Wytwarzanie i charakterystyka rusztowań z włókien modyfikowanych przez Griffithsin w celu zapobiegania infekcjom przenoszonym drogą płciową

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie i modyfikacja powierzchniowa kwasu polimlekowego, kwasu koglikolowego, włókien elektroprzędzonych, z różnymi ilościami białka przeciwwirusowego Griffithsin. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie dostarczania leków, takie jak sposób formułowania i charakteryzowania nowych pojazdów dostawczych, które mogą zapobiegać infekcjom wirusowym przenoszonym drogą płciową, takim jak HIV-1. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność przeciwwirusowa Griffithsina jest maksymalizowana poprzez zastosowanie polimerowo-elektroprzędzonych włókien jako stacjonarnego rusztowania dla wysoce zlokalizowanej Griffithsiny na powierzchni włókna.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię innych infekcji wirusowych i bakteryjnych, ze względu na silny potencjał profilaktyczny i terapeutyczny Griffithsina przeciwko różnym typom infekcji. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat zapobiegania zakażeniu HIV-1, może być również stosowana do innych systemów, takich jak inne infekcje wirusowe lub bakteryjne, w których Griffithsin wykazał moc. Aby rozpocząć tę procedurę, zważyć 720 miligramów 50/50 PLGA do 10-mililitrowego scyntylacyjnego podłego.

Za pomocą szklanej pipety serologicznej dodaj 3,0 mililitrów HFIP. Przykryj podłość folią z tworzywa sztucznego. Następnie zmierz i zapisz ohydną masę.

Zawiesinę polimerową inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie polimeru. Następnie należy przygotować urządzenie do elektroprzędzenia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Użyj trzymililitrowej strzykawki, aby zassać roztwór polimeru.

Następnie podłączyć końcówkę igły o rozmiarze 18 i średnicy 0,5 cala do strzykawki. Dozować nadmiar roztworu, aby usunąć pustą przestrzeń w igle. Umieścić strzykawkę na pompie strzykawkowej i ustawić natężenie przepływu instrumentu na 2,0 mililitrów na godzinę.

Podłączyć źródło zasilania do igły strzykawki. Elektrowiruj roztwór polimeru przy użyciu napięcia dodatniego 27 kilowoltów. Po elektroprzędzeniu całego roztworu wyłącz źródło zasilania.

Pozwól trzpieniu wirować przez dodatkowe 30 minut, aby całkowicie odparować rozpuszczalnik. Następnie wyłącz obracający się kolektor trzpienia. Za pomocą żyletki delikatnie oderwij włókno od trzpienia.

Zbierz elektroprzędzone włókno PLGA na oznaczoną szalkę Petriego. Umieść naczynie na noc w eksykatorze, aby usunąć resztki rozpuszczalnika. Na początek przygotuj rozwiązania PBS i MES zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Następnie wyjmij EDC i NHS z zamrażarki. Pozwól im odpocząć, aby zrównoważyły się do temperatury pokojowej. Następnie zważ cztery miligramy EDC do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Zważ sześć miligramów NHS do innej probówki do mikrowirówki. Dodaj jeden mililitr buforu MES do każdej probówki. Energicznie wymieszaj obie probówki, aby upewnić się, że odczynniki są całkowicie rozpuszczone.

Następnie zważ 70 miligramów hydroksyloaminy do 50-mililitrowej stożkowej probówki wirówkowej. Dodaj 20 mililitrów PBS i wiruj. Zmasuj odpowiednią ilość włókna PLGA w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 mililitrów.

Dodaj osiem mililitrów buforu MES do włókna. Następnie dodaj jeden mililitr roztworów EDC i NHS. Użyj folii z tworzywa sztucznego, aby uszczelnić stożkową probówkę wirówkową o pojemności 15 mililitrów.

Umieść probówkę na rotatorze, aby delikatnie odwrócić roztwór przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 14 mikrolitrów beta-merkaptoetanolu, aby wygasić reakcję. Odwróć rurkę kilka razy, aby zapewnić całkowite wymieszanie.

Wyrzuć supernatant i przepłucz włókno PLGA dwukrotnie, używając 10 mililitrów PBS na każde pranie. Dodać odpowiednią ilość roztworu podstawowego GRFT do probówki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie dodaj tyle PBS, aby doprowadzić końcową objętość do ośmiu mililitrów.

Zamknij i odwróć rurkę, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Uszczelnij rurkę folią z tworzywa sztucznego. Umieść rurkę na rotatorze, aby delikatnie odwrócić roztwór na dwie godziny.

Następnie wygasić reakcję, dodając dwa mililitry przygotowanego roztworu hydroksyloaminy i wirując przez 30 sekund. Odrzucić supernatant. Dwukrotnie spłucz powierzchnię zmodyfikowanego włókna PLGA, używając 10 mililitrów ultra czystej wody i wirując przy każdym praniu.

Następnie przenieś umyte włókno na szalkę Petriego. Umieść szalkę Petriego w eksykatorze, aż włókno całkowicie wyschnie. Następnie przechowuj szalkę Petriego w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Na początek ustaw trzy 1,5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe. Do każdego z nich wmasuj dwa miligramy błonnika. Następnie dodaj jeden mililitr DMSO do każdej probówki.

Wiruj przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, aby całkowicie rozpuścić włókno. Następnie rozcieńczyć podwielokrotność 10 mikrolitrów co najmniej 100 razy w buforze TE. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż do momentu załadowania charakterystyki za pomocą Elizy.

Odważ od 5 do 10 miligramów włókna modyfikowanego powierzchniowo i przenieś je do probówki mikrowirówkowej. Zapisz masę włókna umieszczoną w każdej probówce. Następnie dodaj jeden mililitr roztworu, który naśladuje środowisko fizjologiczne każdej próbki.

Próbki należy inkubować na obrotowej wytrząsarce z prędkością 200 obr./min i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Następnie należy usunąć około jednego mililitra roztworu zawierającego zdesorbowany GRFT i podzielić go na probówki zbiorcze. Przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do przeprowadzenia kwantyfikacji białka.

Następnie przenieś próbkę do nowej probówki do mikrowirówki. Dodać jeden mililitr świeżego roztworu buforowego i inkubować do następnego punktu czasowego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W niniejszej pracy zbadano warunki wytwarzania włókien elektroprzędzonych PLGA.

Analiza SEM ślepej próby, 0,05 nanomola, 0,5 nanomola i 5 nanomoli włókien GRFT wskazuje, że modyfikacja GRFT nie ma wpływu na morfologię włókien. Stwierdzono, że wszystkie formacje mają podobne średnie średnice, około 1,9 mikrona, co świadczy o spójności zmodyfikowanego procesu wytwarzania we wszystkich partiach. Następnie określa się ilość GRFT sprzężonego z elektroprzędzonymi włóknami.

Modyfikacja 5 nanomoli zawiera 373 nanogramy GRFT, podczas gdy modyfikacje 0,5 i 0,05 zawierają odpowiednio 165 i 42. Pokazuje to, że włókna sprzężone z wyższą teoretyczną gęstością modyfikacji powierzchni skutkują większą ilością GRFT sprzężonego z włóknem. Jednak w wynikowej wydajności koniugacji można zaobserwować odwrotną korelację.

Następnie ocenia się ilość GRFT kowalencyjnie sprzężonego z włóknem. W ciągu pierwszych czterech godzin wykrywa się 113 nanogramów, 25 nanogramów i 10 nanogramów GRFT na miligram elektroprzędzonego włókna odpowiednio w teoretycznych stężeniach modyfikacji 5 nanomoli, 0,5 nanomola i 0,05 nanomola. Po czterech godzinach wykrywa się znikomy GRFT w elucji uwalniającej dla wszystkich trzech preparatów.

Dane te wskazują, że większość GRFT jest kowalencyjnie związana z włóknami elektroprzędzonymi i że powierzchnia wchłoniętego GRFT jest uwalniana w ciągu pierwszych czterech godzin. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery dni. Elektroprzędzenie rusztowania z włókna polimerowego wymaga dwóch dni na przygotowanie roztworu polimeru i elektrowirowanie.

Natomiast modyfikacja powierzchni, późniejsze suszenie i charakteryzacja włókien wymagały co najmniej dwóch dodatkowych dni. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu odpowiednich proporcji odczynników, aby zapewnić optymalną modyfikację. Ponadto ważne jest również sprawdzenie, czy parametry przędzenia elektrycznego są prawidłowe, aby zapewnić odpowiednią morfologię włókien.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się dostarczaniem leków do wytwarzania elektroprzędzonych włókien, które nie tylko zamykają środki przeciwwirusowe we włóknie, ale mają zdolność do koniugacji czynników aktywnych przez powierzchnię włókna. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak elektrowirować włókno polimerowe, wykonywać modyfikację powierzchni włókna za pomocą przeciwwirusowego białka Griffithsin i jakościowej Griffithsin sprzężonej z włóknem. Nie zapominaj, że praca z odczynnikami takimi jak HFIP, beta-merkaptoetanol, EDC i NHS może być niezwykle niebezpieczna.

Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak prawidłowe stosowanie środków ochrony indywidualnej i stosowanie dygestoriów chemicznych.