Podstawowy model ludzkiego trofoblastu do badania wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością matki na regulację autofagii w łożysku

Ogólnym celem tego modelu hodowli komórek trofoblastu jest zmierzenie wpływu stanu zapalnego związanego z otyłością na regulację krytycznych szlaków w trofoblastach. Główną zaletą tego systemu kontroli jest ustalenie związku między stanem zapalnym za pośrednictwem TNF alfa a regulacją genów w łożysku w kontekście otyłości matki. Główną zaletą tego eksperymentalnego systemu jest ustalenie związków między stanem zapalnym, w którym pośredniczy TNF-alfa, a regulacją genów w łożysku w kontekście otyłości matki.

Procedurę zademonstrują Bailey Simon i Matt Bucher, technicy z mojego laboratorium. Tkankę kosmkową należy pobrać z łożyska jak najszybciej po porodzie, najlepiej w ciągu 30 minut lub krócej. Z płytką kosmówkową skierowaną do góry, użyj kleszczy i nożyczek, aby losowo wyciąć od dwóch do trzech odcinków o pełnej grubości, od dwóch do trzech centymetrów od obrzeża łożyska.

Unikaj części łożyska, które wydają się nieprawidłowe. Odetnij płytki kosmówkowe i podstawne oraz wszelkie duże naczynia krwionośne. Umieść powstałą tkankę kosmkową w ciepłym, kompletnym podłożu.

W ciągu 30 minut od pobrania próbek z tkanek kosmków rozpocznij izolację trofoblastu. Umieść każdy kawałek tkanki kosmkowej w 50-mililitrowej stożkowej probówce wypełnionej PBS o temperaturze pokojowej i delikatnie mieszaj, aby uwolnić nadmiar krwi w tkance. Zdekantować PBS i zastąpić go świeżym.

Powtarzaj płukanie PBS, aż większość nadmiaru krwi zostanie usunięta. Płukanie PBS będzie jasnoczerwone lub różowe, gdy chusteczka zostanie dokładnie spłukana. Umieść tkankę kosmków na sterylnej szalce Petriego i usuń jak najwięcej naczyń krwionośnych za pomocą szkiełka mikroskopowego, aby delikatnie zeskrobać miękką tkankę kosmków z naczyń.

Za pomocą nożyczek drobno zmiel powstałą tkankę kosmkową. Przenieść zmieloną tkankę kosmkową do sterylnej butelki z roztworem wytrawiającym zgodnie z obliczonymi objętościami na podstawie specyficznej aktywności trypsyny i DNazy. Inkubuj butelkę do trawienia w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 70 obr./min przez 35 minut.

Po 35 minutach przechyl butelkę na bok i pozwól, aby niestrawione kawałki tkanki osiadły na dnie butelki. Ostrożnie pobrać supernatant za pomocą pipety serologicznej, omijając osiadłą tkankę. Dozować supernatant przez sitko do komórek o średnicy 100 mikronów równomiernie między 50-mililitrowymi stożkowymi probówkami.

Rozpocznij drugie trawienie, dodając roztwór trawiący do pozostałej osiadłej tkanki i inkubując butelkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Delikatnie ułóż od trzech do pięciu mililitrów surowicy cielęcej nowonarodzonego cielęcia pod odcedzonym supernatantem od pierwszego trawienia, powoli dozując z pipety serologicznej na dnie probówki. Powinna być widoczna łąkotka między odcedzonym supernatantem zawierającym trofoblasty a NCS.

Odwirować supernatanty nad NCS w temperaturze 1 250 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Powstały osad będzie zawierał czerwone krwinki w najniższej warstwie, a następnie białą warstwę zawierającą komórki trofoblastu. W ten sam sposób odcedź supernatant z drugiego i trzeciego trawienia.

Ułożyć NCS pod odcedzonym supernatantem i odwirować w temperaturze 1 250 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Po odwirowaniu wszystkich supernatantów i usunięciu warstw NCS i supernatantu, ponownie zawiesić każdą osadkę w pięciu mililitrach ciepłej, kompletnej pożywki, a następnie połączyć zawiesiny. Podziel zawiesinę komórek równo między dwie 50-mililitrowe stożkowe probówki i odwiruj w temperaturze 1 250 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Delikatnie usuń supernatant i ponownie zawieś każdą z osadów komórkowych w sześciu mililitrach ciepłego, kompletnego podłoża. Aby rozpocząć tę procedurę, należy równo podzielić zawiesinę komórek między cztery gradienty gęstości za pomocą pipety transferowej, aby powoli i ostrożnie nałożyć zawiesinę komórek na gradienty gęstości. Odwirować gradienty gęstości z prędkością 1 250 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 20 minut z minimalnym przyspieszaniem i zwalnianiem.

Powinno to wytworzyć wyraźne pasma osadzonych komórek. Powoli i ostrożnie usuwać górną warstwę podłoża gradientowego o dużej gęstości, aż do osiągnięcia nieprzezroczystego pasma zawierającego komórki trofoblastu. Przenieś pasma trofoblastu do dwóch 50-mililitrowych stożkowych probówek i napełnij ciepłym, kompletnym podłożem.

Delikatnie odwróć probówki od trzech do sześciu razy, aby wymieszać i odwirować w temperaturze 1 250 razy g w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 15 minut. Usuń supernatant i ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w pięciu mililitrach ciepłego, kompletnego podłoża. Połącz zawiesiny komórek i policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i błękitu trypanowego.

Następnym krokiem po zliczeniu komórek jest płytka komórek. Umieść trzy miliony komórek na studzience w każdej płytce sześciodołkowej. Delikatnie kołysz płytką w przód iw tył oraz na boki, aby równomiernie rozprowadzić komórki.

Pozostaw platerowane komórki w otworze wentylacyjnym z przepływem laminarnym na około 30 minut, aby komórki równomiernie się rozprowadziły, osiadły i zaczęły przylegać do dna studzienek. Po 30 minutach umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla i wilgotnością 95%. Zbadaj trofoblasty pod mikroskopem po 24 godzinach hodowli, aby potwierdzić przyłączenie i prawidłową morfologię trofoblastu.

Komórki można poddać działaniu środka po 24 godzinach hodowli. Odessać pożywkę hodowlaną z komórek i zastąpić dwoma mililitrami pożywki uzupełnionej TNF alfa na dołek. Włóż płytki do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 24 godzinach ekspozycji na TNF alfa należy zastąpić pożywkę uzupełnioną TNF alfa kompletną pożywką. Inkubować przez kolejne 24 godziny. 24 godziny po usunięciu TNF alfa odessać pożywkę i delikatnie przepłukać komórki PBS o temperaturze pokojowej.

Dodać bezpośrednio do każdej studzienki 80 mikrolitrów lodowatego buforu do oznaczania radioimmunoprecypitacji zawierającego świeżo dodane inhibitory proteazy i fosfatazy. Usuń komórki z płytki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś komórki do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej, łącząc studzienki w grupach poddanych zabiegowi.

Zamrozić komórki, wirując rurki na wysokich obrotach przez co najmniej trzy odstępy po 15 sekund. Inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, kołysząc przez 15 minut. Ponownie przekręć rurki na wysokie temperatury.

Wirować przy 10 000 g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby osadzać resztki komórkowe. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowuj próbki białek komórkowych w temperaturze 80 stopni Celsjusza do czasu analizy za pomocą Western blot dla interesującego nas białka.

Po 72 godzinach hodowli analiza immunocytochemiczna cytokeratyny 7, zaznaczonej na czerwono, w pierwotnych trofoblastach potwierdza, że komórki uległy syncjalizacji, o czym świadczy obecność wielojądrzastych mas komórkowych. Co więcej, analiza immunocytochemiczna wimentyny, również w kolorze czerwonym, wykazała bardzo mało zanieczyszczających fibroblastów. Jądrowe barwienie przeciw jest pokazane na niebiesko na obu obrazach.

Leczenie TNF alfa do 250 pikogramów na mililitr w górę regulowanego ekspresji rubikonu. Przy stężeniach TNF alfa większych niż 250 pikogramów na mililitr, poziomy ekspresji rubikonu spadły z powrotem do wartości wyjściowej, a nawet poniżej. Podobnie, rubikon jest znacznie podwyższony w biopsjach tkanek kosmkowych zamrażanych błyskawicznie z łożysk z otyłych ciąż z płodami płci żeńskiej w porównaniu z grupą kontrolną szczupłą.

Po opanowaniu izolację trofoblastów z tkanki kosmkowej można wykonać w ciągu sześciu do siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby przygotować materiały i odczynniki z wyprzedzeniem, aby móc pracować celowo i wydajnie. Po tej procedurze można przeprowadzić inne testy, takie jak te, które mierzą bioenergetykę komórkową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak czy stan zapalny w środowisku wewnątrzmacicznym otyłości wpływa na zdolność metaboliczną trofoblastów?

Po tym procesie metoda rozwoju utorowała drogę badaczom łożyska do ustalenia wpływu środowiska matki na funkcję trofoblastu. Po obejrzeniu tego filmu będziesz miał dobre zrozumienie, jak wyizolować trofoblasty z tkanki kosmkowej do eksperymentu z hodowlą komórkową i jak określić wpływ zapalenia za pośrednictwem TNF alfa na regulację krytycznych szlaków w trofoblastach. Nie zapominaj, że praca z tkankami ludzkimi, hodowanymi komórkami, DMSO, akrylamidem i odczynnikami redukującymi może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej i stosowanie technik aseptycznych.