Metody analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro
January 30th, 2018
Wiadomo, że uran wpływa na metabolizm kości. W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu zbadanie wpływu ekspozycji na naturalny uran na żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów, komórek odpowiedzialnych za resorpcję kości.
Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu naturalnej ekspozycji na uran na żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksyczności środowiskowej dotyczące wpływu ekspozycji na uran na fizjologię i metabolizm kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona interesujące nowe narzędzie do badań przesiewowych oryginalnych źródeł uranu.
Gdy hodowla komórkowa RAW 264.7 osiągnie zbieżność od 85 do 90%, użyj skrobaka do komórek, aby mechanicznie podnieść komórki z dna kolby do hodowli komórkowej i przenieść komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Kilkakrotnie odpipetować roztwór komórek, aby rozbić grudki i policzyć powstałą zawiesinę jednokomórkową. Rozcieńczyć komórki do stężenia jednego razy 10 do czwartej komórki na mililitr w zmodyfikowanym alfa minimalnym niezbędnym podłożu, uzupełnionym L-glutaminą i 5% płodową surowicą bydlęcą i dodać jeden mililitr komórek na studzienkę do 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na sześciogodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Ważnym parametrem dla odtwarzalności testu różnicowania i wchłaniania zwrotnego osteoklastów jest gęstość wysiewu komórek. Zwróć szczególną uwagę na zliczanie komórek, przygotowanie zawiesiny komórkowej i jej jednorodność przed posiewem komórek. Aby przygotować roztwór soli do pisuaru, zaczynając od sterylnego roztworu wodnego wodorowęglanu sodu przetestowanego na podstawie 7,5% hodowli komórkowej, najpierw przygotuj i ostudź 100 milimolowy wodorowęglan w wodzie na lodzie i dodaj jedną objętość 100-milimolowego roztworu octanu do pisuaru, kropla po kropli, do dziewięciu objętości lodowatego roztworu wodorowęglanu, delikatnie wstrząsając.
Pozwól, aby roztwór zrównoważył się w temperaturze pokojowej. Po trzech godzinach rozcieńczyć odpowiednią objętość roztworu pisuaru, kropla po kropli, w pożywce różnicującej zawierającej 50 nanogramów na mililitr RANKL, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia roboczego w pisuarze i odczekać kolejne trzy godziny równowagi w temperaturze pokojowej. Długie etapy inkubacji po każdym rozcieńczeniu soli moczowej są niezbędne do stabilizacji kompleksów pisuarowych w roztworach.
Pod koniec drugiego okresu równowagi delikatnie zastąpić pożywkę w każdej studzience jednym mililitrem pożywki do pisuaru, w zależności od przypadku, i ponownie umieścić komórki w inkubatorze. Wielojądrzaste osteoklasty powinny pojawić się między trzecim a czwartym dniem hodowli. Aby ocenić wielkość i morfologię nowo zróżnicowanych osteoklastów, należy wybarwić komórki kwasową fosfatazą odporną na winian, zgodnie z instrukcjami producenta i zobrazować całą powierzchnię każdej studzienki w rozdzielczości wystarczającej do rozróżnienia jąder komórkowych.
Po zobrazowaniu wszystkich studzienek otwórz obraz jednego dołka za pomocą oprogramowania ImageJ o otwartym kodzie źródłowym i zweryfikuj jednostki skali. Następnie zaznacz pole Globalne w wyskakującym okienku, aby zastosować nowe jednostki skali do wszystkich późniejszych obrazów. W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz pola wyboru Obszar i Etykieta wyświetlania.
Odznacz wszystkie inne pola. W menu Analizuj otwórz Narzędzia, a następnie Menedżer obszarów zainteresowań i wybierz narzędzie do zaznaczania prostokątnego w głównym oknie ImageJ. Nakreśl obszar zainteresowania o wymiarach około 1 000 na 1 000 mikrometrów i kliknij przycisk Dodaj, aby dodać zaznaczenie do Menedżera obszarów zainteresowania.
Następnie kliknij Więcej, Zapisz, aby zapisać region. Aby utworzyć kopię jednego z pięciu regionów, które mają zostać przeanalizowane, wybierz region zainteresowania w Menedżerze obszarów zainteresowań i kliknij prawym przyciskiem myszy wewnątrz wybranego obszaru, aby zduplikować region. Zaznacz pola Pokaż wszystko i Etykiety, a następnie wybierz narzędzie do zaznaczania wielokątów, aby ręcznie obrysować jeden z osteoklastów w zduplikowanym obszarze zainteresowania.
Aby dodać ten konspekt do Menedżera obszarów zainteresowań, kliknij przycisk Dodaj w oknie Menedżer obszarów zainteresowań. Po dodaniu wszystkich osteoklastów zaznacz wszystkie kontury i kliknij przycisk Zmierz, aby zmierzyć ich powierzchnie. Następnie przenieś pomiary, które pojawią się w oknie wyników, do arkusza kalkulacyjnego.
Aby ocenić funkcję osteoklastów leczonych moczem, na dzień przed dodaniem pożywki różnicującej, umieść komórki RAW z 85 do 90% zlewającej się hodowli komórek na 24-dołkowej płytce do testu kostno-szkieletowego w pożywce wzrostowej, jak właśnie pokazano. Następnego dnia delikatnie zastąp supernatant pożywką zawierającą pisuar różnicujący i pozwól komórkom RAW zróżnicować się w osteoklasty, jak właśnie pokazano. W piątym dniu osteoklastogenezy zastąp pożywkę zawierającą pisuar 10% roztworem wybielacza, aby usunąć komórki z powierzchni mimetycznej kości.
Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj studzienki dwa razy wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie wybarwić sole wapnia w niezasorbowanych obszarach każdej studzienki 1% roztworem soli sodowej Alizaryn Red S. Po 10 do 15 sekundach usuń roztwór Alizaryny i delikatnie umyj studzienki trzy do czterech razy wodą.
Aby przekonwertować obraz RGB studzienek barwionych alizaryną na 8-bitowy format w skali szarości, w menu Obraz wybierz opcję Typ i 8-bitowy. Następnie, za pomocą narzędzia do zaznaczania owalu, obrysuj całą powierzchnię studzienki, która ma być analizowana pod kątem resorpcji i zapisz obszar zainteresowania, jak pokazano poniżej. Aby ułatwić wybór progu, wybierz opcję Edytuj i wyczyść na zewnątrz, aby wyczyścić wszystkie obiekty poza zdefiniowanym obszarem zainteresowania.
Zduplikuj obszar zainteresowania, jak pokazano powyżej, i wybierz opcję Dostosuj próg w menu Obraz, dostosowując suwak, aby wybrać odpowiedni próg. Wszystkie obszary resorbowane powinny znajdować się powyżej progu i być białe, podczas gdy wszystkie obszary niezasorbowane powinny znajdować się poniżej progu i być czerwone. Aby sfinalizować wybór progu, kliknij przycisk Zastosuj w oknie Próg i zapisz końcowy obraz binarny w odpowiednim formacie.
Aby zdefiniować pomiary, które mają zostać wykonane w obszarze zainteresowania, w menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz pola wyboru: Obszar, Ułamek powierzchni i Ogranicz do progu, a następnie usuń zaznaczenie wszystkich pozostałych pól. Następnie, aby uzyskać frakcję resorbowanego obszaru bezpośrednio w oknie wyników, odwróć zduplikowany obraz binarny, wybierając opcję Odwróć w menu Edycja i upewniając się, że główny obszar zainteresowania jest zaznaczony na końcowym obrazie binarnym i zmierz frakcję zresorbowanego obszaru. Zmiany w liczbie i wielkości nowo zróżnicowanych osteoklastów w odpowiedzi na uran są łatwo widoczne na złożonych obrazach całych studni, a także na powiększonych zdjęciach wybranych obszarów zainteresowania.
Wielkość osteoklastów wyhodowanych w różnych warunkach hodowli można przeanalizować, jak właśnie wykazano, przedstawiając wszystkie osteoklasty w każdym regionie i mierząc obszar każdej zarysowanej komórki. Aby zbadać wpływ uranu na aktywność resorpcyjną osteoklastów, komórki RAW 264.7 są platerowane i różnicowane na płytkach powierzchniowych osteomimetycznych. Pod koniec testu osteoklasty są usuwane, a obszary nieresorbowane są barwione i obrazowane, jak pokazano.
Obrazy są następnie konwertowane do 8-bitowej skali szarości i progowane, aby ułatwić obliczenie resorpowanych obszarów. Procedura ta może być również zastosowana do badania wpływu innych metali ciężkich na osteoklastogenezę.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie bada wpływ naturalnego narażenia na uran na żywotność, różnicowanie i funkcjonowanie osteoklastów. Protokół ma na celu zwiększenie zrozumienia wpływu uranu na metabolizm kości.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Toksykologia środowiskowa
- Fizjologia kości
Tło
- Wiadomo, że uran wpływa na metabolizm kości.
- Osteoklasty są odpowiedzialne za resorpcję kości.
- Zrozumienie wpływu uranu może informować o zdrowiu środowiskowym.
- To badanie przyczynia się do dziedziny toksykologii środowiskowej.
Cel badania
- Zbadać wpływ uranu na osteoklasty.
- Ocenić żywotność i różnicowanie komórek.
- Zbadać funkcjonalne implikacje narażenia na uran na zdrowie kości.
Stosowane metody
- Do badania wykorzystywana jest hodowla komórek RAW 264.7.
- Komórki są mechanicznie podnoszone i liczone w celu analizy.
- Komórki są rozcieńczane i inkubowane w kontrolowanym środowisku.
- Metoda pozwala na przesiewanie wpływu uranu na komórki kostne.
Główne wyniki
- Protokół zapewnia wgląd w zachowanie osteoklastów pod wpływem uranu.
- Wyniki mogą wskazywać na zmiany w żywotności i funkcji.
- Odnalazki przyczyniają się do zrozumienia wpływu środowiska na metabolizm kości.
- Możliwość dalszych badań nad biologicznymi efektami uranu.
Wnioski
- To badanie oferuje nowe narzędzie do badania toksyczności uranu.
- Zrozumienie reakcji osteoklastów jest kluczowe dla zdrowia kości.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zbadać szersze implikacje.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of uranium's effects on osteoclastogenesis enables mechanistic de-risking in bone toxicity studies and supports predictive confidence for environmental hazard assessment. This protocol provides standardized, reproducible workflows for evaluating cytotoxicity and functional impacts on bone-resorbing cells, informing early-stage target validation and risk triage. The approach is directly relevant for biopharma teams investigating bone metabolism, toxicology, and environmental exposure liabilities.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of uranium's mechanistic impact on osteoclast differentiation and function.
- Supports biological de-risking by quantifying cytotoxicity and resorptive activity changes.
- Facilitates predictive confidence in environmental and bone-targeted toxicity models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vitro systems for screening heavy metal effects on bone cell biology.
- Standardizes cell seeding, media preparation, and image-based quantification for reproducibility.
- Generates quantitative outputs such as osteoclast size and matrix resorption percentage for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant endpoints in bone metabolism and toxicology.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical hazard identification.
- Enables risk-adjusted advancement of environmental toxicity programs.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum for bone toxicity and environmental hazard assessment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on uranium's cellular effects and pathway clarification in osteoclastogenesis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative assay outputs for compound or exposure evaluation.
- Analytics: Provides image-based measurements of cell size and resorbed matrix area for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro mechanistic data to preclinical toxicology endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for assessing other heavy metals or environmental agents on bone cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone toxicity studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible assay protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in environmental and bone-targeted R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of environmental hazard and bone metabolism programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, image analysis, and quantitative assay design.
- Needs access to imaging platforms and analytical software such as ImageJ.
- Demands rigorous standardization of cell seeding and media preparation for reproducibility.
- Adaptable to other cell lines or heavy metal exposures with protocol optimization.
- Limitations include in vitro model constraints and the need for careful thresholding in image analysis.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
RAW 264.7 Differentiation in the Presence of Uranyl Ions [U(VI)]
3:14
Osteoclast Size and Morphology Analyses
5:27
Osteoclast Function in the Presence of U(VI)
8:30
Results: Representative Effects of U(VI) on Osteoclast Size and Function
9:34
Conclusion
