Name: Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Poznaj metodę badania infekcji grzybiczych u nicieni Caenorhabditis elegans jako modelu in vivo. Technika ta pozwala analizować czynniki wirulencji patogenów i odpowiedzi immunologiczne gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wykonana i wspierana przez Worcester Polytechnic Institute.

1. Przygotowanie pożywki dla nicieni (NGM)
<ol>
	<li>Na 1 l pożywki należy połączyć 20 g agaru, 2,5 g organicznego źródła azotu (np. baktopeptonu) i 3 g chlorku sodu w kolbie o pojemności 2 l. Dodaj 975 ml sterylnej wody.
	<ol>
		<li>Dodaj sterylną mieszankę. W przypadku korzystania z automatycznego nalewaka mediów, rurki autoklawu i media przez 15 minut; Nośniki powinny być sterylizowane w autoklawie przez dłuższy czas, jeśli wytwarzana jest większa objętość.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść media na mieszance i pozostaw do ostygnięcia.
	<ol>
		<li>Gdy podłoże jest ciepłe w dotyku (około 60 °C), należy w asepcie dodać 1 ml 1 M MgSO4● H2O, 1 ml 1M CaCl2, 25 ml KPO4 i 1 ml 0,5% cholesterolu w etanolu.</li>
		<li>Wlać pożywkę (ręcznie lub za pomocą pompy automatycznej) pod przepływem laminarnym do sterylnych szalek Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm. Pozostawić do wyschnięcia pod kapturem na 1-2 dni przed użyciem. 
		UWAGA: Płytki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wybieranie robaków
<ol>
	<li>Wytnij 1,5 cm kawałek drutu aluminiowego. Ostrożnie włóż około 0,5 cm tej długości do końcówki pipety Pasteura.
	<ol>
		<li>Za pomocą palnika Bunsena lub lampy alkoholowej rozpuść szklaną końcówkę pipety, powoli obracając ją w płomieniu, aż drut zostanie bezpiecznie przyklejony do pipety, nie naruszając przy tym oryginalnego kształtu końcówki pipety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie kultury E. coli
<ol>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli zaszczepić pojedynczą kolonię szczepu E. coli OP50 w 200 ml bulionu Luria. Inkubować przez noc, wytrząsając w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Płynna kultura jest gotowa do użycia następnego dnia i może być przechowywana w temperaturze 4 °C, gdy nie jest używana. 
	UWAGA: Szczep E. coli, OP50, jest używany jako źródło pożywienia dla C. elegans. Kultura ta może być używana przez okres do kilku miesięcy, jeśli jest przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
4. Niezbędna konserwacja C. elegans
<ol>
	<li>Przygotuj nasiona płytek agarowych NGM z E. coli, nakrapiając około 50 - 100 μl przygotowanej płynnej kultury OP50 na środku płytki.</li>
	<li>Przykryj płyty i pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Po wyschnięciu umieść płytki w temperaturze 37 °C na noc, aby uzyskać szybki wzrost lub przechowuj w temperaturze pokojowej, jeśli pożądany jest wolniejszy wzrost.</li>
	<li>Dodaj robaki do talerza poprzez "krojenie" (patrz krok 5 protokołu "Chunking i zbieranie robaków"), zbieranie robaków pojedynczo lub umieszczanie jaj robaków bezpośrednio na talerzu (patrz krok 6 protokołu "Przygotowanie jaj").</li>
</ol>
5. Porcjowanie i zbieranie robaków
UWAGA: "Chunking" odnosi się do praktyki, która jest powszechna w utrzymaniu C. elegans. Polega to na przecięciu części płytki agarowej NGM, która zawiera robaki, i przeniesieniu tego kawałka na nową płytkę, przenosząc w ten sposób również dużą liczbę robaków w tym procesie. W ten sposób można również wyciąć zanieczyszczenia z płyty. Podczas zbierania robaków ważne jest, aby zachować integralność agaru, ponieważ robaki mogą zostać zgubione w otworach w agarze . Ponadto ważne jest, aby przed dotknięciem płytki pozwolić kilofowi ostygnąć, aby zapobiec stopieniu agaru lub spaleniu robaków.
<ol>
	<li>W celu szybkiego przeniesienia dużych ilości robaków na nowe płytki, za pomocą szpatułki należy wyciąć kawałek agaru NGM zawierający wybrane robaki. Usuń wycięty kawałek i połóż go ekranem do dołu na krawędzi trawnika OP50 na nowej płycie.</li>
	<li>Przenoś robaki pojedynczo, jak opisano poniżej w kroku 8.2 protokołu "Test przeżycia", używając kilofa do robaków. Podpal drut w ślimakowym kilofie, aż stanie się czerwony. Zdejmij go z płomienia i pozwól mu ostygnąć przez kilka sekund.</li>
	<li>Używając drutu na kilofie, delikatnie zeskrob trawnik z kultury OP50 wyhodowanej na nowej płycie, zakrywając drut na kilofie.</li>
	<li>Lepka kultura pokrywająca końcówkę drutu sprawia, że robaki przyklejają się do końcówki kilofa, dzięki czemu delikatnie podnoszą wybrane robaki ruchem machnięcia.</li>
	<li>Po zebraniu wybranych robaków umieść je na nowej płytce, delikatnie przesuwając kulturę po agarze . Umieść drut w płomieniu, aby usunąć pozostałą kulturę z kilofa.</li>
</ol>
6. Przygotowanie jajek
<ol>
	<li>Umieścić około 20 dorosłych zwierząt (około 2 - 3 dni po wykluciu, gdy są hodowane w temperaturze 20 °C) poprzez zrywanie lub fragmentowanie, jak opisano w kroku 5 protokołu "Chunking and Picking Worms" na talerzu wysianym 50 μl szczepu E. coli, OP50.</li>
	<li>Aby zebrać jaja, po 1-2 dniach zalej płytkę 10 ml buforu M9. Za pomocą szklanej pipety serologicznej zamieszaj i delikatnie wymieszaj zawartość na płytce agarowej, aby uwolnić jaja przyklejone do OP50 lub dorosłych zwierząt. Zbierz cały płyn zawierający jaja i dorosłe osobniki.</li>
	<li>Przenieść roztwór M9 i OP50 do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować 15 ml stożkowej probówki o stężeniu 2 100 x g przez 2 min.</li>
	<li>Odessać około 9 ml supernatantu, nie naruszając osadu OP50.</li>
	<li>Zawiesić osad w 2 ml sterylnej wody, 1 ml wybielacza i 1 ml 0,25 M NaOH.</li>
	<li>Mieszaj delikatnie przez odwrócenie, aż większość (około 70 procent) dorosłych zwierząt będzie wyglądać na zlizowaną; zazwyczaj jaja pozostają nienaruszone podczas tego krótkiego wybielania ze względu na ich skorupę. Odwirować stożkową probówkę o masie 990 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Odessać supernatant bez naruszania osadu. Ponownie zawiesić osad w 10 ml buforu M9.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 990 x g przez 2 minuty. Odsysać supernatant bez naruszania osadu. Zawiesić osad z 200 μl buforu M9. 
	UWAGA: Przygotowanie jaj może wymagać wielu prób. Jaja mogą zostać zniszczone, jeśli są zbyt długo wystawione na działanie wybielacza. Jeśli jaja się nie wyklują, zmniejsz stężenie wybielacza w roztworze lub skróć czas ekspozycji na wybielacz.</li>
</ol>
7. Ustawienie tabliczki infekcyjnej
<ol>
	<li>Dozuj 3-5 ml YPD do sterylnej probówki i zaszczep ją pojedynczą kolonią Candida albicans za pomocą sterylnej pętli.
	<ol>
		<li>Umieścić probówkę na bębnie obrotowym na około 16-18 godzin w temperaturze 30 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz jedną probówkę o pojemności 1,5 ml do mikrofuge, aby zawierała C. albicans, a drugą jako zawierającą OP50. Zapisz wagę każdej pustej tuby.
	<ol>
		<li>Umieścić 500 μl nocnej kultury C. albicans w probówce oznaczonej C. albicans i 1 500 μl nocnej kultury OP50 (od kroku 3.1) do probówki oznaczonej OP50.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 16 100 x g. Odsysać supernatant bez zakłócania osadu.</li>
		<li>Zawiesić każdą granulkę w 500 μl sterylnej wody. Wirować przez 5 minut przy 16 100 x g.</li>
		<li>Odessać supernatant bez naruszania osadu. Zapisz ostateczną wagę probówek do mikrofuge.</li>
		<li>Określ wagę każdej granulki, odejmując początkową wagę probówek do mikrofuge od końcowej wagi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Używając sterylnej wody, ponownie zawiesić granulkę C. albicans na 10 mg/ml, a pastylkę OP50 na 200 mg/ml. Przygotuj główną mieszankę infekcji, łącząc 10 μl 50 mg/ml roztworu streptomycyny, 2,5 μl kultury OP50, 0,5 μl kultury C. albicans i 7 μl sterylnej wody.
	<ol>
		<li>W przypadku płytek kontrolnych należy utworzyć mieszankę wzorcową, zastępując objętość kultury C. albicans sterylną wodą. Wysiewać 20 μl mieszanki infekcyjnej lub roztworu kontrolnego OP50 na środek płytek NGM za pomocą mikropipety. 
		UWAGA: Do określenia istotności statystycznej podczas analizy potrzeba około 100 robaków. Ten test jest zwykle przeprowadzany w trzech egzemplarzach. W ten sposób powstaje 3,2-krotna mieszanka infekcji, a także 3,2-krotne rozwiązanie kontrolne. Mieszanki te są wykonane tak, aby były nieco ponad 3 razy większe niż oryginalne, aby zapewnić, że pełne 20 μl zostanie wysiane na każdą płytkę, co pozostawia miejsce na błędy. Ta główna mieszanka powstaje, ponieważ gardło robaka jest zbyt małe w początkowych stadiach larwalnych (L1-L3), aby spożywać C. albicans. W przypadku ekspozycji na środki farmakologiczne, takie jak flukonazol (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B), środek wprowadza się do mieszaniny infekcyjnej. Stężenie środka określa się empirycznie. Na przykład w Rysunek 3B, 50 μM Flukonazol jest reprezentowany, jednak 0, 12,5, 25, 50 i 100 μM Flukonazol były również testowane przy użyciu tego samego protokołu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Analiza fenotypu zdeformowanego regionu odbytu (Dar) i test przeżycia
<ol>
	<li>Wizualizacja fenotypu Dar 
	UWAGA: Dar najlepiej wizualizować na etapie L3 i później. Dar przedstawia się jako mały występ w okolicy postanalnej robaka (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A), który z czasem staje się bardziej widoczny.
	<ol>
		<li>Potwierdź, czy zwierzę ma Dar, szybko stukając w płytkę na stoliku mikroskopu preparacyjnego; zwierzęta bez Dar natychmiast się cofną, podczas gdy zwierzęta z Darem będą potrzebowały wielokrotnych rund stukania, aby odwrócić swój kierunek, lub nie zrobią tego wcale.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test przeżycia
	<ol>
		<li>Kompletne przygotowanie jaj zgodnie z wcześniejszym opisem w kroku 6 protokołu "Przygotowanie jaj". Policz jaja pod zakresem sekcji i rozcieńcz roztwór jaj M9, aż do uzyskania stężenia około 5-6 zdrowych jaj na μl. Za pomocą pipety dozować 20 μl próbki zawierającej około 30 jaj na przygotowaną płytkę NGM, w obszarze między kulturą bakteryjną a bokiem płytki (jaja i pokarm dla robaków, OP50, znajdują się w dwóch różnych miejscach).</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 20 °C przez 48 godzin. Pod mikroskopem preparacyjnym policz liczbę żywych i martwych dorosłych robaków na każdej płytce, a także liczbę robaków z Darem. Zapisz procent za pomocą Dara.</li>
		<li>Rozważ martwe zwierzę, jeśli nie reaguje na stuknięcie w głowę aluminiowym drutem lub stukanie w talerz.</li>
		<li>Co drugi dzień przenoś pozostałe dorosłe robaki, zbierając je zgodnie z opisem w kroku 5 protokołu "Chunking and Picking Worms" na nową płytkę infekcyjną lub kontrolną. W tym momencie, jeśli to konieczne, wykonaj test przeżycia, śledząc liczbę żywych, martwych i brakujących robaków każdego dnia. 
		UWAGA: Ten test może trwać dwa tygodnie, zaczynając od przygotowania jaj. Ponadto roztwór jaj nie powinien być dozowany do kultury bakteryjnej, ponieważ roztwór może zawierać śladowe ilości wybielacza, który może zabić OP50. Roztwór należy również dozować w odległości około 0,5 cm od krawędzi płytki, ponieważ jajka mogą utknąć między bokami talerza a agarem. Dodatkowo, ze względu na szybkie rozprzestrzenianie się robaków, przeniesienie dorosłych osobników na nowe płytki ma kluczowe znaczenie dla oddzielenia ich od potomstwa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj przetrwanie
	<ol>
		<li>Analizuj wyniki za pomocą oprogramowania do analizy krzywych przeżycia (patrz lista materiałów).</li>
		<li>Porównaj krzywe przeżycia za pomocą metody Grehana-Breslowa-Wilcoxona (zakładając, że dane z wczesnych czasów przeżycia są dokładniejsze niż późniejsze, odpowiednio zważ dane), a także narzędzi statystycznych Logrank45. 
		UWAGA: Na przykład w Rysunek 4B-C, przeżywalność robaków leczonych zmutowanym C. albicans jest porównywana z tymi, którym podano kontrolę izogeniczną typu dzikiego lub szczepy komplementarne.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ellis, H. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans.</a> Cell. 44 (6), 817-829 (1986).</li>
<li>Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+gene+ced-9+protects+cells+from+programmed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death.</a> Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li>
<li>Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+potential+anti-infectives+against+Staphylococcus+aureus+using+a+Caenorhabditis+elegans+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Altern+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model.</a> BMC Complement Altern Med. 14, 4(2014).</li>
<li>Marsh, E. K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%2C+a+model+organism+for+investigating+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity.</a> Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).</li>
<li>Kaletta, T., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+function+in+novel+targets%3A+C.+elegans+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).</li>
<li>Sem, X., Rhen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenicity+of+Salmonella+enterica+in+Caenorhabditis+elegans+relies+on+disseminated+oxidative+stress+in+the+infected+host%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host.</a> PLoS One. 7 (9), e45417(2012).</li>
<li>Irazoqui, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+pathogenesis+and+host+responses+during+infection+of+C.+elegans+by+P.+aeruginosa+and+S.+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus.</a> PLoS Pathog. 6, e1000982(2010).</li>
<li>Kim, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+p38+MAP+kinase+pathway+in+Caenorhabditis+elegans+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity.</a> Science. 297 (5581), 623-626 (2002).</li>
<li>Bae, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+virulence+genes+identified+by+bursa+aurealis+mutagenesis+and+nematode+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).</li>
<li>Couillault, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-independent+control+of+innate+immunity+in+Caenorhabditis+elegans+by+the+TIR+domain+adaptor+protein+TIR-1%2C+an+ortholog+of+human+SARM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM.</a> Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).</li>
<li>Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+innate+immune+response+triggered+by+Salmonella+enterica+requires+intact+LPS+and+is+mediated+by+a+MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway.</a> Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).</li>
<li>Kesika, P., Balamurugan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Shigella+boydii+infection+in+Caenorhabditis+elegans+and+bioinformatics+analysis+of+immune+regulatory+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions.</a> Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).</li>
<li>Cinar, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrio+cholerae+hemolysin+is+required+for+lethality%2C+developmental+delay%2C+and+intestinal+vacuolation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (7), e11558(2010).</li>
<li>Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Candida+albicans+AP-1+protein+against+host+derived+ROS+in+in+vivo+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection.</a> Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).</li>
<li>Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenesis+assay+using+Saccharomyces+cerevisiae+and+Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+roles+for+yeast+AP-1%2C+Yap1%2C+and+host+dual+oxidase+BLI-3+in+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis.</a> Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).</li>
<li>Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans-based%2C+whole+animal%2C+in+vivo+screen+for+the+identification+of+antifungal+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds.</a> Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).</li>
<li>Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+infection+of+Caenorhabditis+elegans+induces+antifungal+immune+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses.</a> PLoS Pathog. 7 (6), e1002074(2011).</li>
<li>Dieterich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstructed+human+epithelia+reveal+contributions+of+Candida+albicans+EFG1+and+CPH1+to+adhesion+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion.</a> Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).</li>
<li>Chen, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-lethal+Candida+albicans+cph1%2Fcph1+efg1%2Fefg1+transcription+factor+mutant+establishing+restricted+zone+of+infection+in+a+mouse+model+of+systemic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunopathol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection.</a> Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).</li>
<li>Ricicova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+biofilm+formation+in+a+new+in+vivo+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model.</a> Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).</li>
<li>Fazly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+filastatin%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+Candida+albicans+adhesion%2C+morphogenesis%2C+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).</li>
<li>Lo, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonfilamentous+C.+albicans+mutants+are+avirulent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent.</a> Cell. 90 (5), 939-949 (1997).</li>
<li>Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+damage+and+neutropenia+are+required+for+Candida+albicans+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e35(2008).</li>
<li>McDonough, K. A., Rodriguez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myriad+roles+of+cyclic+AMP+in+microbial+pathogens%3A+from+signal+to+sword%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).</li>
<li>Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+white-opaque+phenotypic+switching+in+Candida+albicans+by+the+Efg1p+morphogenetic+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator.</a> Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).</li>
<li>Li, F., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAP1%2C+a+Candida+albicans+gene+involved+in+binding+human+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells.</a> Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).</li>
<li>Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+Cph1p+and+Efg1p+mediate+activation+of+the+Candida+albicans+virulence+gene+SAP5+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection.</a> Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).</li>
<li>Korting, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+expression+of+the+hyphal-independent+Candida+albicans+proteinase+genes+SAP1+and+SAP3+in+the+efg1+mutant+is+associated+with+attenuated+virulence+during+infection+of+oral+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium.</a> J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).</li>
<li>Chamilos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+as+a+facile+model+for+large-scale+studies+of+virulence+mechanisms+and+antifungal+drug+efficacy+in+Candida+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species.</a> J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).</li>
<li>Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+disseminated+candidiasis+in+zebrafish+reveals+role+of+phagocyte+oxidase+in+limiting+filamentous+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryot+Cell%22%5BJournal%5D)">Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth.</a> Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).</li>
<li>Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+virulence+of+Candida+albicans+mutants+in+mice+and+Galleria+mellonella+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).</li>
<li>Mallo, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+antibacterial+defense+system+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible antibacterial defense system in C. elegans.</a> Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).</li>
<li>Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+enzymes+are+required+for+DAF-16-mediated+immunity+due+to+generation+of+reactive+oxygen+species+by+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).</li>
<li>Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxicity+of+hydrogen+peroxide+produced+by+Enterococcus+faecium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium.</a> Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).</li>
<li>Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ce-Duox1%2FBLI-3+generated+reactive+oxygen+species+trigger+protective+SKN-1+activity+via+p38+MAPK+signaling+during+infection+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans.</a> PLoS Pathog. 7 (12), e1002453(2011).</li>
<li>Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+and+human+dual+oxidase+1+%28DUOX1%29+%26%2334%3Bperoxidase%26%2334%3B+domains%3A+insights+into+heme+binding+and+catalytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) &#34;peroxidase&#34; domains: insights into heme binding and catalytic activity.</a> J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).</li>
<li>Issi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+Cluster+Transcription+Factors+Alter+Virulence+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans.</a> Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).</li>
<li>Ford, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+drug+resistance+in+clinical+isolates+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans.</a> Elife. 4, e00662(2015).</li>
<li>Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+Candida+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+microbiology+letters%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal Candida infection.</a> FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).</li>
<li>Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+Model+Host+for+Staphylococcus+aureus+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis.</a> Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).</li>
<li>Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pathogenesis+assay+using+Saccharomyces+cerevisiae+and+Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+roles+for+yeast+AP-1%2C+Yap1%2C+and+host+dual+oxidase+BLI-3+in+fungal+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+cell%22%5BJournal%5D)">A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis.</a> Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisane przez nas metody oznaczania zakażenia C. elegans i przeżywalności w ciągu całego życia narażenia na C. albicans można zmodyfikować w celu przetestowania innego patogenu. Płynne kultury innych bakterii lub grzybów mogą być wytwarzane i podawane C. elegans w podobny sposób. Dodatkowo, seryjne infekcje można przeznaczyć, najpierw wystawiając larwę na działanie jednego patogenu, jak opisano, a następnie przenosząc zwierzęta na nową płytkę zawierającą oddzielny patogen po osiągnięciu dorosło...

C. elegans jest używany jako potężny organizm modelowy od ponad 50 lat. W latach sześćdziesiątych XX wieku południowoafrykański biolog Sydney Brenner był pionierem w wykorzystaniu C. elegans do badania rozwoju neuronów, torując drogę długiej linii naukowców do badania różnych aspektów biologii komórek i zwierząt u nicieni. Do tej linii zaliczają się laureaci Nagrody Nobla Craig Mello i Andrew Fire za ich pracę nad RNAi1, Robert Horvitz i John Sulston za pracę nad rozwojem narządów i apoptozą2,3,4, oraz Martin Chalfie za pracę nad zielonym białkiem fluorescencyjnym5. Chociaż ten organizm modelowy był tradycyjnie używany do badania biologii molekularnej i rozwojowej, w ciągu ostatnich 15 lat naukowcy zaczęli używać C. elegans do badania biologii różnych ludzkich patogenów, w tym Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica i Serratia marcescens6,7,8,9,10. Badania te ujawniły, że wiele mechanizmów zaangażowanych w interakcję człowiek-patogen jest konserwatywnych w nicieniach, ale także, że istnieją pewne mechanizmy odpornościowe, które są unikalne dla tego organizmu modelowego11,12. W naturze C. elegans napotyka różne zagrożenia ze strony połkniętych patogenów obecnych w glebie, co zapewniło silną presję selekcyjną, aby ewoluować i utrzymywać wyrafinowany wrodzony układ odpornościowy w świetle jelita. Wiele genów i mechanizmów zaangażowanych w ochronę światła jelit jest koordynowanych przez wysoce konserwatywne elementy, które występują również u ssaków wyższych11,13. C. elegans stanowi zatem doskonały model do badania patogenów przewodu pokarmowego, takich jak Salmonella enterica14, Shigella boydii15, lub Vibrio16.
Tutaj podkreślamy niezwykłą wszechstronność C. elegans jako modelowego gospodarza do badania czynników zakaźnych, takich jak C. albicans. C. elegans jako modelowy gospodarz pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe pod kątem zjadliwości, które są tańsze i bardziej czasochłonne niż model mysi, który jest powszechnie stosowany do badania kandydozy42.
W tym badaniu pokazujemy, że ten model i test przeżycia mogą być niezawodnie wykorzystywane do badania wrodzonych efektorów immunologicznych gospodarza, ważnych dla przeciwdziałania infekcjom, determinantów patogenów, które napędzają zjadliwość, oraz związków farmakologicznych, które mogą interweniować w patogenezie. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych testów, metoda ta umożliwia badanie narażenia na patogen przez całe życie zwierzęcia, od stadium larwalnego do dorosłości, a nie tylko od dorosłości do śmierci43,44. Podsumowując, nasz model C. elegans - C. albicans jest wszechstronnym i potężnym narzędziem, które można wykorzystać nie tylko do badania podstaw genetycznych napędzających infekcję i odporność, ale także do identyfikacji nowych związków do interwencji terapeutycznej.

<table><tbody><tr><td>Agar (granulowany, klasy bakteriologicznej)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>20-248</td><td></td></tr><tr><td>Drut aluminiowy (95% Pt, 32 gauge)</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-1M32P</td><td></td></tr><tr><td>Axiovision Zeiss Mikroskop odwrócony</td><td>Axiovision Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto-Peptone</td><td>Fisher BioReagants</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>C. elegans szczep Bli-3</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki</td><td>Bli-3(e767) CB767</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP51-250</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol, stopień Sigma, minimum 99%</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe probówki hodowlane (20 x 150 mm)</td><td>FIsherBrand</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny (NI-150 High Intensity Illuminator)</td><td>Nikon Instrument Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Pryzmat GraphPad (oprogramowanie do analizy krzywej przeżycia)</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td>GraphPad</tr><tr><td>LB Bulion (Millera)</td><td>Apex BioResearch Products</td><td>11-120</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10034-99-8</td><td></td></tr><tr><td>Średnie szalki Petriego (35 x 10 mm)</td><td>Sokół</td><td></td><td></td>353001</tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Typ dziki C. albicans SC5314</td><td>ATCC</td><td>SC5314</td><td></td></tr><tr><td>Typ dziki C. elegans</td><td>Caenorhabditis Centrum Genetyki</td><td>N2</td><td></td></tr></tbody></table>

nicienie caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Demonstrujemy metodę wykorzystującą Caenorhabditis elegans jako modelowego gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych. Drobnoustroje są wprowadzane przez dietę, co sprawia, że jelito jest głównym miejscem choroby. Jelito nicieni strukturalnie i funkcjonalnie naśladuje jelita ssaków i jest przezroczyste, dzięki czemu jest podatne na mikroskopowe badania kolonizacji. Tutaj pokazujemy, że patogeny mogą powodować choroby i śmierć. Jesteśmy w stanie zidentyfikować mutanty mikrobiologiczne, które wykazują zmienioną zjadliwość. Jego zachowana wrodzona odpowiedź na stresy biotyczne sprawia, że C. elegans jest doskonałym systemem do badania aspektów wrodzonych interakcji immunologicznych gospodarza. Pokazujemy, że gospodarze z mutacjami w genie podwójnej oksydazy nie mogą wytwarzać reaktywnych form tlenu i nie są w stanie oprzeć się zniewadze mikrobiologicznej. Dalej pokazujemy wszechstronność prezentowanego testu przeżycia, pokazując, że może on być wykorzystany do badania skutków działania inhibitorów wzrostu drobnoustrojów. Test ten może być również wykorzystany do odkrycia czynników wirulencji grzybów jako celów dla rozwoju nowych środków przeciwgrzybiczych, a także dać możliwość dalszego odkrywania interakcji gospodarz-mikroorganizm. Konstrukcja tego testu dobrze nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych całego genomu, a możliwość kriogenizacji robaków do wykorzystania w przyszłości sprawia, że jest to opłacalny i atrakcyjny model całego zwierzęcia do badania.

Test patogenezy (Rycina 1) z wykorzystaniem C. albicans i C. elegans został wcześniej opisany przez nasz zespół17,18 oraz inne laboratoria19,20. Wykazujemy przydatność wykorzystania C. elegans do badania wirulencji C. albicans, pokazując, że komórki C. albicans są szybko pożerane przez nicienie i gr...

Tutaj prezentujemy nicienia Caenorhabditis elegans jako wszechstronny model gospodarza do badania interakcji mikrobiologicznych.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Ogólnym celem tego testu jest obserwacja wpływu infekcji grzybiczej na organizm modelowy C.Elegans. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania mechanistyczne w dziedzinie chorób zakaźnych, takie jak czynniki wirulencji patogenów, efektory immunologiczne gospodarza, a także odkrywanie leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to eksperymentalnie wykonalny system do badania interakcji gospodarz-patogen z obu punktów widzenia.Jest to szybki, łatwy i ekonomiczny system. Chociaż ta konkretna metoda może zapewnić wgląd w patogeny grzybowe, można ją również zastosować do innych czynników zakaźnych, takich jak bakterie, a nawet wiele organizmów, w celu zbadania interakcji mikrobiologicznych w żywym gospodarzu. Aby zrobić wykałaczkę ślimakową, odetnij 1,5-centymetrowy kawałek drutu aluminiowego, a następnie ostrożnie włóż około 0,5 centymetra drutu do końcówki pipety Pasteura.Za pomocą palnika Bunsena lub lampy alkoholowej stopić szklaną końcówkę pipety, powoli obracając ją w płomieniu, aż drut zostanie bezpiecznie przyklejony do pipety, nie naruszając przy tym oryginalnego kształtu końcówki pipety. Na koniec za pomocą kleszczy ostrożnie zegnij koniec drutu, aby utworzyć małą pętlę. Aby szybko przenieść duże ilości robaków na nowe płytki, za pomocą szpatułki przekrój kawałek agaru NGM zawierający wybrane robaki.Następnie wyjmij wycięty kawałek i połóż go ekranem do dołu na krawędzi łaty OP50 na nowej płycie. Aby przenieść robaki pojedynczo, podpal drut w ślimakowym kilofie, aż stanie się czerwony, a następnie wyjmij go z płomienia i pozwól mu ostygnąć przez kilka sekund. Używając drutu na kilofie, delikatnie zeskrob łatkę kultury OP50 wyhodowaną na nowej płytce, zakrywając drut na kilofie.Lepka kultura pokrywająca końcówkę drutu sprawia, że robaki przyklejają się do końcówki dołu. Z tego powodu użyj ruchu przesuwającego, aby delikatnie podnieść wybrane robaki. Po zebraniu wybranych robaków umieść je na nowej płytce, delikatnie przesuwając kulturę po agarze .Następnie umieść drut w płomieniu, aby usunąć pozostałą kulturę z kilofa. Umieść około 20 dorosłych zwierząt, zbierając je lub krojąc na talerzu z 50 mikrolitrami szczepu E.coli OP50. Aby zebrać jaja po jednym do dwóch dni, zalej płytkę 10 mililitrami buforu M9.Następnie za pomocą szklanej pipety serologicznej zamieszaj i delikatnie wymieszaj zawartość na płytce agarowej, aby uwolnić dorosłe zwierzęta lub jaja przyklejone do OP50. Zbierz cały płyn zawierający jaja i dorosłe osobniki. Przenieś roztwór M9 i OP50 do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.Odwirować probówkę o stężeniu 2,100 x g przez dwie minuty. Następnie odessać około dziewięciu mililitrów supernatantu bez naruszania osadu. Następnie użyj dwóch mililitrów sterylnej wody, jednego mililitra wybielacza i jednego mililitra 0,25 molowego wodorotlenku sodu do ponownego zaparcia granulki.Mieszaj delikatnie przez odwrócenie, aż około 70% dorosłych zwierząt pojawi się w stanie lizy. Zazwyczaj jaja pozostają nienaruszone podczas tego krótkiego wybielania ze względu na ich skorupę. Bardzo ważne jest, aby na tym etapie ograniczyć narażenie na wybielacz.Długotrwałe narażenie na wybielacz zniszczy jaja. Jeśli przygotowanie jaj nie powiedzie się, ogranicz czas ekspozycji na wybielacz lub rozcieńcz roztwór. Odwirować stożkową probówkę o masie 990 x g przez dwie minuty.Odessać supernatant bez naruszania osadu. Następnie ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach bufora M9. Po ponownym odwirowaniu i usunięciu supernatantu bez naruszania osadu, należy użyć 200 mikrolitrów bufora M9 do ponownego zawieszenia osadu.Dozuj od trzech do pięciu mililitrów YPD do sterylnej probówki i użyj sterylnej pętli, aby zaszczepić ją pojedynczą kolonią Candida albicans. Umieść probówkę na obrotowym bębnie w temperaturze 30 stopni Celsjusza na około 16 do 18 godzin. Oznacz jedną 1,5-mililitrową probówkę do mikrofugi, aby zawierała C. albicans, a drugą taką, aby zawierała OP50, a następnie zapisz wagę każdej pustej probówki.Przenieś 500 mikrolitrów nocnej kultury C. albicans do probówki oznaczonej jako C. Albicans. I 1500 mikrolitrów nocnej kultury OP50 do probówki oznaczonej jako OP50. Odwirować probówki przez 10 minut przy 16, 100 x g, a następnie odessać supernatant bez naruszania granulek.Użyj 500 mikrolitrów sterylnej wody do ponownego zawieszenia każdej granulki. Następnie odwirować probówki o sile 16, 100 x g przez pięć minut. Odessać supernatant bez naruszania osadów.Następnie zapisz ostateczną wagę probówek do mikrofuge. Określ wagę każdej granulki, odejmując początkową wagę probówek do mikrofuge od końcowej wagi. Używając sterylnej wody, ponownie zawiesić granulkę C.albicans do 10 miligramów na mililitr, a granulkę OP50 do 20 miligramów na mililitr.Następnie przygotuj mistrzowską mieszankę infekcji, łącząc 10 mikrolitrów 50 miligramów na mililitr roztworu streptomycyny. 2,5 mikrolitra kultury OP50. 0,5 mikrolitra kultury C. Albicans i 7 mikrolitrów sterylnej wody.W przypadku płytek kontrolnych należy utworzyć mieszankę wzorcową, zastępując objętość kultury C.albicans sterylną wodą. Następnie za pomocą mikropipety rozsiać 20 mikrolitrów mieszanki infekcji lub roztworu kontrolnego OP50 na środek płytek NGM. Po przygotowaniu jaj, jak pokazano wcześniej w tym filmie, policz jaja pod zakresem sekcji.I użyj M9 do rozcieńczenia roztworu jaj, aż do uzyskania stężenia około pięciu do sześciu zdrowych jaj na mikrolitr. Za pomocą pipety dozować próbkę o objętości 20 mikrolitrów zawierającą około 30 jaj na przygotowaną płytkę NGM w obszarze między kulturą bakteryjną a bokiem płytki. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin.Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, policz liczbę żywych i martwych dorosłych robaków na każdej płytce. uważając zwierzę za martwe, jeśli nie reaguje na stukanie w głowę aluminiowym drutem lub stukanie w płytkę. Policz również liczbę robaków za pomocą Dar i potwierdź, czy zwierzę ma Dar, szybko stukając w płytkę na stoliku mikroskopu preparacyjnego.Zwierzęta bez Dar będą natychmiast poruszać się do tyłu, podczas gdy zwierzęta z Darem będą potrzebowały wielokrotnych rund stukania, aby odwrócić swój kierunek, lub nie zrobią tego wcale. Co drugi dzień przenoszą pozostałe dorosłe robaki, zbierając robaki na nową płytkę infekcyjną lub kontrolną. W tym momencie, jeśli to konieczne, wykonaj test przeżycia, śledząc każdego dnia liczbę żywych, martwych i brakujących robaków.Ważne jest, aby przenosić robaki co najmniej co drugi dzień. Gwarantuje to, że dorosłe robaki, które są oceniane w tym teście, nie są mylone ze swoim potomstwem. C. elegans były narażone na C. albicans przez okres sześciu dni i obserwowano oznaki infekcji, postęp choroby i śmierć.Fenotyp Dar jest najbardziej widoczny w czwartym dniu testu przeżycia, co zauważa wystający obszar odbytu, który nie jest widoczny u niezakażonego zwierzęcia. Wiadomo również, że robaki zakażone C.albicans wykazują obrzęk w okolicy sromu. W obu przypadkach robak nie jest w stanie usunąć infekcji po osiągnięciu tego etapu.W celu uwidocznienia kolonizacji C.Albicans w świetle jelita, robaki były karmione dzikimi typami C.albicans oznaczonymi RFP, które powodują fluoryzację obszarów kolonizacji na czerwono. C. albicans kolonizuje światło jelita do trzeciego dnia testu. Jak pokazano tutaj, zakażone robaki wykazywały poważniejsze wzdęcia jelit niż obserwowano w niezakażonej kontroli.W tym eksperymencie przetestowano zdolność robaków do przetrwania infekcji wywołanej przez zjadliwego podwójnego mutanta C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Robaki zakażone podwójnym mutantem żyją statystycznie znacznie dłużej niż osoby z grupy kontrolnej. Sugeruje to, że te dwa geny są wymagane do zjadliwości C.albicans przeciwko C. Elegans.Po opanowaniu, każdą część tej techniki można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin każdego dnia życia robaka. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że można używać czynników zakaźnych. Dlatego należy stosować odpowiednie środki ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.W tej podstawowej procedurze można wprowadzić drobne modyfikacje, takie jak wprowadzenie dodatkowych czynników mikrobiologicznych w celu zbadania interakcji mikrobiologicznych w kontekście żywego gospodarza. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zakaźnymi do zbadania zjadliwości drobnoustrojów, mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza, a także odkrycia nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak utrzymywać i manipulować C.Elegans oraz wykorzystywać organizm do badania interakcji mikroorganizmów gospodarza na poziomie molekularnym.Nie zapominaj, że praca z patogenami mikrobiologicznymi i odczynnikami chemicznymi, takimi jak azydek sodu, może być niebezpieczna i należy stosować odpowiednie środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i metody usuwania odpadów.

the-nematode-caenorhabditis-elegans-versatile-vivo-model-to-study

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Łatwość utrzymania i propagacji nicieni C. elegans sprawia, że są one doskonałym organizmem modelowym. Możliwość synchronizacji nicieni pozwala na pracę ze znaczną liczbą osobników w tym samym stadium rozwojowym, co ułatwia badanie konkretnego procesu u wielu zwierząt.

Podstawowe metody pracy z Caenorhabditis elegans: Synchronizacja i obserwacja

Dzikie nicienie Caenorhabditis są związane z wieloma drobnoustrojami, często w świetle jelit lub infekującymi jelita. Protokół ten szczegółowo opisuje metodę wzbogacania niekulturowych drobnoustrojów kolonizujących jelito, wykorzystując odporność naskórka dauer.

Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Mikroby jelitowe, w tym bakterie zewnątrzkomórkowe i patogeny wewnątrzkomórkowe, takie jak wirus Orsay i mikrosporydia (grzyby), są często kojarzone z dzikimi nicieniami Caenorhabditis. W artykule przedstawiono protokół wykrywania i ilościowego oznaczania drobnoustrojów, które kolonizują i/lub infekują nicienie C. elegans, a także pomiaru obciążenia patogenami po kontrolowanych infekcjach w laboratorium.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ RNA (FISH) w celu wizualizacji kolonizacji i infekcji mikrobiologicznej w jelitach Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje 96-dołkowe zakłócenie pojedynczych bakteriologicznie skolonizowanych Caenorhabditis elegans po zimnym paraliżu i bieleniu powierzchni w celu usunięcia zewnętrznych bakterii. Otrzymaną zawiesinę umieszcza się na płytkach agarowych, aby umożliwić dokładne, średnioprzepustowe określenie ilościowe obciążenia bakteryjnego w dużej liczbie pojedynczych robaków.

Wykorzystanie danych dotyczących pojedynczego robaka do ilościowego określenia niejednorodności w interakcjach Caenorhabditis elegans z bakteriami

Caenorhabditis elegans jest jednym z głównych gatunków modelowych w biologii, jednak prawie wszystkie badania są prowadzone pod nieobecność naturalnie związanych z nim mikrobów. Opisane tutaj metody pomogą lepiej zrozumieć różnorodność powiązanych mikroorganizmów jako podstawę przyszłych badań funkcjonalnych nad C. elegans.

Izolacja i charakterystyka naturalnej mikrobioty nicienia modelowego Caenorhabditis elegans

Mikrokosmosy kompostu wprowadzają do laboratorium różnorodność mikrobiologiczną występującą w naturze, aby ułatwić badania mikrobiomu u Caenorhabditis elegans. Poniżej znajdują się protokoły do przeprowadzania eksperymentów mikrokosmicznych, przy czym eksperymenty wykazują zdolność do modulowania różnorodności mikrobiologicznej środowiska w celu zbadania związków między różnorodnością mikrobiologiczną środowiska a składem mikrobiomu jelitowego robaków.

Mikrokosmosy kompostu jako zróżnicowane mikrobiologicznie, naturalne środowiska do badań nad mikrobiomem u Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans to potężny model do badania molekularnych determinantów kierujących interakcjami gospodarz-mikrobiom. Przedstawiamy wysokoprzepustowy potok profilujący poziomy kolonizacji mikrobiomu jelitowego u pojedynczych zwierząt wraz z kluczowymi aspektami fizjologii C. elegans.

Zastosowanie wermimetrii przepływowej do kwantyfikacji i analizy mikrobiomu jelitowego Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy instrukcje dotyczące skutecznego wykorzystania SegElegans, systemu głębokiego uczenia, który opracowaliśmy do automatycznego segmentowania pojedynczych robaków na mikroskopii szerokopolowej, do późniejszego wykorzystania w oprogramowaniu do analizy obrazów, takiego jak ImageJ. Oferujemy możliwości korzystania z systemu zarówno online, jak i offline.

Automatyczna analiza obrazów fluorescencyjnych C. elegans z użyciem SegElegans

Opisujemy solidną strategię wymiany genów w celu genetycznego manipulowania grzybem Ustilago maydis. Ten protokół wyjaśnia, jak generować mutanty delecji w celu zbadania fenotypów infekcji. Można go rozszerzyć o modyfikację genów w dowolny sposób, np. poprzez dodanie sekwencji kodującej znacznik białka fluorescencyjnego.

Manipulacja genetyczna patogenu roślinnego Ustilago maydis w celu zbadania biologii grzybów i interakcji mikroorganizmów roślinnych

Poznaj metodę badania infekcji grzybiczych u nicieni Caenorhabditis elegans jako modelu in vivo. Technika ta pozwala analizować czynniki wirulencji patogenów i odpowiedzi immunologiczne gospodarza.

Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Przeglądaj więcej filmów