Ocena kruchości kości korowej bydła za pomocą testów zadrapań
30 listopada 2017
To badanie ocenia wytrzymałość na złamania kości korowej bydła na poziomie sub-mezo za pomocą mikroskopowych testów zadrapań. Jest to oryginalna, obiektywna, rygorystyczna i powtarzalna metoda proponowana do badania odporności na pękanie poniżej skali makroskopowej. Potencjalne zastosowania to badanie zmian w kruchości kości spowodowanych chorobami takimi jak osteoporoza.
Ogólnym celem tego badania jest scharakteryzowanie złamanego zachowania kości korowej w mezoskali za pomocą mikroskopowych testów zadrapań. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny biomechaniki i mechaniki pęknięć, takie jak kruchość tkanek biologicznych lub przebudowa zbitych kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest odpowiednia dla małych okazów.
Jest rygorystyczny, powtarzalny i półdestrukcyjny. Ponadto metoda jest obiektywna, ponieważ opieramy się wyłącznie na pomiarach siły i głębokości. Procedurę zademonstruje Kavya Mendu, doktorantka w moim laboratorium.
Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrażaj zamrożone kości udowe w pojemniku z wodą przez około dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie wytnij wiele dysków o grubości około 10-15 milimetrów od środkowego obszaru trzonu za pomocą diamentowej piły taśmowej do blatu, aby uzyskać próbki o jednolitym polu przekroju poprzecznego kości korowej. Następnie użyj zestawu do preparowania, aby usunąć wszelkie tkanki miękkie lub mięso przyczepione do kości korowej.
Przeciąć przekroje kości udowych za pomocą diamentowego ostrza waflowego z małą prędkością wzdłuż osi podłużnej kości w wilgotnych warunkach, aby uzyskać wielokrotne, falbaniaste prostopadłościenne przekroje. Następnie wyczyść próbki w roztworze 1,5% anionowego środka czyszczącego i 5% wybielacza przez 20 minut w myjce ultradźwiękowej. Następnie zanurz próbki kości korowej w żywicy akrylowej, aby ułatwić obsługę i stabilność, najpierw pokrywając ściany formy środkiem antyadhezyjnym.
Następnie wymieszaj żywicę akrylową i utwardzacz w zlewce. Umieść jeden z wyciętych próbek kości korowej w każdej formie tak, aby powierzchnia, która ma być zarysowana, była skierowana w dół. Wlej mieszankę żywicy akrylowej do przygotowanych uchwytów na próbki.
Usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione podczas procesu mieszania. Niech próbki utwardzą się dla nas do czterech do pięciu godzin. Następnie pokrój osadzone próbki na krążki o grubości pięciu milimetrów z małą prędkością, odsłaniając powierzchnię do zarysowania.
Następnie zamontuj próbki na aluminiowych dyskach o średnicy 34 milimetrów i wysokości pięciu milimetrów za pomocą kleju cyjanoakrylowego. Następnie zawiń próbki w miernik wstrząsany HBSS. I wstaw do lodówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do dalszego użycia.
W tej procedurze należy zmielić próbki kości korowej bydła w temperaturze pokojowej za pomocą papierów z węglika krzemu o ziarnistości 400 i 600 odpowiednio przez jedną minutę i pięć minut. Utrzymuj szlifierkę polerską na podstawowych prędkościach odpowiednio 100 obr./min i 150 obr./min. Następnie mielej maszynowo próbki kości kory bydlęcej w temperaturze pokojowej na papierach o ziarnistości 800 i 1200 przez 15 minut na każdym etapie.
Utrzymuj szlifierkę polerską na prędkości podstawowej 150 obr./min, prędkości głowicy 60 obr./min i obciążeniu roboczym jednego funta. Wypolerować próbki za pomocą trzech mikrometrów, jednego mikrometra i 0,25 mikrometra zawiesiny diamentowej w tej samej kolejności na twardej, perforowanej włókninie przez czas 90 każda w temperaturze pokojowej. Utrzymuj obciążenie robocze dla każdego kroku na poziomie jednego funta, przy prędkościach podstawy i głowicy polerki odpowiednio 300 obr./min i 60 obr./min.
Następnie wypoleruj próbkę za pomocą roztworu zawiesiny tlenku glinu o wielkości 0,05 mikrometra na miękkiej, syntetycznej tkaninie ze sztucznego jedwabiu przez 90 minut przy jednym funcie, przy prędkości podstawy i głowicy odpowiednio 100 obr./min i 60 obr./min, również w temperaturze pokojowej. Szlifowanie i polerowanie próbek ma kluczowe znaczenie dla uzyskania płaskiej struktury bez znaczącej zmiany mikrostruktury. Pomiędzy każdym kolejnym etapem mielenia i polerowania umieść próbki w zlewce z wodą dijonizowaną i trzymaj zlewkę w kąpieli ultradźwiękowej przez dwie minuty, aby oczyścić pozostałości i uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
Następnie obejrzyj cechy powierzchni za pomocą mikroskopu optycznego lub obrazowania SEM. Przed przystąpieniem do badania próbek kości korowych należy skalibrować końcówkę wgłębnika Rockwella za pomocą poliwęglanu. Następnie umieść próbkę kości korowej na stoliku i wybierz widok testu zarysowania za pomocą mikroskopu optycznego zintegrowanego z modułem testera mikrozarysowań.
Następnie należy zastosować liniowe obciążenie progresywne z obciążeniem początkowym 30 miliniutonów i obciążeniem końcowym 30 niutonów. Szybkość ładowania powinna być ustawiona na 60 niutonów na minutę, a długość rysy na trzy milimetry. Konieczne jest wybranie obszaru o dużej gęstości dla zwartej kości.
Należy unikać obszarów w pobliżu kości gąbczastej, powiększających mikropory, ponieważ skutkują one niskimi wartościami odporności na złamania. Następnie wykonaj serię testów zarysowania na krótkich, podłużnych próbkach kości korowej bydła. Zwilż powierzchnię próbki HBSS po każdym zestawie trzech do czterech testów zarysowania, aby utrzymać je nawodnione.
Następnie przeanalizuj dane z testu zarysowania w oparciu o nieliniowe modelowanie mechaniczne pękania. Pokazany tutaj jest obraz z mikroskopii optycznej panoramy zagajnika. Oto odpowiedni wykres siły w funkcji głębokości na całej długości zagłębienia.
Siła pozioma odpowiada sile rezystancyjnej wykrytej przez czujniki przymocowane do stolika testera zarysowań z mikrouszkodzeniami. A siła pionowa odpowiada progresywnej sile liniowej przyłożonej do próbki kości korowej. Zdjęcia SEM zagłębienia w zarysowania pokazują mikromechanizmy, takie jak ugięcie pęknięć, mostkowanie pęknięć, mostkowanie włókien i odpryskiwanie przy 40X, 10 000X, 2, 400X i 5 000X.
Podczas próby przygotowania próbki ważne jest, aby monitorować wilgotność względną i utrzymywać próbki w stanie mokrym przez cały czas, aby zapobiec miejscowemu odwodnieniu. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak eksperymenty z rentgenowską tomografią komputerową, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak mikromechanizmy pęknięć w skali mezo- i mikroskopowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzać mikroskopijne testy pęknięć zadrapań na twardych tkankach biologicznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie charakteryzuje zachowanie pękaniowe kości korowej w skali mezoskopowej z wykorzystaniem mikroskopowych testów zarysowania. Metoda ta dostarcza informacji na temat kruchości tkanek biologicznych oraz przebudowy kości zbitej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biomechanika
- Mechanika pękania
- Biologia kości
Wstęp
- Odporność na pękanie jest kluczowa dla zrozumienia kruchości kości.
- Obecne metody często koncentrują się na skalach makroskopowych.
- Mikroskopowe testy rysowania oferują nowatorskie podejście.
- Istotną zaletą jest możliwość zastosowania niewielkich próbek.
Cel badania
- Ocena odporności na pękanie kory kości bydlęcej.
- Badanie zmian w kruchości kości wynikających z chorób takich jak osteoporoza.
- Zapewnienie rygorystycznej i powtarzalnej metody dla przyszłych badań.
Zastosowane metody
- Technika mikroskopowych testów rysania.
- Pomiar siły i głębokości w celu zapewnienia obiektywizmu.
- Półdestrukcyjne podejście do testowania.
- Zastosowanie w małych próbkach kostnych.
Główne wyniki
- Charakterystyka zachowania pęknięć na poziomie sub-mezo.
- Wnioski dotyczące kruchości tkanek biologicznych.
- Demonstracja powtarzalności i rygoru zastosowanej metody.
- Potencjalne zastosowania w badaniu osteoporozy.
Wnioski
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu odporności na pękanie.
- Może ona prowadzić do lepszego zrozumienia kruchości kości.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym rygorystycznym podejściu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena kruchości kości w skalach mikroskopowej i mezoskopowej wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych badaniach nad osteoporozą, gdzie obecne testy makroskopowe ograniczają zrozumienie mechanizmów inicjacji złamań. Metoda ta umożliwia walidację celów poprzez ilościowe określenie odporności na pękanie w mikrostrukturach kostnych istotnych dla przebiegu choroby, co wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki antyresorpcyjne i anaboliczne. Powtarzalny, półdestrukcyjny charakter testu zarysowania ułatwia prowadzenie badań podłużnych w modelach przedklinicznych, zwiększając pewność prognostyczną podczas identyfikacji wiodących cząsteczek w terapiach ukierunkowanych na kości.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar odporności na pękanie na hierarchicznych poziomach struktury kości dotkniętych osteoporozą.
- Wartość operacyjna: Zapewnia obiektywne odczyty oparte na sile i głębokości, co zmniejsza zmienność w badaniach nad zaangażowaniem celu.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez powiązanie mikromechanizmów (odchylenie pęknięcia, mostkowanie) z funkcjonalną jakością kości.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe wskaźniki odporności na pękanie na podstawie analizy bruzd startowych w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje małe próbki (dyski o grubości <5 mm), co umożliwia wysokoprzepustowy screening wpływu związków na właściwości materiałowe kości.
- Wartość operacyjna: Przechowywanie próbek w warunkach wilgotnych w roztworze HBSS zapewnia istotność fizjologiczną i powtarzalność wyników pomiędzy powtórzeniami testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy mikroskopowe zachowanie pęknięć z awarią mezoskopową, zwiększając wierność systemów istotnych dla choroby w modelach osteoporozy.
- Wartość operacyjna: Testy półdestrukcyjne umożliwiają sekwencyjne obrazowanie (SEM, optyczne) oraz potencjalne późniejsze badanie mikro-CT w celu wieloskalowej walidacji.
- Wartość naukowa: Przechwytuje heterogeniczność w kości korowej, dostarczając informacji dla decyzji o postępach skorygowanych o ryzyko w oparciu o spójność materiału.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po przedkliniczne badanie skuteczności, w którym właściwości materiałowe kości służą jako biomarker mechanistyczny dla zmian w jakości kości wywołanych przez związek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących tego, w jaki sposób środki farmakologiczne zmieniają odporność na pękanie poprzez mikromechaniczne ścieżki sygnałowe.
- Screening: Umożliwia przygotowanie do analizy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu próbek i kontrolowanym parametrom rysania (obciążenie od 30 mN do 30 N, długość 3 mm).
- Analityka: Dostarcza pomiary siły w funkcji głębokości oraz wyniki nieliniowego modelowania pęknięć do ilościowego porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączy testy w mikroskali z mezoskopowym zachowaniem pęknięć, wspierając ciągłość badań przedklinicznych w obszarze osteoporozy.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę do oceny związków celowanych w kość w wielu badaniach przedklinicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celu poprzez bezpośredni pomiar mechanizmów kruchości kości.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja dzięki rygorystycznemu protokołowi szlifowania i polerowania próbek oraz kontroli warunków środowiskowych (nawodnienie, wilgotność).
- Wartość strategiczna: Redukcja ryzyka biologicznego na późnych etapach badań poprzez wczesną identyfikację związków, które nie poprawiają jakości materiału kostnego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwienie priorytetyzacji związków wiodących z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o poprawę odporności na pękanie w systemach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wiedza specjalistyczna z zakresu biomechaniki, mechaniki pęknięć oraz przygotowania próbek twardych tkanek biologicznych.
- Instrumentacja: mikrotester do badań rysowania z kontrolą obciążenia (szybkość 60 N/min), obrazowanie optyczne/SM oraz komora środowiskowa do nawilżania w HBSS.
- Standaryzacja międzyzespołowa: Wspólne protokoły zatapiania próbek, sekwencja polerowania (ziarnistość 400–1200, zawiesiny diamentowe/aluminiowe) oraz orientacja testowania (krótka podłużna).
- Uwagi dotyczące adaptacji: Unikanie bliskości kości gąbczastej oraz obszarów o dużym zagęszczeniu mikroporów w celu zapewnienia poprawności pomiarów.
- Ograniczenia praktyczne: Półdestrukcyjny charakter badania wyklucza testy podłużne na tej samej próbce, co wymaga odpowiedniej liczebności grupy (n=102 w badaniu) dla uzyskania mocy statystycznej.
