Nicienie Caenorhabditis elegans - wszechstronny model in vivo do badania interakcji gospodarz-mikroorganizm

Ogólnym celem tego testu jest obserwacja wpływu infekcji grzybiczej na organizm modelowy C.Elegans. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania mechanistyczne w dziedzinie chorób zakaźnych, takie jak czynniki wirulencji patogenów, efektory immunologiczne gospodarza, a także odkrywanie leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to eksperymentalnie wykonalny system do badania interakcji gospodarz-patogen z obu punktów widzenia.

Jest to szybki, łatwy i ekonomiczny system. Chociaż ta konkretna metoda może zapewnić wgląd w patogeny grzybowe, można ją również zastosować do innych czynników zakaźnych, takich jak bakterie, a nawet wiele organizmów, w celu zbadania interakcji mikrobiologicznych w żywym gospodarzu. Aby zrobić wykałaczkę ślimakową, odetnij 1,5-centymetrowy kawałek drutu aluminiowego, a następnie ostrożnie włóż około 0,5 centymetra drutu do końcówki pipety Pasteura.

Za pomocą palnika Bunsena lub lampy alkoholowej stopić szklaną końcówkę pipety, powoli obracając ją w płomieniu, aż drut zostanie bezpiecznie przyklejony do pipety, nie naruszając przy tym oryginalnego kształtu końcówki pipety. Na koniec za pomocą kleszczy ostrożnie zegnij koniec drutu, aby utworzyć małą pętlę. Aby szybko przenieść duże ilości robaków na nowe płytki, za pomocą szpatułki przekrój kawałek agaru NGM zawierający wybrane robaki.

Następnie wyjmij wycięty kawałek i połóż go ekranem do dołu na krawędzi łaty OP50 na nowej płycie. Aby przenieść robaki pojedynczo, podpal drut w ślimakowym kilofie, aż stanie się czerwony, a następnie wyjmij go z płomienia i pozwól mu ostygnąć przez kilka sekund. Używając drutu na kilofie, delikatnie zeskrob łatkę kultury OP50 wyhodowaną na nowej płytce, zakrywając drut na kilofie.

Lepka kultura pokrywająca końcówkę drutu sprawia, że robaki przyklejają się do końcówki dołu. Z tego powodu użyj ruchu przesuwającego, aby delikatnie podnieść wybrane robaki. Po zebraniu wybranych robaków umieść je na nowej płytce, delikatnie przesuwając kulturę po agarze .

Następnie umieść drut w płomieniu, aby usunąć pozostałą kulturę z kilofa. Umieść około 20 dorosłych zwierząt, zbierając je lub krojąc na talerzu z 50 mikrolitrami szczepu E.coli OP50. Aby zebrać jaja po jednym do dwóch dni, zalej płytkę 10 mililitrami buforu M9.

Następnie za pomocą szklanej pipety serologicznej zamieszaj i delikatnie wymieszaj zawartość na płytce agarowej, aby uwolnić dorosłe zwierzęta lub jaja przyklejone do OP50. Zbierz cały płyn zawierający jaja i dorosłe osobniki. Przenieś roztwór M9 i OP50 do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów.

Odwirować probówkę o stężeniu 2,100 x g przez dwie minuty. Następnie odessać około dziewięciu mililitrów supernatantu bez naruszania osadu. Następnie użyj dwóch mililitrów sterylnej wody, jednego mililitra wybielacza i jednego mililitra 0,25 molowego wodorotlenku sodu do ponownego zaparcia granulki.

Mieszaj delikatnie przez odwrócenie, aż około 70% dorosłych zwierząt pojawi się w stanie lizy. Zazwyczaj jaja pozostają nienaruszone podczas tego krótkiego wybielania ze względu na ich skorupę. Bardzo ważne jest, aby na tym etapie ograniczyć narażenie na wybielacz.

Długotrwałe narażenie na wybielacz zniszczy jaja. Jeśli przygotowanie jaj nie powiedzie się, ogranicz czas ekspozycji na wybielacz lub rozcieńcz roztwór. Odwirować stożkową probówkę o masie 990 x g przez dwie minuty.

Odessać supernatant bez naruszania osadu. Następnie ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach bufora M9. Po ponownym odwirowaniu i usunięciu supernatantu bez naruszania osadu, należy użyć 200 mikrolitrów bufora M9 do ponownego zawieszenia osadu.

Dozuj od trzech do pięciu mililitrów YPD do sterylnej probówki i użyj sterylnej pętli, aby zaszczepić ją pojedynczą kolonią Candida albicans. Umieść probówkę na obrotowym bębnie w temperaturze 30 stopni Celsjusza na około 16 do 18 godzin. Oznacz jedną 1,5-mililitrową probówkę do mikrofugi, aby zawierała C. albicans, a drugą taką, aby zawierała OP50, a następnie zapisz wagę każdej pustej probówki.

Przenieś 500 mikrolitrów nocnej kultury C. albicans do probówki oznaczonej jako C. Albicans. I 1500 mikrolitrów nocnej kultury OP50 do probówki oznaczonej jako OP50. Odwirować probówki przez 10 minut przy 16, 100 x g, a następnie odessać supernatant bez naruszania granulek.

Użyj 500 mikrolitrów sterylnej wody do ponownego zawieszenia każdej granulki. Następnie odwirować probówki o sile 16, 100 x g przez pięć minut. Odessać supernatant bez naruszania osadów.

Następnie zapisz ostateczną wagę probówek do mikrofuge. Określ wagę każdej granulki, odejmując początkową wagę probówek do mikrofuge od końcowej wagi. Używając sterylnej wody, ponownie zawiesić granulkę C.albicans do 10 miligramów na mililitr, a granulkę OP50 do 20 miligramów na mililitr.

Następnie przygotuj mistrzowską mieszankę infekcji, łącząc 10 mikrolitrów 50 miligramów na mililitr roztworu streptomycyny. 2,5 mikrolitra kultury OP50. 0,5 mikrolitra kultury C. Albicans i 7 mikrolitrów sterylnej wody.

W przypadku płytek kontrolnych należy utworzyć mieszankę wzorcową, zastępując objętość kultury C.albicans sterylną wodą. Następnie za pomocą mikropipety rozsiać 20 mikrolitrów mieszanki infekcji lub roztworu kontrolnego OP50 na środek płytek NGM. Po przygotowaniu jaj, jak pokazano wcześniej w tym filmie, policz jaja pod zakresem sekcji.

I użyj M9 do rozcieńczenia roztworu jaj, aż do uzyskania stężenia około pięciu do sześciu zdrowych jaj na mikrolitr. Za pomocą pipety dozować próbkę o objętości 20 mikrolitrów zawierającą około 30 jaj na przygotowaną płytkę NGM w obszarze między kulturą bakteryjną a bokiem płytki. Inkubuj płytki w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez 48 godzin.

Następnie, pod mikroskopem preparacyjnym, policz liczbę żywych i martwych dorosłych robaków na każdej płytce. uważając zwierzę za martwe, jeśli nie reaguje na stukanie w głowę aluminiowym drutem lub stukanie w płytkę. Policz również liczbę robaków za pomocą Dar i potwierdź, czy zwierzę ma Dar, szybko stukając w płytkę na stoliku mikroskopu preparacyjnego.

Zwierzęta bez Dar będą natychmiast poruszać się do tyłu, podczas gdy zwierzęta z Darem będą potrzebowały wielokrotnych rund stukania, aby odwrócić swój kierunek, lub nie zrobią tego wcale. Co drugi dzień przenoszą pozostałe dorosłe robaki, zbierając robaki na nową płytkę infekcyjną lub kontrolną. W tym momencie, jeśli to konieczne, wykonaj test przeżycia, śledząc każdego dnia liczbę żywych, martwych i brakujących robaków.

Ważne jest, aby przenosić robaki co najmniej co drugi dzień. Gwarantuje to, że dorosłe robaki, które są oceniane w tym teście, nie są mylone ze swoim potomstwem. C. elegans były narażone na C. albicans przez okres sześciu dni i obserwowano oznaki infekcji, postęp choroby i śmierć.

Fenotyp Dar jest najbardziej widoczny w czwartym dniu testu przeżycia, co zauważa wystający obszar odbytu, który nie jest widoczny u niezakażonego zwierzęcia. Wiadomo również, że robaki zakażone C.albicans wykazują obrzęk w okolicy sromu. W obu przypadkach robak nie jest w stanie usunąć infekcji po osiągnięciu tego etapu.

W celu uwidocznienia kolonizacji C.Albicans w świetle jelita, robaki były karmione dzikimi typami C.albicans oznaczonymi RFP, które powodują fluoryzację obszarów kolonizacji na czerwono. C. albicans kolonizuje światło jelita do trzeciego dnia testu. Jak pokazano tutaj, zakażone robaki wykazywały poważniejsze wzdęcia jelit niż obserwowano w niezakażonej kontroli.

W tym eksperymencie przetestowano zdolność robaków do przetrwania infekcji wywołanej przez zjadliwego podwójnego mutanta C.Albicans efg1/efg1 cph1/cph1. Robaki zakażone podwójnym mutantem żyją statystycznie znacznie dłużej niż osoby z grupy kontrolnej. Sugeruje to, że te dwa geny są wymagane do zjadliwości C.albicans przeciwko C. Elegans.

Po opanowaniu, każdą część tej techniki można wykonać w ciągu jednej do dwóch godzin każdego dnia życia robaka. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że można używać czynników zakaźnych. Dlatego należy stosować odpowiednie środki ostrożności w zakresie bezpieczeństwa biologicznego.

W tej podstawowej procedurze można wprowadzić drobne modyfikacje, takie jak wprowadzenie dodatkowych czynników mikrobiologicznych w celu zbadania interakcji mikrobiologicznych w kontekście żywego gospodarza. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się chorobami zakaźnymi do zbadania zjadliwości drobnoustrojów, mechanizmów wrodzonej odpowiedzi immunologicznej gospodarza, a także odkrycia nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak utrzymywać i manipulować C.Elegans oraz wykorzystywać organizm do badania interakcji mikroorganizmów gospodarza na poziomie molekularnym.

Nie zapominaj, że praca z patogenami mikrobiologicznymi i odczynnikami chemicznymi, takimi jak azydek sodu, może być niebezpieczna i należy stosować odpowiednie środki ostrożności, takie jak środki ochrony osobistej i metody usuwania odpadów.