Name: Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Poznaj technikę ogniskowych zapisów makroplastowych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Ta metoda umożliwia monitorowanie aktywności synaptycznej pojedynczych boutonów i badanie wpływu mutacji białek synaptycznych na transmisję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wspierane przez grant NIH R01 MH 099557

1. Wytwarzanie elektrod rejestrujących
<ol>
	<li>Wytciąganie elektrod szklanych
	<ol>
		<li>W przypadku wyciągarki do mikroelektrod zastosuj następujący protokół (patrz Tabela materiałów):
		<ol>
			<li>Linia 1: Grzanie 510 Wyciąganie - Prędkość 30 Czas 250; Linia 2: Grzanie 490 Wyciąganie - Prędkość 30 Czas 250. 
			UWAGA: Jednostki czasu odpowiadają 0,5 ms na jednostkę; pozostałe jednostki są wartościami względnymi. Wartość grzania należy dostosować dla każdego włókna po przeprowadzeniu testu rampy.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Używając mikroskopu (powiększenie 35x), upewnij się, że średnica wewnętrzna wyciągniętej elektrody mieści się w zakresie 7 - 10 µm (Rycina 1A). Przechowuj kapilary w szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Polerowanie ogniowe
	<ol>
		<li>Wypoleruj ogniowo kapilary (80 - 90% maksymalnej wartości grzania przez 1 - 2 s) przy użyciu mikrokuźni (patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że końcowa średnica wewnętrzna wypolerowanej elektrody wynosi 5 µm (Rycina 1A)27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gięcie 
	UWAGA: Wykonuje się dwa zgięcia, aby odpowiednio ustawić elektrodę nad mięśniem przy użyciu obiektywu o dużym powiększeniu.
	<ol>
		<li>Użyj aparatury przedstawionej na Rycynie 1B. Zamocuj elektrodę w manipulatorze i ustaw końcówkę nad włóknem, tak aby go nie dotykała.</li>
		<li>Ustaw wartość grzania na 60 - 70% maksimum i naciśnij pedał mikrokuźni na 1 - 2 s (patrz Tabela materiałów), aby rozgrzać włókno. Używając igły w kształcie litery L, delikatnie pociągnij końcówkę elektrody w dół (Rycina 1B powiększenie). Wykonaj zgięcie pod kątem około 90o (Rycina 1C).</li>
		<li>Trzymając elektrodę pęsetą w płomieniu palnika, wykonaj drugie zgięcie w odległości 7 - 10 mm od pierwszego zgięcia, pod kątem około 120o (Rycina 1C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Przygotowanie rurki kapilarnej, konfiguracja mikroskopu, manipulacja szkłem; proces eksperymentu laboratoryjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Końcowe etapy wytwarzania mikropipety. (A) Końcówki elektrod po wyciąganiu i polerowaniu ogniowym. (B.1) Konfiguracja do zginania końcówki. (B.2) Obszar zaznaczony ramką przedstawiono w powiększeniu po prawej stronie. Elektroda i włókno są zamocowane tak, aby końcówka elektrody znajdowała się nieco powyżej drutu i go nie dotykała. (C.1) Elektroda rejestrująca. (C.2) Obszar zaznaczony ramką przedstawiono w powiększeniu po prawej stronie. Pierwsze zgięcie ma kąt około 90°, a odległość między pierwszym zgięciem a końcówką elektrody wynosi około 1 mm. Pasek skali = 3 mm. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
2. Dodatkowe kroki przygotowawcze
<ol>
	<li>Przygotować roztwór imitujący hemolimfę (HL3) (w mM): 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl22, 10 NaHCO33, 5 trehalozy, 115 sacharozy, 5 HEPES oraz 1 mM CaCl22; dostosować pH do wartości 7,3 – 7,4. Roztwór przechowywać w lodówce i przygotowywać na świeżo co tydzień.</li>
	<li>Przygotuj pipety stymulujące w ten sam sposób, co szklane pipety rejestrujące, z wyjątkiem tego, że nie ma potrzeby ich wyginania. 
	UWAGA: Przygotowanie elektrod stymulujących zostało szczegółowo opisane w 28 i 27Końcowa średnica po wypalaniu powinna mieścić się w zakresie 5 - 7 µm.</li>
	<li>Włóż pipetę stymulacyjną do uchwytu mikroelektrody połączonego ze strzykawką.</li>
	<li>Wytwarzanie płytek sekcyjnych z małych szalek Petriego (35 x 10 mm) powleczonych silikonową żywicą epoksydową (patrz Tabela materiałów) zgodnie z opisem w 28. 
	UWAGA: Guma silikonowa powinna być całkowicie utwardzona przed użyciem.</li>
	<li>Wybierz wędrującą larwę trzeciego stadium i przeprowadź jej sekcję zgodnie z opisem w27,28,29,30. 
	UWAGA: Aby zwizualizować zakończenia presynaptyczne (boutons), należy użyć szczepu muchy CD8-GFP (patrz Tabela materiałów)
	<ol>
		<li>Używając pęsety (patrz Tabela materiałów), wybierz 3rd larwy w stadium instaru z fiolki.</li>
		<li>Przytwierdź larwy szpilkami, umieszczając pierwszą szpilkę w części tylnej, a drugą w części przedniej (blisko haczyków gębowych).</li>
		<li>Dodać roztwór HL3.</li>
		<li>Wykonaj cięcie za pomocą nożyczek sprężynowych (patrz Tabela materiałówcałą drogę od górnego do dolnego pinu po stronie grzbietowej larw.</li>
		<li>Przyikłuj odwłok larwy, umieszczając 2 dodatkowe szpilki po lewej i prawej stronie larwy.</li>
		<li>Za pomocą pęsety usuń wnętrzności oraz tchawice.</li>
		<li>Przetnij nerwy tuż poza brzusznym sznurem nerwowym, używając nożyczek sprężynowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rejestracje elektryczne EJC
<img alt="Układ mikroskopowy do wzbudzenia optycznego w spektroskopii; obejmuje stoлик, soczewki i sterowniki przewodowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Układ rejestracyjny. Próbka NMJ przymocowana do szalki Petriego powlekanej krzemem (strzałka) jest umieszczona na ruchomym stoliku pionowego mikroskopu złożonego wyposażonego w funkcję epifluorescencji, obiektyw o dużym powiększeniu oraz dwa mikromanipulatory. Mikroskop znajduje się na stole antywibracyjnym. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol>
	<li>Rejestracja
	<ol>
		<li>Umieść szalkę Petriego z preparatem na stoliku mikroskopu (Rysunek 2). Włóż elektrodę referencyjną do kąpieli.</li>
		<li>Wypełnij elektrodę rejestrującą roztworem HL3. Przy użyciu obiektywu 10x (patrz Tabela materiałów), zanurz elektrodę w kąpieli i umieść ją nad mięśniami 6 i 7 segmentów brzusznych 2, 3 lub 4, korzystając z mikromanipulatora (patrz Tabela materiałów) (Rysunek 3 A.1 i A.2).</li>
		<li>Przełącz obiektyw na 60x (patrz Tabela materiałów). Skup się na obszarze zainteresowania, korzystając z optyki epi-fluorescencyjnej lub DIC. Umieść końcówkę elektrody na szczycie wypustki synaptycznej (Rysunek 3 B.1-3).</li>
		<li>Bardzo delikatnie dociśnij elektrodę do mięśnia. Nadmierny nacisk może uszkodzić NMJ lub wywołać wzrost spontanicznej aktywności synaptycznej. Upewnij się, że końcówka elektrody nie jest zatkana – jeśli tak, wymień ją.</li>
		<li>Włącz wzmacniacz, płytkę A/D oraz komputer.</li>
		<li>Wybierz tryb voltage clamp na wzmacniaczu.</li>
		<li>Uruchom oprogramowanie do akwizycji i wybierz tryb „gap-free”.</li>
		<li>Obserwuj pojawienie się mEJC na ekranie komputera.</li>
		<li>Upewnij się, że amplituda mEJC mieści się w zakresie 0.2 - 0.7 nA. 
		UWAGA: Mniejsze EJC wskazują na defekty elektrody rejestrującej lub jej niewłaściwe rozmieszczenie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Wprowadzenie elektrody do tkanki nerwowej; obrazowanie optyczne i mikroskopowe; układ eksperymentalny i wyniki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wizualizacja wypustek synaptycznych (boutons). (A) Obraz w jasnym polu hemi-segmentu przy powiększeniu 10x (A.1) oraz powiększony obszar zaznaczony ramką przedstawiający mięśnie 6 i 7 (A.2, strzałka wskazuje elektrodę rejestrującą). Pasek skali = 50 µm. (B) Wypustki synaptyczne są wizualizowane w linii Drosophila z genetycznie kodowanym markerem neuronalnym (CD8-GFP) przy użyciu obrazowania epi-fluorescencyjnego (B.1) lub optyki DIC (B.2). Obrazy wykonano z użyciem obiektywu 60x i kostki filtrującej do obrazowania GFP (patrz Tabela materiałów). Wypustki synaptyczne są zaznaczone strzałkami, a na obrazie B.3 przedstawiono nałożenie obrazów fluorescencyjnego i DIC. Pasek skali = 10 µm. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig3large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<ol start="2">
	<li>Stymulacja
	<ol>
		<li>Za pomocą mikromanipulatora, pod kontrolą wizualną, umieść elektrodę stymulującą w pobliżu aksonu unerwiającego segmenty brzuszne 2 - 4.</li>
		<li>Wytwórz podciśnienie, odciągając tłok strzykawki połączonej z uchwytem elektrody, tak aby akson został wciągnięty do wnętrza elektrody (Rysunek 2).</li>
		<li>Włącz stymulator. Przekręć pokrętło w jednostce izolacyjnej (patrz Tabela materiałów), aby ustawić prąd na zero, a następnie delikatnie go zwiększaj, aż pojawią się EJCs (lub aż zostanie osiągnięty próg).</li>
		<li>Przeprowadź stymulację w reżimie nadprogowym, zwiększając prąd stymulujący około dwukrotnie w porównaniu do progu obserwacji EJCs. 
		UWAGA: W naszym doświadczeniu taka intensywność stymulacji jest optymalna, aby uniknąć błędów potencjału czynnościowego oraz niekontrolowanego wyzwalania potencjałów czynnościowych. Na przykład, jeśli EJCs pojawiają się przy prądzie stymulującym 0,2 mA, przez cały eksperyment stosuj prąd 0,4 mA.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rezystancja uszczelnienia
	<ol>
		<li>Zmierz rezystancję uszczelnienia rejestrującej elektrody macropatch, przełączając przełącznik rezystancji elektrody wzmacniacza w pozycję „seal test”. Zauważ, że wartość rezystancji uszczelnienia w GΩ zostanie wyświetlona w oknie „current”.</li>
		<li>Upewnij się, że rezystancja uszczelnienia mieści się w zakresie 0,5 - 2 MΩ. Wartości spoza tego zakresu wskazują, że elektroda nie została prawidłowo wypolerowana lub nieprawidłowo ustawiona.</li>
		<li>Monitoruj rezystancję uszczelnienia podczas rejestracji, upewniając się, że pozostaje ona stała przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza
<ol>
	<li>Przeanalizuj zapisy, korzystając z dostosowanego oprogramowania analitycznego (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: W naszym laboratorium stosujemy autorskie oprogramowanie Quantan31, które zostało dostosowane do detekcji EJCs oraz mEJCs rejestrowanych ogniskowo (Rysunek 4). Oprogramowanie to zawiera cyfrowy filtr Gaussa i umożliwia detekcję pików kwantowych w nakładających się zdarzeniach wielokwantowych (Rysunek 4A). Inne podejścia opisano w17.</li>
</ol>
<img alt="Schemat elektrofizjologiczny przedstawiający amplitudę mEJC i EJC w czasie w skalach 0,2 nA i 0,5 nA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56493/56493fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analiza kwantowa. Wykrywanie mEJC (A) i EJC (B) za pomocą oprogramowania Quantan. Obszar zdarzenia zaznaczono na zielono, a piki zaznaczono czerwonymi grotami strzałek. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56493/56493fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster.</a> J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).</li>
<li>Katz, B., Miledi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+on+the+synaptic+delay+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction.</a> J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).</li>
<li>Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+proteins+and+quantal+release+at+single+active+zones+of+amphibian+%28Bufo+marinus%29+motor-nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).</li>
<li>Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+secretion+and+nerve-terminal+cable+properties+at+neuromuscular+junctions+in+an+amphibian+%28Bufo+marinus%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus).</a> J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).</li>
<li>Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Localization of active zones.</a> Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).</li>
<li>Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dependence+of+quantal+secretion+from+visualized+sympathetic+nerve+varicosities+on+the+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens.</a> J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).</li>
<li>Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+transmitter+release+by+synapsin+II+in+mouse+motor+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals.</a> J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).</li>
<li>Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab3a-mediated+vesicle+recruitment+regulates+short-term+plasticity+at+the+mouse+diaphragm+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse.</a> Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).</li>
<li>Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+currents+evoked+by+graded+intracellular+depolarization+of+crayfish+motor+axon+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals.</a> J Physiol. 383, 587-599 (1987).</li>
<li>Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+and+its+facilitation+in+crayfish.+I.+Saturation+kinetics+of+release%2C+and+of+entry+and+removal+of+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium.</a> Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).</li>
<li>Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-induced+changes+in+synaptic+release+sites+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction.</a> J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crayfish+neuromuscular+facilitation+activated+by+constant+presynaptic+action+potentials+and+depolarizing+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses.</a> J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).</li>
<li>Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+statistics+of+transmitter+release+during+facilitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Changes in the statistics of transmitter release during facilitation.</a> J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).</li>
<li>Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+at+the+lobster+neuromuscular+junction%3A+a+stimulus-dependent+mobilization+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model.</a> J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynchrony+of+quantal+events+in+evoked+multiquantal+responses+indicates+presynaptic+quantal+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction.</a> J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).</li>
<li>Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechnisms+underlying+different+facilitation+forms+at+the+lobster+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).</li>
<li>Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+measurement+and+analysis+methods+compared+for+crayfish+and+Drosophila+neuromuscular+junctions%2C+and+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).</li>
<li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postfusional+control+of+quantal+current+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postfusional control of quantal current shape.</a> Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapsin+maintains+the+reserve+vesicle+pool+and+spatial+segregation+of+the+recycling+pool+in+Drosophila+presynaptic+boutons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons.</a> Brain Res. 1178, 52-64 (2007).</li>
<li>Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+endosomal+endocytic+pathway+increases+quantal+size%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size.</a> Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).</li>
<li>Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+Complexin+Accessory+Helix+with+Synaptobrevin+Regulates+Spontaneous+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion.</a> Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).</li>
<li>Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantal+unit+populations+at+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+reduced+calcium+on+quantal+unit+current+and+release+at+the+crayfish+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction.</a> Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).</li>
<li>Dudel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Ca2%2B+inflow+to+quantal%2C+phasic+transmitter+release+from+nerve+terminals+of+frog+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle.</a> Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).</li>
<li>Marrero, H. G., Lemos, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarrero%2C+HG+%22Loose-Patch-Clamp+method%22">Loose-Patch-Clamp method</a>. , 2 ed, Humana Press. (2007).</li>
<li>Wu, W. H., Cooper, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+recordings+of+high+and+low+output+NMJs+on+the+crayfish+leg+extensor+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FM+1-43+labeling+of+synaptic+vesicle+pools+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).</li>
<li>Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19229190">Drosophila larval NMJ dissection.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Imlach, W., McCabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+methods+for+recording+synaptic+potentials+from+the+NMJ+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (24), (2009).</li>
<li>Bykhovskaia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+quantal+analysis+more+convenient%2C+fast%2C+and+accurate%3A+user-friendly+software+QUANTAN%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN.</a> J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).</li>
<li>Huntwork, S., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complexin+fusion+clamp+regulates+spontaneous+neurotransmitter+release+and+synaptic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth.</a> Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).</li>
<li>Zhong, Y., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+synaptic+plasticity+in+Drosophila+memory+mutants+with+a+defective+cyclic+AMP+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade.</a> Science. 251 (4990), 198-201 (1991).</li>
<li>Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+of+vesicle+pools%2C+rates+of+mobilization%2C+and+recycling+at+neuromuscular+synapses+of+a+Drosophila+mutant%2C+shibire%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire.</a> Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).</li>
<li>Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+and+evoked+release+are+independently+regulated+at+individual+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones.</a> J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Drosophila stanowi korzystny organizm modelowy do badania transmisji synaptycznej. Zastosowano kilka konfiguracji zapisu w larwalnym NMJ, w tym wewnątrzkomórkowe zapisy potencjałów synaptycznych, zapisy prądów synaptycznych z dwoma zaciskami napięciowymi elektrod 33,34 oraz opisane tutaj ogniskowe zapisy makropatchy prądów synaptycznych. Ta ostatnia technika pozwala na precyzyjną kwantyfikację transmisji synaptycznej w wizualizowanych boutonach.
<p c...

Drosophila to doskonały system modelowy do badania mechanizmów molekularnych kontrolujących transmisję synaptyczną. Układ nerwowo-mięśniowy u Drosophila jest glutaminergiczny i dlatego połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) może być wykorzystane do badania konserwatywnych cech uwalniania glutaminergicznego. Od czasu badania Jana i Jana 1, larwy trzeciego stadium rozwojowego są szeroko wykorzystywane do badania wywołanej i spontanicznej transmisji synaptycznej poprzez monitorowanie potencjałów połączeń pobudzających (EJPs) lub prądów (EJC). EJP są zwykle rejestrowane wewnątrzkomórkowo za pomocą ostrej szklanej mikroelektrody i odzwierciedlają aktywność całego NMJ, w tym wszystkich butonów tworzących synapsy na danym włóknie mięśniowym.
Dla kontrastu, aktywność ograniczonej liczby miejsc uwalniania może być rejestrowana punktowo, poprzez umieszczenie końcówki mikropipety w pobliżu zakończeń neuronalnych lub żylaków synaptycznych. Technika ta została pierwotnie zastosowana przez Katza i Miledi2, a ogniskowe nagrania zewnątrzkomórkowe zostały z powodzeniem zastosowane w kilku preparatach NMJ, w tym frog3,4,5, mouse6,7,8, crustacean9,10,11,12,13,14,15,16, oraz Drosophila17,18,19,20,21,22,23. Podejście to zostało następnie rozwinięte przez Dudela, który zoptymalizował elektrody kodujące makropatche24,25. W implementacji Dudela technika ta ściśle odpowiadała metodzie luźnego zacisku krosowego26.
Larwa Drosophila NMJ ma wyraźnie zdefiniowane batony synaptyczne, a linie transgeniczne z genetycznie zakodowanymi neuronalnymi znacznikami fluorescencyjnymi (zobacz Tabelę Materiałów) są łatwo dostępne. Te zalety umożliwiły nam rejestrowanie EJC i mEJC z wybranego boutonu synaptycznego20,21,22. Tutaj szczegółowo opisujemy tę technikę.

<table><tbody><tr><td>Sutter P-97</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-97</td><td>Ściągacz do mikroelektrod</td></tr><tr><td>Narishige MF-830</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>WPI MF200</td><td>WPI</td><td>MF200</td><td>Microforge</td></tr><tr><td>Kapilarki szklane</td><td>WPI</td><td>B150-86-10</td><td>Kapilarki szklane</td></tr><tr><td>Mikropalnik 1WG61</td><td>Grainer</td><td>1WG61</td><td></td></tr><tr><td>Mikropalnik Sylgard 184 Zestaw elastomerów silikonowych</td><td>Dow Corning</td><td>SYLGARD 184</td><td>Silikon do przygotowania płytek preparacyjnych</td></tr><tr><td>Szpilki do preparacji</td><td>Amazon</td><td>B00J5PMPJA</td><td>Szpilki do pozycjonowania larw</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>WPIINC</td><td>500342</td><td>Pęseta do zakładania szpilek, usuwania wnętrzności i tchawicy.</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>WPIINC</td><td>501778</td><td>Nożyczki do cięcia naskórka larw i nerwów.</td></tr><tr><td>Olympus BX61WI</td><td>Olympus</td><td>BX61WI</td><td>Mikroskop pionowy</td></tr><tr><td>Olympus Lumplan FL N 60x</td><td>Olympus</td><td>UPLFLN 60X</td><td>Obiektyw mikroskopowy 60X</td></tr><tr><td>Olympus UPlan FL N 10x</td><td>Olympus</td><td>Uplanfl N 10X</td><td>Obiektyw mikroskopowy 10X</td></tr><tr><td>Narishige Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MHW-3</td><td>Trójosiowy mikromanipulator hydrauliczny do wody</td></tr><tr><td>npi Electronic GmbH ELC-03XS</td><td>npi Electronic GmbH</td><td>ELC-03XS</td><td>Wzmacniacz elektrofizjologiczny</td></tr><tr><td>A.M.P.I Master 8</td><td>A.M.P.I.</td><td>Master 8</td><td>Stymulator elektryczny</td></tr><tr><td>A.M.P.I Iso-Flex</td><td>A.M.P.I.</td><td>Iso-Flex</td><td>Stimulus isolator</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny TMC</td><td></td><td>63-9090</td><td>Stół antywibracyjny</td></tr><tr><td>TMC Klatka Faradaya</td><td>TMC</td><td>81-333-90</td><td>Klatka Faradaya</td></tr><tr><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1322A</td> Komputer <td>Digidata</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Dell Dell Dimension 5150</td><td>z systemem operacyjnym Win XP</td></tr><tr><td>Uchwyt elektrody</td><td>WPI</td><td>MEH3SW</td><td>Uchwyt elektrody</td></tr><tr><td>Filtr optyczny</td><td>Omega optyczny</td><td>XF 115-2</td><td>Kostka filtrująca do wykrywania białka zielonej fluorescencji (GFP)</td></tr><tr><td>pCLAMP 8</td><td>Axon Instruments</td><td>8.0.0.81</td><td>Oprogramowanie do rejestracji sygnału</td></tr><tr><td>Quantan</td><td>Oprogramowanie</td> <td>wewnętrzne-Oprogramowanie</td> <td>do przetwarzania</td></tr><tr><td>sygnałów Canton-S (Wildtype)</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>64349</td><td>Żyłka kontrolna</td></tr><tr><td>cpx SH1</td><td>Hojny prezent J.T. Littleton-Complexin</td><td></td> <td>nokautująca linia muchowa ze zwiększoną spontaniczną egzocytozą</td></tr><tr><td>CD8-GFP</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>5137</td><td>Linka muchowa z neuronalną fluorescencyjną (GFP) Znacznik</td></tr></tbody></table>

ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw drosophila

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest doskonałym modelowym systemem do badania glutaminergicznego przekaźnictwa synaptycznego. Opisano technikę ogniskowych zapisów makropatchowych prądów synaptycznych z wizualizowanych boutonów w larwalnym NMJ Drosophila. Technika ta wymaga zindywidualizowanego wykonania mikropipet rejestrujących, a także mikroskopu złożonego wyposażonego w duże powiększenie, obiektyw do zanurzania w wodzie na duże odległości, optykę z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC) i nasadkę fluorescencyjną. Elektroda rejestrująca jest umieszczona na szczycie wybranego boutonu synaptycznego wizualizowanego za pomocą optyki DIC, epi-fluorescencji lub obu. Zaletą tej techniki jest to, że pozwala na monitorowanie aktywności synaptycznej ograniczonej liczby miejsc uwalniania. Elektroda rejestrująca ma średnicę kilku mikronów, a miejsca uwolnienia znajdujące się poza obrzeżem elektrody nie wpływają znacząco na rejestrowane prądy. Zarejestrowane prądy synaptyczne mają szybką kinetykę i mogą być łatwo rozdzielone. Zalety te są szczególnie ważne w badaniach zmutowanych linii muchowych o zwiększonej spontanicznej lub asynchronicznej aktywności synaptycznej.

Rejestracje z ogniskowych makropłatek (focal macropatch) umożliwiają monitorowanie aktywności synaptycznej wybranych wypustek synaptycznych (Rycina 5). Gdy elektroda zostanie umieszczona na szczycie wypustki synaptycznej (Rycina 5A, miejsce 1), zarejestrowane mEJC (Rycina 5C, miejsce 1) wykazują amplitudy znacznie przekraczające poziom szumu oraz strome fazy wzrostu (w zakresie submilisekundowym). Po...

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Ogólnym celem tej techniki jest monitorowanie aktywności synaptycznej wizualizowanych bulionów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw drosophila. Doskonały system modelowy, który można łatwo dostosować do manipulacji genetycznych. Ta technika może odpowiedzieć na kluczowe pytania w twojej nauce.Na przykład, w jaki sposób mutacje białek synaptycznych regulują przekaźnictwo synaptyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność ograniczonej liczby miejsc uwalniania może być monitorowana i rejestrowana prądy o szybkiej kinetyce i może być łatwo rozwiązana. Aby rozpocząć eksperyment: przygotuj ściągacz mikroelektrod.Użyj mikroskopu przy 35-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że wewnętrzna średnica ciągniętej elektrody mieści się w zakresie od siedmiu do dziesięciu mikrometrów. Przechowuj kapilary w szczelnie zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec gromadzeniu się kurzu. Następnie wypal wypolerowane kapilary za pomocą mikrokuźni.Upewnij się, że ostateczna średnica wewnętrzna polerowanej elektrody wynosi pięć mikrometrów. Następnie przejdź do gięcia. Zamocuj elektrodę w manipulatorze i umieść końcówkę nad filamentem, nie dotykając go.Ustaw wartość ciepła na 60-70% maksimum i naciśnij pedał mikrokuźni przez jedną do dwóch sekund, aby podgrzać filament. Użyj igły w kształcie litery L, aby delikatnie pociągnąć w dół końcówkę elektrody i wykonaj zgięcie pod kątem około 90 stopni. Przytrzymaj ręcznie elektrodę nad płomieniem palnika i wykonaj drugie zagięcie w odległości od siedmiu do dziesięciu milimetrów od pierwszego zagięcia i pod kątem około 120 stopni.Przygotuj roztwór podobny do hemolimfy lub HL3. Przechowuj roztwór w lodówce i co tydzień rób go świeżym. Pipety stymulacyjne należy przygotować w taki sam sposób, jak szklane pipety do nagrywania, bez ich zginania.Następnie należy umieścić pipetę stymulacyjną w uchwycie mikroelektrody podłączonym do strzykawki. Wyprodukowano płytki preparacyjne z małych szalek Petriego pokrytych żywicą epoksydową z kauczuku silikonowego. Następnie za pomocą kleszczy wybierz wędrujące larwy trzeciego stadium z fiolki.Przypnij larwy, umieszczając pierwszą szpilkę z tyłu, a drugą szpilkę z przodu, w pobliżu haczyków gębowych. Dodaj roztwór HL3. Po grzbietowej stronie larw wykonaj cięcie nożyczkami sprężynowymi od górnego kołka do dolnego kołka.Przypnij filet z larw, umieszczając dwie dodatkowe szpilki po lewej i prawej stronie larwy. Usuń wnętrzności i tchawicę za pomocą kleszczy. Przetnij nerwy tuż poza brzusznym rdzeniem nerwowym za pomocą nożyczek sprężynowych.Umieść szalkę Petriego z preparatem na stoliku mikroskopowym. Włóż elektrodę odniesienia do kąpieli. Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem HL3.Pod obiektywem 10X zanurz elektrodę w kąpieli i umieść ją na mięśniach szóstym i siódmym brzucha dwóch, trzech lub czterech za pomocą mikromanipulatora. Następnie przełącz obiektyw na 60X i skup się na obszarze zainteresowania za pomocą optyki epi-florescencji lub DIC. Umieść końcówkę elektrody na szczycie synaptycznego boutonu, a następnie bardzo delikatnie dociśnij elektrodę do mięśnia, ponieważ nadmierny nacisk może uszkodzić NMJ lub wywołać wzrost spontanicznej aktywności synaptycznej.Następnie włącz wzmacniacz, płytkę AD i komputer. Następnie wybierz tryb cęgów napięcia na wzmacniaczu. Uruchom oprogramowanie do akwizycji i wybierz tryb bez przerw i obserwuj wygląd MEJC na ekranie komputera.Upewnij się, że amplituda MEJC mieści się w zakresie od 0,2 do 0,7 nanoampera. Za pomocą mikromanipulatora pod kontrolą wizualną umieść elektrodę stymulacyjną w pobliżu aksonu unerwiającego segmenty brzucha od drugiego do czwartego. Zastosować podciśnienie, pociągając za tłok strzykawki podłączonej do uchwytu elektrody, tak aby akson został wciągnięty do wnętrza elektrody.Następnie włącz stymulator. Przekręć pokrętło na jednostce izolacyjnej, aby ustawić prąd zerowy, a następnie delikatnie go zwiększaj, aż pojawią się EJC lub aż do osiągnięcia progu. Wykonaj stymulację w reżimie superprogowym.Wraz ze stymulacją prąd wzrasta około dwukrotnie w porównaniu z progiem dla obserwacji EJC. Zmierz rezystancję uszczelnienia elektrody rejestrującej makro-patch, przekręcając przełącznik rezystancji elektrody amplifier do pozycji testowej uszczelnienia. Obserwuj wartość rezystancji uszczelki w gigaomach, która zostanie wyświetlona w bieżącym oknie.Ogniskowe zapisy makro patchy umożliwiają monitorowanie aktywności synaptycznej z wybranych nalotów synaptycznych. Gdy elektroda jest umieszczona na szczycie synaptycznego boutonu, zarejestrowane MEJC mają amplitudy znacznie przekraczające poziom szumu i ostre fazy narastania w zakresie poniżej milisekundy. Gdy elektroda rejestrująca jest odsunięta od węzła synaptycznego o kilka mikronów, amplitudy MEJC rejestratora spadają prawie do poziomu szumu.Nagrane EJC są ledwo widoczne w hałasie i mają wydłużone fazy narastania. Nagrania ogniskowe umożliwiają dokładne wykrycie MEJC w kompleksie i mutancie gnomów. Podczas gdy zapisy międzykomórkowe z tego mutanta wykazują zdarzenia uwalniania, które nakładają się na siebie i nie można ich wiarygodnie wykryć.Regulacja kątów elektroukładu ma kluczowe znaczenie dla pozycjonowania elektrody. Podążając za tą procedurą, można zastosować inne metody, takie jak sprawdzanie obrazowania poszczególnych zdarzeń wydania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak integracja aktywności poszczególnych stref aktywnych.

focal-macropatch-recordings-synaptic-currents-from-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Zastosowanie elektrofizjologii w badaniach dostępnych synaps umożliwia ilościowe pomiary aktywności synaptycznej, co jest przydatne w analizie mutantów synaptycznych. Niniejszy artykuł opisuje metodę dysekcji służącą do odsłonięcia złączy neuromięśniowych (NMJ) u Caenorhabditis elegans (C. elegans) i krótko omawia możliwe zastosowania tak przygotowanego preparatu.

Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Larwy danio pręgowanego stanowią pierwszy kręgowcowy system modelowy umożliwiający jednoczesną rejestrację metodą patch-clamp z motoneuronu rdzeniowego i docelowego mięśnia szkieletowego. Niniejszy film prezentuje metody mikroskopowe stosowane do identyfikacji segmentowego motoneuronu CaP oraz docelowych komórek mięśniowych, a także metodologię rejestracji z każdego z tych typów komórek.

Podwójne rejestracje metodą patch-clamp z neuronów ruchowych i docelowych mięśni szkieletowych u danio pręgowanego

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

In situ rejestracje metodą patch clamp są wykorzystywane do charakterystyki elektrofizjologicznej neuronów w nienaruszonych obwodach. W modelu genetycznym Drosophila technika patch clamp jest trudna, ponieważ OUN jest mały i otoczony wytrzymałą osłoną. Niniejszy artykuł opisuje procedurę usuwania osłony oraz oczyszczania neuronów w celu przeprowadzenia późniejszych rejestracji metodą patch clamp.

Przygotowanie neuronów ośrodkowych Drosophila do metody in situ patch clamp

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest używane jako model do badania morfologii i funkcji synaps. Ten film opisuje ważne cechy, które naukowcy określają ilościowo, aby scharakteryzować NMJ. Przykładowy protokół demonstruje oprogramowanie zdolne do automatycznego wykonywania kwantyfikacji.

Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

Ten film demonstruje technikę rejestrowania prądów synaptycznych z synaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego larwy Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego, co jest ważne dla badania zmutowanych linii much o zwiększonej spontanicznej lub asynchronicznej aktywności synaptycznej.

Rejestrowanie prądów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Rejestrowanie prądów Ca2+ na błonie czołowej uwalniania presynaptycznego jest kluczem do precyzyjnego zrozumienia wejścia Ca2+ i uwalniania neuroprzekaźników. Przedstawiamy ostrą dysocjację rdzenia kręgowego minoga, która daje funkcjonalne izolowane aksony siateczkowo-rdzeniowe, umożliwiające zapis bezpośrednio z błony czołowej uwalniającej poszczególne zakończenia presynaptyczne.

Ostra dysocjacja aksonów siateczkowo-rdzeniowych minoga w celu umożliwienia rejestracji z błony czołowej uwalniającej poszczególnych funkcjonalnych zakończeń presynaptycznych

Połączenie nerwowo-mięśniowe larw danio pręgowanego jest atrakcyjnym modelem do badania fizjologii synaptycznej. Jest podatny na wiele technik eksperymentalnych, w tym elektrofizjologię i obrazowanie optyczne. W tym miejscu opisujemy protokół obrazowania transmisji synaptycznej za pomocą sondy na bazie pHluoryny pod pionowym mikroskopem epifluorescencyjnym.

Obrazowanie na żywo recyklingu pęcherzyków synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym wypreparowanych larw danio pręgowanego

Poznaj technikę ogniskowych zapisów makroplastowych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Ta metoda umożliwia monitorowanie aktywności synaptycznej pojedynczych boutonów i badanie wpływu mutacji białek synaptycznych na transmisję.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów