Wprowadzenie do śmierci komórki
Paradoksalnie, śmierć komórki pomaga kształtować życie organizmu. Podobnie jak każdy cały organizm, komórki mogą umrzeć w wyniku starzenia się, przypadkowego urazu lub w wyniku infiltracji patogenu, komórka może poświęcić się, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji. W takich okolicznościach komórki mogą podążać różnymi ścieżkami śmierci, takimi jak apoptoza, autofagia lub martwica. Wszystkie te typy wykazują specyficzne cechy morfologiczne. Apoptoza lub zaprogramowana śmierć komórki prowadzi do "pęcherzenia" błony i fragmentacji jądra. Autofagia, która jest również regulowana, prowadzi do powstawania dużych wakuoli otaczających składniki komórkowe. Wreszcie martwica, która jest "nieplanowana" lub przypadkowa, kończy się lizą komórek.
W tym filmie omówimy ważne odkrycia, które doprowadziły do zidentyfikowania tych ścieżek, zbadamy pytania, które naukowcy wciąż zadają na temat śmierci komórki, omówimy narzędzia, których używają, aby na nie odpowiedzieć, a na koniec dokonamy przeglądu kilku przykładowych eksperymentów.
Najpierw przyjrzyjmy się kilku kluczowym badaczom, którzy pomogli rozszyfrować różne ścieżki śmierci komórek.
Współczesne terminy używane do opisania tych ścieżek można prześledzić wstecz do Hipokratesa, lekarza w starożytnej Grecji. Użył terminu apoptoza, oznaczającego "odpadanie", aby opisać "rozdrobnienie" kości obserwowane po złamaniu. Przechodząc do ery nowożytnej, pierwsza zauważalna wzmianka o "martwicy" pojawiła się w 1859 roku, kiedy Rudolf Virchow - w swoim kompilacji zatytułowanej Patologia komórki - użył tego terminu do opisania "zaawansowanego rozpadu tkanki".
Dziękipostępom w mikroskopii i histologii w ciągu następnej dekady, w 1877 roku Carl Weigert i Julius Cohnheim byli w stanie badać martwicę na poziomie komórkowym. Dostarczyły one informacji na temat cech morfologicznych związanych z tym typem śmierci, takich jak utrata jąder.
Prawie 70 lat później Christian de Duve odkrył "autofagię", proces, w którym składniki komórkowe są pochłaniane i rozkładane przez organelle związane z błoną zwane autofagosomami, które łączą się z innym typem organelli - lizosomami - aby dalej niszczyć ich zawartość. Obecnie wiemy, że autofagia faktycznie odgrywa podwójną rolę w komórce, ułatwiając przetrwanie lub wywołując śmierć.
W 1972 roku John Kerr, A. R. Currie i Andrew Wyllie zaobserwowali inny typ śmierci komórki o osobliwej morfologii. Ponieważ proces ten polegał na "odpadaniu" kawałków martwych komórek, nadali mu starożytną grecką nazwę apoptoza. Później apoptoza została uznana za formę "zaprogramowanej śmierci komórki" w 1977 roku, kiedy H. R. Horvitz i John Sulston badali rozwój C. elegans. Zauważyli, że określone komórki ulegają apoptozie w tym samym czasie u różnych robaków.
Ponieważ działo się to na wczesnym etapie rozwoju, zasugerowano, że geny mogą kierować apoptozą. Hipoteza ta została potwierdzona przez grupę Horvitza w latach 80-tych, kiedy zaobserwowali, że komórki z mutacjami w pewnych genach ced lub "śmierci C. elegans" nie umierały podczas rozwoju tych robaków. Później Horvitz wykazał, że gen ced-3 koduje enzym rozkładający białka zwany kaspazą. Wiemy, że istnieje kilka kaspaz, które odgrywają główną rolę w śmierci komórki.
Te postępy w dziedzinie śmierci komórek otworzyły nowe drogi do eksploracji przez badaczy. Przyjrzyjmy się niektórym z nich.
Zawsze istniało zainteresowanie ustaleniem, jakie czynniki wywołują śmierć komórki. Aby je zidentyfikować, naukowcy wystawiają obecnie komórki na promieniowanie, chemikalia i cząsteczki sygnałowe, a następnie poszukują zmian w stopniu lub rodzaju śmierci.
Inni naukowcy są zainteresowani wyjaśnieniem szlaków biochemicznych zaangażowanych w każdy mechanizm śmierci komórki. Obecnie wiemy, że apoptoza przebiega szlakiem, w którym kaspazy są kluczowymi enzymami, podczas gdy autofagia obejmuje białka, które są niezbędne do tworzenia autofagosomów. Jednak w tych szlakach istnieją składniki, które są nieznane, a naukowcy próbują znaleźć sposoby ich wyjaśnienia. Ponadto naukowcy badają również, czy między szlakami śmierci komórki zachodzą jakiekolwiek "przesłuchy". Jeśli przesłuch jest obecny, ten sam sygnał może uwzględniać apoptozę, a także autofagię.
Wreszcie, popularny obszar badań dotyczy zrozumienia, dlaczego niektóre komórki - takie jak komórki rakowe - stają się nieśmiertelne. Naukowcy nieustannie poszukują mutacji w komórkach nowotworowych i oceniają, czy któraś z nich wpływa na geny kodujące czynniki zaangażowane w szlaki śmierci.
To wszystko są skomplikowane pytania, ale na szczęście badacze mają do dyspozycji wiele narzędzi, aby na nie odpowiedzieć.
Test błękitu trypanowego jest powszechnie stosowanym narzędziem przesiewowym do oceny wpływu związku na śmierć komórki. Test opiera się na barwieniu, które nie może dostać się do żywych komórek, ponieważ posiadają one "selektywne błony", ale mogą łatwo dostać się do martwych komórek, gdy ich błony są "pęknięte". Test ten identyfikuje śmierć komórki, ale nie wskazuje konkretnej ścieżki śmierci komórki.
Dlatego naukowcy zaprojektowali techniki, takie jak testy aktywności kaspazy. Ponieważ kaspazy są aktywowane podczas apoptozy, naukowcy mogą dodać substraty dla tych enzymów, które fluoryzują, gdy są aktywowane przez kaspazy. Pomaga to w identyfikacji komórek apoptotycznych.
Podobnie, fragmentację DNA, która zachodzi podczas apoptozy, można łatwo zidentyfikować za pomocą testu TUNEL, który opiera się na odczynnikach znakujących "nacięte" końce uszkodzonego DNA. Ponieważ metoda ta jest stosunkowo łatwa do wykonania, jest to powszechnie stosowany test w tej dziedzinie.
Kiedy naukowcy chcą określić mechanizm śmierci komórki zachodzący w ich populacji, mogą połączyć barwienia aneksyną V i jodkiem propidyny (PI) z analizą cytometrii przepływowej. Aneksyna V wiąże się z resztą fosfatydyloseryny w błonie, podczas gdy PI wchodzi przez uszkodzone błony, aby połączyć się z DNA. Analizując uzyskane dane, naukowcy mogą rozdzielić komórki przechodzące różne ścieżki śmierci.
Wreszcie, naukowcy mogą wykorzystać obrazowanie żywych komórek, aby zobaczyć proces śmierci komórki w czasie rzeczywistym. Jest to wszechstronna technika, którą można wykorzystać do identyfikacji komórek autofagicznych, nekrotycznych lub apoptotycznych na podstawie unikalnych cech morfologicznych.
Jak widzieliście, istnieje kilka metod wykrywania śmierci komórki, z których niektóre nie są specyficzne, inne mogą pomóc w identyfikacji komórek apoptotycznych, a niektóre rozróżniają różne szlaki.
Zobaczmy teraz, jak naukowcy wykorzystują te techniki do dokładniejszego badania śmierci komórek.
Dieta odgrywa ważną rolę w zdrowiu i może wpływać na śmierć komórek w różnych tkankach. W tym teście in vitro naukowcy wystawili neurony myszy na działanie kwasu palmitynowego, nasyconego kwasu tłuszczowego obecnego zarówno w produktach mlecznych, jak i mięsie, a następnie wykorzystali test kaspazy do oceny apoptozy. Odkryli, że komórki poddane działaniu kwasu palmitynowego wykazywały zwiększoną aktywność kaspazy i śmierć komórki.
Inni badacze używają tych testów, aby określić, w jaki sposób leki wywołują różne mechanizmy śmierci. Tutaj transgenicznym myszom z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami rakowymi wstrzyknięto doksorubicynę, lek przeciwnowotworowy. Następnie naukowcy zobrazowali komórki u żywych zwierząt i szukając zmian w morfologii komórek nowotworowych, ustalili, że leczenie farmakologiczne wywołało zarówno apoptozę, jak i martwicę.
Wreszcie, niektórzy naukowcy badają, czy śmierć komórki można odwrócić. W tym eksperymencie naukowcy wystawili ludzkie komórki rakowe na działanie etanolu i potwierdzili za pomocą różnych testów, że to leczenie spowodowało rozpoczęcie przez nie szlaku apoptozy. Po zmyciu etanolu, dotknięte chorobą komórki były w stanie odzyskać siły po apoptozie w procesie zwanym "anastazą". Dostarczyło to informacji na temat tego, w jaki sposób nowotwory mogą powrócić po leczeniu farmakologicznym.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ścieżek śmierci komórkowej. W tym filmie omówiono bogatą historię badań nad śmiercią komórkową - od czasów starożytnych do XX wieku - a następnie omówiono kilka aktualnych pytań. Wyjaśniliśmy również popularne metody oznaczania śmierci komórek i pokazaliśmy, w jaki sposób techniki te są wykorzystywane do lepszego zrozumienia związku między środowiskiem, chorobą i śmiercią komórki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Martwica, apoptoza i autofagiczna śmierć komórki to sposoby, w jakie komórki mogą umrzeć, a mechanizmy te mogą być wywołane przez różne bodźce, takie…
Paradoksalnie, śmierć komórki pomaga kształtować życie organizmu. Podobnie jak każdy cały organizm, komórki mogą umrzeć w wyniku starzenia się, przypadkowego urazu lub w wyniku infiltracji patogenu, komórka może poświęcić się, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji. W takich okolicznościach komórki mogą podążać różnymi ścieżkami śmierci, takimi jak apoptoza, autofagia lub martwica. Wszystkie te typy wykazują specyficzne cechy morfologiczne. Apoptoza lub zaprogramowana śmierć komórki prowadzi do "pęcherzenia" błony i fragmentacji jądra. Autofagia, która jest również regulowana, prowadzi do powstawania dużych wakuoli otaczających składniki komórkowe. Wreszcie martwica, która jest "nieplanowana" lub przypadkowa, kończy się lizą komórek.
W tym filmie omówimy ważne odkrycia, które doprowadziły do zidentyfikowania tych ścieżek, zbadamy pytania, które naukowcy wciąż zadają na temat śmierci komórki, omówimy narzędzia, których używają, aby na nie odpowiedzieć, a na koniec dokonamy przeglądu kilku przykładowych eksperymentów.
Najpierw przyjrzyjmy się kilku kluczowym badaczom, którzy pomogli rozszyfrować różne ścieżki śmierci komórek.
Współczesne terminy używane do opisania tych ścieżek można prześledzić wstecz do Hipokratesa, lekarza w starożytnej Grecji. Użył terminu apoptoza, oznaczającego "odpadanie", aby opisać "rozdrobnienie" kości obserwowane po złamaniu. Przechodząc do ery nowożytnej, pierwsza zauważalna wzmianka o "martwicy" pojawiła się w 1859 roku, kiedy Rudolf Virchow - w swoim kompilacji zatytułowanej Patologia komórki - użył tego terminu do opisania "zaawansowanego rozpadu tkanki".
Dziękipostępom w mikroskopii i histologii w ciągu następnej dekady, w 1877 roku Carl Weigert i Julius Cohnheim byli w stanie badać martwicę na poziomie komórkowym. Dostarczyły one informacji na temat cech morfologicznych związanych z tym typem śmierci, takich jak utrata jąder.
Prawie 70 lat później Christian de Duve odkrył "autofagię", proces, w którym składniki komórkowe są pochłaniane i rozkładane przez organelle związane z błoną zwane autofagosomami, które łączą się z innym typem organelli - lizosomami - aby dalej niszczyć ich zawartość. Obecnie wiemy, że autofagia faktycznie odgrywa podwójną rolę w komórce, ułatwiając przetrwanie lub wywołując śmierć.
W 1972 roku John Kerr, A. R. Currie i Andrew Wyllie zaobserwowali inny typ śmierci komórki o osobliwej morfologii. Ponieważ proces ten polegał na "odpadaniu" kawałków martwych komórek, nadali mu starożytną grecką nazwę apoptoza. Później apoptoza została uznana za formę "zaprogramowanej śmierci komórki" w 1977 roku, kiedy H. R. Horvitz i John Sulston badali rozwój C. elegans. Zauważyli, że określone komórki ulegają apoptozie w tym samym czasie u różnych robaków.
Ponieważ działo się to na wczesnym etapie rozwoju, zasugerowano, że geny mogą kierować apoptozą. Hipoteza ta została potwierdzona przez grupę Horvitza w latach 80-tych, kiedy zaobserwowali, że komórki z mutacjami w pewnych genach ced lub "śmierci C. elegans" nie umierały podczas rozwoju tych robaków. Później Horvitz wykazał, że gen ced-3 koduje enzym rozkładający białka zwany kaspazą. Wiemy, że istnieje kilka kaspaz, które odgrywają główną rolę w śmierci komórki.
Te postępy w dziedzinie śmierci komórek otworzyły nowe drogi do eksploracji przez badaczy. Przyjrzyjmy się niektórym z nich.
Zawsze istniało zainteresowanie ustaleniem, jakie czynniki wywołują śmierć komórki. Aby je zidentyfikować, naukowcy wystawiają obecnie komórki na promieniowanie, chemikalia i cząsteczki sygnałowe, a następnie poszukują zmian w stopniu lub rodzaju śmierci.
Inni naukowcy są zainteresowani wyjaśnieniem szlaków biochemicznych zaangażowanych w każdy mechanizm śmierci komórki. Obecnie wiemy, że apoptoza przebiega szlakiem, w którym kaspazy są kluczowymi enzymami, podczas gdy autofagia obejmuje białka, które są niezbędne do tworzenia autofagosomów. Jednak w tych szlakach istnieją składniki, które są nieznane, a naukowcy próbują znaleźć sposoby ich wyjaśnienia. Ponadto naukowcy badają również, czy między szlakami śmierci komórki zachodzą jakiekolwiek "przesłuchy". Jeśli przesłuch jest obecny, ten sam sygnał może uwzględniać apoptozę, a także autofagię.
Wreszcie, popularny obszar badań dotyczy zrozumienia, dlaczego niektóre komórki - takie jak komórki rakowe - stają się nieśmiertelne. Naukowcy nieustannie poszukują mutacji w komórkach nowotworowych i oceniają, czy któraś z nich wpływa na geny kodujące czynniki zaangażowane w szlaki śmierci.
To wszystko są skomplikowane pytania, ale na szczęście badacze mają do dyspozycji wiele narzędzi, aby na nie odpowiedzieć.
Test błękitu trypanowego jest powszechnie stosowanym narzędziem przesiewowym do oceny wpływu związku na śmierć komórki. Test opiera się na barwieniu, które nie może dostać się do żywych komórek, ponieważ posiadają one "selektywne błony", ale mogą łatwo dostać się do martwych komórek, gdy ich błony są "pęknięte". Test ten identyfikuje śmierć komórki, ale nie wskazuje konkretnej ścieżki śmierci komórki.
Dlatego naukowcy zaprojektowali techniki, takie jak testy aktywności kaspazy. Ponieważ kaspazy są aktywowane podczas apoptozy, naukowcy mogą dodać substraty dla tych enzymów, które fluoryzują, gdy są aktywowane przez kaspazy. Pomaga to w identyfikacji komórek apoptotycznych.
Podobnie, fragmentację DNA, która zachodzi podczas apoptozy, można łatwo zidentyfikować za pomocą testu TUNEL, który opiera się na odczynnikach znakujących "nacięte" końce uszkodzonego DNA. Ponieważ metoda ta jest stosunkowo łatwa do wykonania, jest to powszechnie stosowany test w tej dziedzinie.
Kiedy naukowcy chcą określić mechanizm śmierci komórki zachodzący w ich populacji, mogą połączyć barwienia aneksyną V i jodkiem propidyny (PI) z analizą cytometrii przepływowej. Aneksyna V wiąże się z resztą fosfatydyloseryny w błonie, podczas gdy PI wchodzi przez uszkodzone błony, aby połączyć się z DNA. Analizując uzyskane dane, naukowcy mogą rozdzielić komórki przechodzące różne ścieżki śmierci.
Wreszcie, naukowcy mogą wykorzystać obrazowanie żywych komórek, aby zobaczyć proces śmierci komórki w czasie rzeczywistym. Jest to wszechstronna technika, którą można wykorzystać do identyfikacji komórek autofagicznych, nekrotycznych lub apoptotycznych na podstawie unikalnych cech morfologicznych.
Jak widzieliście, istnieje kilka metod wykrywania śmierci komórki, z których niektóre nie są specyficzne, inne mogą pomóc w identyfikacji komórek apoptotycznych, a niektóre rozróżniają różne szlaki.
Zobaczmy teraz, jak naukowcy wykorzystują te techniki do dokładniejszego badania śmierci komórek.
Dieta odgrywa ważną rolę w zdrowiu i może wpływać na śmierć komórek w różnych tkankach. W tym teście in vitro naukowcy wystawili neurony myszy na działanie kwasu palmitynowego, nasyconego kwasu tłuszczowego obecnego zarówno w produktach mlecznych, jak i mięsie, a następnie wykorzystali test kaspazy do oceny apoptozy. Odkryli, że komórki poddane działaniu kwasu palmitynowego wykazywały zwiększoną aktywność kaspazy i śmierć komórki.
Inni badacze używają tych testów, aby określić, w jaki sposób leki wywołują różne mechanizmy śmierci. Tutaj transgenicznym myszom z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami rakowymi wstrzyknięto doksorubicynę, lek przeciwnowotworowy. Następnie naukowcy zobrazowali komórki u żywych zwierząt i szukając zmian w morfologii komórek nowotworowych, ustalili, że leczenie farmakologiczne wywołało zarówno apoptozę, jak i martwicę.
Wreszcie, niektórzy naukowcy badają, czy śmierć komórki można odwrócić. W tym eksperymencie naukowcy wystawili ludzkie komórki rakowe na działanie etanolu i potwierdzili za pomocą różnych testów, że to leczenie spowodowało rozpoczęcie przez nie szlaku apoptozy. Po zmyciu etanolu, dotknięte chorobą komórki były w stanie odzyskać siły po apoptozie w procesie zwanym "anastazą". Dostarczyło to informacji na temat tego, w jaki sposób nowotwory mogą powrócić po leczeniu farmakologicznym.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ścieżek śmierci komórkowej. W tym filmie omówiono bogatą historię badań nad śmiercią komórkową - od czasów starożytnych do XX wieku - a następnie omówiono kilka aktualnych pytań. Wyjaśniliśmy również popularne metody oznaczania śmierci komórek i pokazaliśmy, w jaki sposób techniki te są wykorzystywane do lepszego zrozumienia związku między środowiskiem, chorobą i śmiercią komórki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
Paradoksalnie, śmierć komórki pomaga kształtować życie organizmu. Podobnie jak każdy cały organizm, komórki mogą umrzeć w wyniku starzenia się, przypadkowego urazu lub w wyniku infiltracji patogenu, komórka może poświęcić się, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się infekcji. W takich okolicznościach komórki mogą podążać różnymi ścieżkami śmierci, takimi jak apoptoza, autofagia lub martwica. Wszystkie te typy wykazują specyficzne cechy morfologiczne. Apoptoza lub zaprogramowana śmierć komórki prowadzi do "pęcherzenia" błony i fragmentacji jądra. Autofagia, która jest również regulowana, prowadzi do powstawania dużych wakuoli otaczających składniki komórkowe. Wreszcie martwica, która jest "nieplanowana" lub przypadkowa, kończy się lizą komórek.
W tym filmie omówimy ważne odkrycia, które doprowadziły do zidentyfikowania tych ścieżek, zbadamy pytania, które naukowcy wciąż zadają na temat śmierci komórki, omówimy narzędzia, których używają, aby na nie odpowiedzieć, a na koniec dokonamy przeglądu kilku przykładowych eksperymentów.
Najpierw przyjrzyjmy się kilku kluczowym badaczom, którzy pomogli rozszyfrować różne ścieżki śmierci komórek.
Współczesne terminy używane do opisania tych ścieżek można prześledzić wstecz do Hipokratesa, lekarza w starożytnej Grecji. Użył terminu apoptoza, oznaczającego "odpadanie", aby opisać "rozdrobnienie" kości obserwowane po złamaniu. Przechodząc do ery nowożytnej, pierwsza zauważalna wzmianka o "martwicy" pojawiła się w 1859 roku, kiedy Rudolf Virchow - w swoim kompilacji zatytułowanej Patologia komórki - użył tego terminu do opisania "zaawansowanego rozpadu tkanki".
Dziękipostępom w mikroskopii i histologii w ciągu następnej dekady, w 1877 roku Carl Weigert i Julius Cohnheim byli w stanie badać martwicę na poziomie komórkowym. Dostarczyły one informacji na temat cech morfologicznych związanych z tym typem śmierci, takich jak utrata jąder.
Prawie 70 lat później Christian de Duve odkrył "autofagię", proces, w którym składniki komórkowe są pochłaniane i rozkładane przez organelle związane z błoną zwane autofagosomami, które łączą się z innym typem organelli - lizosomami - aby dalej niszczyć ich zawartość. Obecnie wiemy, że autofagia faktycznie odgrywa podwójną rolę w komórce, ułatwiając przetrwanie lub wywołując śmierć.
W 1972 roku John Kerr, A. R. Currie i Andrew Wyllie zaobserwowali inny typ śmierci komórki o osobliwej morfologii. Ponieważ proces ten polegał na "odpadaniu" kawałków martwych komórek, nadali mu starożytną grecką nazwę apoptoza. Później apoptoza została uznana za formę "zaprogramowanej śmierci komórki" w 1977 roku, kiedy H. R. Horvitz i John Sulston badali rozwój C. elegans. Zauważyli, że określone komórki ulegają apoptozie w tym samym czasie u różnych robaków.
Ponieważ działo się to na wczesnym etapie rozwoju, zasugerowano, że geny mogą kierować apoptozą. Hipoteza ta została potwierdzona przez grupę Horvitza w latach 80-tych, kiedy zaobserwowali, że komórki z mutacjami w pewnych genach ced lub "śmierci C. elegans" nie umierały podczas rozwoju tych robaków. Później Horvitz wykazał, że gen ced-3 koduje enzym rozkładający białka zwany kaspazą. Wiemy, że istnieje kilka kaspaz, które odgrywają główną rolę w śmierci komórki.
Te postępy w dziedzinie śmierci komórek otworzyły nowe drogi do eksploracji przez badaczy. Przyjrzyjmy się niektórym z nich.
Zawsze istniało zainteresowanie ustaleniem, jakie czynniki wywołują śmierć komórki. Aby je zidentyfikować, naukowcy wystawiają obecnie komórki na promieniowanie, chemikalia i cząsteczki sygnałowe, a następnie poszukują zmian w stopniu lub rodzaju śmierci.
Inni naukowcy są zainteresowani wyjaśnieniem szlaków biochemicznych zaangażowanych w każdy mechanizm śmierci komórki. Obecnie wiemy, że apoptoza przebiega szlakiem, w którym kaspazy są kluczowymi enzymami, podczas gdy autofagia obejmuje białka, które są niezbędne do tworzenia autofagosomów. Jednak w tych szlakach istnieją składniki, które są nieznane, a naukowcy próbują znaleźć sposoby ich wyjaśnienia. Ponadto naukowcy badają również, czy między szlakami śmierci komórki zachodzą jakiekolwiek "przesłuchy". Jeśli przesłuch jest obecny, ten sam sygnał może uwzględniać apoptozę, a także autofagię.
Wreszcie, popularny obszar badań dotyczy zrozumienia, dlaczego niektóre komórki - takie jak komórki rakowe - stają się nieśmiertelne. Naukowcy nieustannie poszukują mutacji w komórkach nowotworowych i oceniają, czy któraś z nich wpływa na geny kodujące czynniki zaangażowane w szlaki śmierci.
To wszystko są skomplikowane pytania, ale na szczęście badacze mają do dyspozycji wiele narzędzi, aby na nie odpowiedzieć.
Test błękitu trypanowego jest powszechnie stosowanym narzędziem przesiewowym do oceny wpływu związku na śmierć komórki. Test opiera się na barwieniu, które nie może dostać się do żywych komórek, ponieważ posiadają one "selektywne błony", ale mogą łatwo dostać się do martwych komórek, gdy ich błony są "pęknięte". Test ten identyfikuje śmierć komórki, ale nie wskazuje konkretnej ścieżki śmierci komórki.
Dlatego naukowcy zaprojektowali techniki, takie jak testy aktywności kaspazy. Ponieważ kaspazy są aktywowane podczas apoptozy, naukowcy mogą dodać substraty dla tych enzymów, które fluoryzują, gdy są aktywowane przez kaspazy. Pomaga to w identyfikacji komórek apoptotycznych.
Podobnie, fragmentację DNA, która zachodzi podczas apoptozy, można łatwo zidentyfikować za pomocą testu TUNEL, który opiera się na odczynnikach znakujących "nacięte" końce uszkodzonego DNA. Ponieważ metoda ta jest stosunkowo łatwa do wykonania, jest to powszechnie stosowany test w tej dziedzinie.
Kiedy naukowcy chcą określić mechanizm śmierci komórki zachodzący w ich populacji, mogą połączyć barwienia aneksyną V i jodkiem propidyny (PI) z analizą cytometrii przepływowej. Aneksyna V wiąże się z resztą fosfatydyloseryny w błonie, podczas gdy PI wchodzi przez uszkodzone błony, aby połączyć się z DNA. Analizując uzyskane dane, naukowcy mogą rozdzielić komórki przechodzące różne ścieżki śmierci.
Wreszcie, naukowcy mogą wykorzystać obrazowanie żywych komórek, aby zobaczyć proces śmierci komórki w czasie rzeczywistym. Jest to wszechstronna technika, którą można wykorzystać do identyfikacji komórek autofagicznych, nekrotycznych lub apoptotycznych na podstawie unikalnych cech morfologicznych.
Jak widzieliście, istnieje kilka metod wykrywania śmierci komórki, z których niektóre nie są specyficzne, inne mogą pomóc w identyfikacji komórek apoptotycznych, a niektóre rozróżniają różne szlaki.
Zobaczmy teraz, jak naukowcy wykorzystują te techniki do dokładniejszego badania śmierci komórek.
Dieta odgrywa ważną rolę w zdrowiu i może wpływać na śmierć komórek w różnych tkankach. W tym teście in vitro naukowcy wystawili neurony myszy na działanie kwasu palmitynowego, nasyconego kwasu tłuszczowego obecnego zarówno w produktach mlecznych, jak i mięsie, a następnie wykorzystali test kaspazy do oceny apoptozy. Odkryli, że komórki poddane działaniu kwasu palmitynowego wykazywały zwiększoną aktywność kaspazy i śmierć komórki.
Inni badacze używają tych testów, aby określić, w jaki sposób leki wywołują różne mechanizmy śmierci. Tutaj transgenicznym myszom z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami rakowymi wstrzyknięto doksorubicynę, lek przeciwnowotworowy. Następnie naukowcy zobrazowali komórki u żywych zwierząt i szukając zmian w morfologii komórek nowotworowych, ustalili, że leczenie farmakologiczne wywołało zarówno apoptozę, jak i martwicę.
Wreszcie, niektórzy naukowcy badają, czy śmierć komórki można odwrócić. W tym eksperymencie naukowcy wystawili ludzkie komórki rakowe na działanie etanolu i potwierdzili za pomocą różnych testów, że to leczenie spowodowało rozpoczęcie przez nie szlaku apoptozy. Po zmyciu etanolu, dotknięte chorobą komórki były w stanie odzyskać siły po apoptozie w procesie zwanym "anastazą". Dostarczyło to informacji na temat tego, w jaki sposób nowotwory mogą powrócić po leczeniu farmakologicznym.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do ścieżek śmierci komórkowej. W tym filmie omówiono bogatą historię badań nad śmiercią komórkową - od czasów starożytnych do XX wieku - a następnie omówiono kilka aktualnych pytań. Wyjaśniliśmy również popularne metody oznaczania śmierci komórek i pokazaliśmy, w jaki sposób techniki te są wykorzystywane do lepszego zrozumienia związku między środowiskiem, chorobą i śmiercią komórki. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the three main types of cell death pathways?
Cells can die through apoptosis, autophagy, or necrosis. Apoptosis is programmed cell death characterized by membrane blebbing and nuclear fragmentation. Autophagy, also regulated, involves formation of large vacuoles enclosing cellular components. Necrosis is unplanned cell death resulting in cell lysis and loss of nuclei.
Q2: How do caspases function in apoptosis?
Caspases are protein-degrading enzymes that serve as key regulators in the apoptosis pathway. These enzymes are activated during programmed cell death and can be detected using caspase activity assays, where fluorescent substrates reveal their activation. The ced-3 gene encodes caspase, linking genetic control to apoptotic mechanisms.
Q3: What is the trypan blue assay used for in cell death research?
The trypan blue assay is a screening tool that identifies cell death by exploiting membrane differences. The stain cannot enter live cells with selective membranes but easily enters dead cells with ruptured membranes. However, this assay identifies cell death generally without pinpointing the specific pathway involved.
Q4: How can researchers distinguish between different cell death pathways?
Researchers use annexin V and propidium iodide stains paired with flow cytometry analysis to distinguish death pathways. Annexin V binds to phosphatidylserine residues in membranes, while propidium iodide enters damaged membranes to associate with DNA. This combination allows scientists to separate cells undergoing different death mechanisms.
Q5: What role does autophagy play in cell survival and death?
Autophagy is a regulated process where cellular components are engulfed and broken down by autophagosomes, which fuse with lysosomes for further destruction. This process plays a dual role in cells, either facilitating survival during nutrient stress or inducing death when dysregulated. Christian de Duve's discovery revealed this fundamental cellular mechanism.
Q6: How did research in C. elegans worms advance understanding of apoptosis?
Studies of C. elegans development revealed that specific cells undergo apoptosis at consistent times across different worms, suggesting genetic control. Researchers identified ced genes responsible for this process, with mutations preventing programmed cell death during development. This work established that apoptosis is genetically regulated rather than random.
Q7: What can live cell imaging reveal about cell death mechanisms?
Live cell imaging allows scientists to observe cell death in real time and identify autophagic, necrotic, or apoptotic cells based on unique morphological features. This all-encompassing technique provides visual confirmation of death pathways without requiring cell fixation. It complements biochemical assays by showing dynamic cellular changes during death.
Chapters in this video
0:00
Overview
1:20
A Brief History of the Field
4:01
Key Questions
5:31
Prominent Methods
7:50
Applications
9:28
Summary
Videos from this collection: