyment badający recykling pęcherzyków synaptycznych przy użyciu tych barwników.

Czyste, zdrowe próbki kultur neuronalnych na szkiełkach nakrywkowych są przygotowywane z wyprzedzeniem. Komórki te są przenoszone do roztworu barwnika FM, co powoduje znakowanie błon. Szkiełko nakrywkowe z próbką jest następnie umieszczane w komorze obrazowania mikroskopu.

Aby umożliwić manipulacje płynami, takie jak mycie, linie wejściowe i wyjściowe płynów są podłączone, tworząc szczelną komorę perfuzyjną. Zamontuj komorę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Podłącz przewody do komory i podłącz je do stymulatora elektrycznego. Po zamontowaniu filtry wzbudzenia i emisji są ustawiane zgodnie z zastosowanym barwnikiem FM.

Ładowanie barwnika do pęcherzyków poprzez endocytozę jest indukowane za pomocą stymulacji elektrycznej. Po stymulacji zakończenia nerwowe mogą się zregenerować. Następnie barwnik zewnątrzkomórkowy zmywa się buforem; Minimalizuje to również fluorescencję tła. Ważne jest, aby intensywność wzbudzenia była minimalna, ponieważ barwniki FM są podatne na fotowybielanie, czyli osłabienie intensywności fluorescencji z powodu przedłużonego wzbudzenia. Po krótkiej inkubacji uzyskuje się wstępne obrazy. Następnie egzocytoza jest indukowana drugim sygnałem elektrycznym.

Po zmierzeniu fluorescencji w różnych punktach czasowych po stymulacji, na końcu, zakończenia nerwowe mogą być wyczerpująco stymulowane do rozładowania całego uwalnianego barwnika. Fluorescencja pozostała po tym czasie jest uważana za intensywność fluorescencji tła. Następnie mierzy się wewnętrzną fluorescencję każdego obrazu za pomocą narzędzia "Region of Interest" w niesynaptycznym obszarze obrazu. Fluorescencja tła i fluorescencja wewnętrzna są następnie odejmowane od intensywności fluorescencji każdego punktu czasowego, aby uzyskać znormalizowaną intensywność fluorescencji, która jest następnie wykreślana w funkcji czasu. Spadek intensywności w czasie reprezentuje odbarwienie, które jest pośrednią miarą recyklingu pęcherzyków.

Teraz, gdy dokonaliśmy przeglądu metodologii, przyjrzyjmy się, w jaki sposób barwniki FM są używane w konkretnych eksperymentach.

Omówiliśmy protokół wykorzystujący barwniki FM w stymulowanych neuronach. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani badaniem spontanicznego recyklingu pęcherzyków. Dokonali tego przy użyciu ustalonego protokołu w połączeniu z systemem obrazowania wystarczająco czułym, aby wykryć niewielkie zmiany w intensywności fluorescencji. Wyniki wskazują na spadek intensywności fluorescencji, który jest bezpośrednio spowodowany spontanicznym uwalnianiem synaptycznym.

W obrębie neuronu presynaptycznego pęcherzyki są podzielone na dwie pule: pulę rezerwową lub RP i pulę łatwo uwalnialną lub RRP. W tym przypadku naukowcy wykorzystali barwniki FM do analizy frakcji każdego typu w populacji pęcherzyków. Poprzez sekwencyjne stosowanie bodźców elektrycznych o rosnącym natężeniu, naukowcy byli w stanie określić ilościowo względną zawartość procentową każdego rodzaju puli pęcherzyków.

Wreszcie, biolog komórkowy używa również barwników FM do analizy czynników zaangażowanych w egzocytarną naprawę uszkodzonych błon plazmatycznych. W tym eksperymencie naukowcy skupili się w szczególności na roli sfingomielinazy, enzymu modyfikującego stężenie lipidów, w procesie ponownego uszczelniania błony. Po pierwsze, wygenerowali komórki z niedoborem enzymu sfingomielinazy za pomocą wyciszającego leczenia RNA. Następnie potraktowali te komórki i grupę kontrolną egzogennym barwnikiem FM i toksyną, która tworzy zmiany w błonie komórkowej. Na koniec obejrzeli wszystkie próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego. Wyniki pokazały, że komórki z niedoborem sfingomielinazy wykazywały silną akumulację wewnątrzkomórkowych cząsteczek FM. Z drugiej strony, komórki kontrolne wykazywały minimalny napływ FM, co sugeruje rolę sfingomielinazy w naprawie błony plazmatycznej.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat barwników FM w recyklingu pęcherzyków. Film opisywał biochemię barwników FM, szczegółowo opisywał protokół barwienia i ilościowego oznaczania recyklingu pęcherzyków synaptycznych, a na koniec nakreślił obecne eksperymenty z wykorzystaniem tych barwników na różne sposoby. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!