Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ogólnym celem tej techniki jest monitorowanie aktywności synaptycznej wizualizowanych bulionów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw drosophila. Doskonały system modelowy, który można łatwo dostosować do manipulacji genetycznych. Ta technika może odpowiedzieć na kluczowe pytania w twojej nauce.

Na przykład, w jaki sposób mutacje białek synaptycznych regulują przekaźnictwo synaptyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność ograniczonej liczby miejsc uwalniania może być monitorowana i rejestrowana prądy o szybkiej kinetyce i może być łatwo rozwiązana. Aby rozpocząć eksperyment: przygotuj ściągacz mikroelektrod.

Użyj mikroskopu przy 35-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że wewnętrzna średnica ciągniętej elektrody mieści się w zakresie od siedmiu do dziesięciu mikrometrów. Przechowuj kapilary w szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu. Następnie wypal wypolerowane kapilary za pomocą mikrokuźni.

Upewnij się, że ostateczna średnica wewnętrzna polerowanej elektrody wynosi pięć mikrometrów. Następnie przejdź do gięcia. Zamocuj elektrodę w manipulatorze i umieść końcówkę nad filamentem, nie dotykając go.

Ustaw wartość ciepła na 60-70% maksimum i naciśnij pedał mikrokuźni przez jedną do dwóch sekund, aby podgrzać filament. Użyj igły w kształcie litery L, aby delikatnie pociągnąć w dół końcówkę elektrody i wykonaj zgięcie pod kątem około 90 stopni. Przytrzymaj ręcznie elektrodę nad płomieniem palnika i wykonaj drugie zagięcie w odległości od siedmiu do dziesięciu milimetrów od pierwszego zagięcia i pod kątem około 120 stopni.

Przygotuj roztwór podobny do hemolimfy lub HL3. Przechowuj roztwór w lodówce i co tydzień rób go świeżym. Pipety stymulacyjne należy przygotować w taki sam sposób, jak szklane pipety do nagrywania, bez ich zginania.

Następnie należy umieścić pipetę stymulacyjną w uchwycie mikroelektrody podłączonym do strzykawki. Wyprodukowano płytki preparacyjne z małych szalek Petriego pokrytych żywicą epoksydową z kauczuku silikonowego. Następnie za pomocą kleszczy wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki.

Przypnij larwy, umieszczając pierwszą szpilkę z tyłu, a drugą szpilkę z przodu, w pobliżu haczyków gębowych. Dodaj roztwór HL3. Po grzbietowej stronie larw wykonaj cięcie nożyczkami sprężynowymi od górnego kołka do dolnego kołka.

Przypnij filet z larw, umieszczając dwie dodatkowe szpilki po lewej i prawej stronie larwy. Usuń wnętrzności i tchawicę za pomocą kleszczy. Przetnij nerwy tuż poza brzusznym rdzeniem nerwowym za pomocą nożyczek sprężynowych.

Umieść szalkę Petriego z preparatem na stoliku mikroskopowym. Włóż elektrodę odniesienia do kąpieli. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem HL3.

Pod obiektywem 10X zanurz elektrodę w kąpieli i umieść ją na mięśniach szóstym i siódmym brzucha dwóch, trzech lub czterech za pomocą mikromanipulatora. Następnie przełącz obiektyw na 60X i skup się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki epi-florescencji lub DIC. Umieść końcówkę elektrody na szczycie synaptycznego boutonu, a następnie bardzo delikatnie dociśnij elektrodę do mięśnia, ponieważ nadmierny nacisk może uszkodzić NMJ lub wywołać wzrost spontanicznej aktywności synaptycznej.

Następnie włącz wzmacniacz, płytkę AD i komputer. Następnie wybierz tryb cęgów napięcia na wzmacniaczu. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i wybierz tryb bez przerw i obserwuj wygląd MEJC na ekranie komputera.

Upewnij się, że amplituda MEJC mieści się w zakresie od 0,2 do 0,7 nanoampera. Za pomocą mikromanipulatora pod kontrolą wizualną umieść elektrodę stymulacyjną w pobliżu aksonu unerwiającego segmenty brzucha od drugiego do czwartego. Zastosować podciśnienie, pociągając za tłok strzykawki podłączonej do uchwytu elektrody, tak aby akson został wciągnięty do wnętrza elektrody.

Następnie włącz stymulator. Przekręć pokrętło na jednostce izolacyjnej, aby ustawić prąd zerowy, a następnie delikatnie go zwiększaj, aż pojawią się EJC lub aż do osiągnięcia progu. Wykonaj stymulację w reżimie superprogowym.

Wraz ze stymulacją prąd wzrasta około dwukrotnie w porównaniu z progiem dla obserwacji EJC. Zmierz rezystancję uszczelnienia elektrody rejestrującej makro-patch, przekręcając przełącznik rezystancji elektrody amplifier do pozycji testowej uszczelnienia. Obserwuj wartość rezystancji uszczelki w gigaomach, która zostanie wyświetlona w bieżącym oknie.

Ogniskowe zapisy makro patchy umożliwiają monitorowanie aktywności synaptycznej z wybranych nalotów synaptycznych. Gdy elektroda jest umieszczona na szczycie synaptycznego boutonu, zarejestrowane MEJC mają amplitudy znacznie przekraczające poziom szumu i ostre fazy narastania w zakresie poniżej milisekundy. Gdy elektroda rejestrująca jest odsunięta od węzła synaptycznego o kilka mikronów, amplitudy MEJC rejestratora spadają prawie do poziomu szumu.

Nagrane EJC są ledwo widoczne w hałasie i mają wydłużone fazy narastania. Nagrania ogniskowe umożliwiają dokładne wykrycie MEJC w kompleksie i mutancie gnomów. Podczas gdy zapisy międzykomórkowe z tego mutanta wykazują zdarzenia uwalniania, które nakładają się na siebie i nie można ich wiarygodnie wykryć.

Regulacja kątów elektroukładu ma kluczowe znaczenie dla pozycjonowania elektrody. Podążając za tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak sprawdzanie obrazowania poszczególnych zdarzeń wydania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak integracja aktywności poszczególnych stref aktywnych.