Name: Metody analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj metodę analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro przy użyciu linii komórkowej RAW 264.7. Technika ta pozwala badać żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów w kontekście toksyczności środowiskowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Chantal Cros za pomocną pomoc techniczną. 
Badania te zostały sfinansowane z grantów "Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (URANOs - Programme Transversal de Toxicologie du CEA and CPRR CEA-AREVA) oraz ANR (Toxicity of URanium: Multi-level approach of biomineralization process in BOne, ANR-16-CE34-0003). Prace te były również wspierane przez Uniwersytet w Nicei Sophia-Antipolis i CNRS.

<ol><li>Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKeith%2C+S+%22Agency+for+Toxic+Substances+and+Disease+Registry%22">Agency for Toxic Substances and Disease Registry</a>. , Atlanta, GA. (2013).</li>
<li>Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deposition+and+early+disposition+of+inhaled+233UO2%28NO3%292+and+232UO2%28NO3%292+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat.</a> Health Phys. 51 (6), 755-771 (1986).</li>
<li>Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+in+the+tissues+of+an+occupationally+exposed+individual%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual.</a> Health Phys. 57 (1), 17-21 (1989).</li>
<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+effects+of+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Renal effects of uranium in drinking water.</a> Environ.Health Perspect. 110 (4), 337-342 (2002).</li>
<li>Leggett, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basis+for+the+ICRP%27s+age-specific+biokinetic+model+for+uranium%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Phys%22%5BJournal%5D)">Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium.</a> Health Phys. 67 (6), 589-610 (1994).</li>
<li>Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+target+organ+for+metals%3A+the+case+of+f-elements%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Bone as target organ for metals: the case of f-elements.</a> Chem. Res. Toxicol. 25 (6), 1161-1175 (2012).</li>
<li>Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modes+of+action+associated+with+uranium+induced+adverse+effects+in+bone+function+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development.</a> Toxicol. Lett. 236 (2), 123-130 (2015).</li>
<li>Ikeda, K., Takeshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+osteoclast+differentiation+and+function+in+skeletal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis.</a> J. Biochem. 159 (1), 1-8 (2016).</li>
<li>Teiltelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteoclast+and+its+unique+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The osteoclast and its unique cytoskeleton.</a> Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).</li>
<li>Nesbitt, S. A., Horton, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+matrix+collagens+through+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts.</a> Science. 276 (5310), 266-269 (1997).</li>
<li>Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+osteoclast+bone+resorption+products+by+transcytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis.</a> Science. 276 (5310), 270-273 (1997).</li>
<li>Pierrefite-Carle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+natural+uranium+on+the+UMR-106+osteoblastic+cell+line%3A+impairment+of+the+autophagic+process+as+an+underlying+mechanism+of+uranium+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity.</a> Arch. Toxicol. 91 (4), 1903-1914 (2017).</li>
<li>Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uranium+inhibits+bone+formation+in+physiologic+alveolar+bone+modeling+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Res%22%5BJournal%5D)">Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling.</a> Environ. Res. 54 (1), 17-23 (1991).</li>
<li>Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ethane-1-+hydroxy-1%2C1-bisphosphonate+%28EHBP%29+on+endochondral+ossification+lesions+induced+by+a+lethal+oral+dose+of+uranyl+nitrate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate.</a> Arch. Toxicol. 79 (8), 475-481 (2005).</li>
<li>Kurttio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+as+a+possible+target+of+chemical+toxicity+of+natural+uranium+in+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water.</a> Environ. Health Perspect. 113 (1), 68-72 (2005).</li>
<li>Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANKL-mediated+osteoclast+formation+from+murine+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells.</a> Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).</li>
<li>Beranger, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+poly%28ADP-Ribose%29+polymerase-1+and+JunD%2FFra2+accounts+for+RANKL-induced+Tcirg1+gene+expression+during+osteoclastogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis.</a> J. Bone Miner. Res. 22 (7), 975-983 (2007).</li>
<li>Mirto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium%28VI%29+speciation+for+the+evaluation+of+in+vitro+uranium+cytotoxicity+on+LLC-PK1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Exp.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells.</a> Hum. Exp. Toxicol. 18 (3), 180-187 (1999).</li>
<li>Carrière, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+uranium+speciation+on+normal+rat+kidney+%28NRK-52E%29+proximal+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity.</a> Chem. Res. Toxicol. 17 (3), 446-452 (2004).</li>
<li>Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+accumulation+and+distribution+of+uranium+and+lead+in+osteoblastic+cells+as+a+function+of+their+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation.</a> Toxicology. 252 (1-3), 26-32 (2008).</li>
<li>Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+and+phenotypic+effects+of+uranium+and+lead+on+osteoblastic+cells+are+highly+dependent+on+metal+speciation%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation.</a> Toxicology. 250 (1), 62-69 (2008).</li>
<li>Studzinski, G. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStudzinski%2C+GP+%22Cell+Growth%2C+Differentiation+and+Senescence+A+Practical+Approach%22">Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. Oxford. (1999).</li>
<li>Gritsaenko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+uranium+impairs+the+differentiation+and+the+resorbing+function+of+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts.</a> Biochim Biophys Acta. 1861 (4), 715-726 (2017).</li>
<li>Motiur Rahman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation-coupled+osteoclast+differentiation+by+RANKL%3A+Cell+density+as+a+determinant+of+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation.</a> Bone. 81, 392-399 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

O ile nam wiadomo, po raz pierwszy opisano szczegółową procedurę mającą na celu zbadanie wpływu naturalnego uranu na komórki resorpcyjne kości. Podejście to będzie przydatne do lepszego zrozumienia wpływu uranu na fizjologię kości i może stanowić interesujące nowe narzędzie do badań przesiewowych chelatatorów uranu. Ponadto uważamy, że opisany tutaj protokół może być zastosowany do badania wpływu innych metali ciężkich na osteoklatogenezę.
Wiadomo, że uranyl jest skompleksowany ze składnikami ...

Uran jest naturalnie występującym pierwiastkiem radioaktywnym obecnym w glebach, powietrzu i wodzie; jako taki, zwierzęta i ludzie są narażeni na naturalny uran w swojej diecie. Oprócz źródeł naturalnych uran pochodzi z działalności antropogenicznej, co zwiększa jego obfitość w środowisku. Uran stwarza zagrożenia zarówno chemiczne, jak i radiologiczne. Ponieważ jednak uran naturalny (który jest mieszaniną izotopową zawierającą 99,27% 238U, 0,72% 235U i 0,006% 234U) ma niską aktywność właściwą (25,103 Bq.g-1), jego wpływ na zdrowie przypisuje się jego toksyczności chemicznej.
Bez względu na drogę wejścia (wdychanie, spożycie lub narażenie na skórę), większość uranu dostającego się do organizmu jest wydalana z kałem i tylko niewielka część dociera do krążenia ogólnoustrojowego. Około 67% uranu we krwi jest z kolei filtrowane przez nerki i opuszcza organizm wraz z moczem w ciągu 24 h1. Pozostała część jest głównie zdeponowana w nerkach i kościach, dwóch głównych narządach docelowych toksyczności uranu2,3,4. Ponieważ szkielet został zidentyfikowany jako główne miejsce długotrwałego przechowywania uranu2,3,4,5,6, przeprowadzono kilka badań mających na celu zbadanie wpływu uranu na fizjologię kości7.
Kość to zmineralizowana tkanka, która jest stale przebudowywana przez cały okres swojego życia. Przebudowa kości jest złożonym procesem, który zależy od wyspecjalizowanych typów komórek i składa się głównie z dwóch faz: resorpcji istniejącej wcześniej starej macierzy przez osteoklasty, a następnie budowy kości de novo przez osteoblasty. Osteoklasty to duże komórki wielojądrzaste powstałe w wyniku fuzji komórek prekursorowych pochodzenia krwiotwórczego, które migrują do miejsc resorpcji, gdzie przyczepiają się do bone8. Ich przywiązanie następuje równocześnie z rozległą reorganizacją ich cytoszkieletu9. Ta reorganizacja jest wymagana do ustanowienia izolowanego przedziału między komórką a powierzchnią kości, do którego osteoklast wydziela protony, prowadząc do rozpuszczenia hydroksyapatytu i proteaz biorących udział w degradacji macierzy organicznej. Powstałe produkty degradacji są endocytozyzowane, transportowane przez komórkę do obszaru błony przeciwnej do powierzchni kości i wydzielane w procesie zwanym transcytozą10,11.
Wyniki badań in vivo i in vitro wskazują, że uran hamuje tworzenie kości oraz zmienia liczbę i aktywność osteoblastów7,12. Natomiast wpływ uranu na resorpcję kości i osteoklasty został słabo zbadany. Kilka badań in vivo wykazało poprawę resorpcji kości po podaniu azotanu uranylu myszom lub szczurom13,14. Co więcej, dochodzenie epidemiologiczne sugerowało, że wzrost spożycia uranu poprzez wodę pitną był zwykle związany ze wzrostem poziomu markera resorpcji kości w surowicy u mężczyzn15. Podsumowując, odkrycia te doprowadziły do wniosku, że uran, który gromadzi się w kościach, może sprzyjać resorpcji kości. Jednak mechanizmy komórkowe zaangażowane w ten potencjalny efekt uranu pozostają kwestią otwartą. Z tego powodu postanowiliśmy zbadać wpływ uranu na zachowanie resorpcji komórek kostnych.
Tutaj opisujemy protokół, który ustanowiliśmy, aby scharakteryzować i określić ilościowo wpływ naturalnego uranu na żywotność preosteoklastów oraz na różnicowanie i aktywność resorpcyjną osteoklastów. Opisane tutaj eksperymenty zostały przeprowadzone na mysiej transformowanej linii komórkowej makrofagów RAW 264.7, która może łatwo różnicować się w osteoklasty, gdy jest hodowana w obecności cytokiny RANKL przez 4 lub 5 dni, i która jest klasycznie stosowana do badania różnicowania i funkcji osteoklastów16. Opracowane procedury są wiarygodne, dają wysoce powtarzalne wyniki i mają pełne zastosowanie do pierwotnych osteoklastów. Z tych wszystkich powodów uważamy, że ta metodologia jest przydatna do lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych związanych z toksycznością uranu w kościach. Co więcej, uważamy, że podejście to może zostać zaadaptowane jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji nowych czynników chelatujących uran.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>EMEM bez czerwieni fenolowej</td><td>Lonza</td><td>12-668E</td><td></td></tr><tr><td>Woda do hodowli komórkowych</td><td>Lonza</td><td>BE17-724F</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Roztwór L-glutaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Hyklonowa płodowa surowica bydlęca</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>7,5% wodny roztwór wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy kwasowej, lekocytów (TRAP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>Bromek tetrazolium (MTT) w proszku</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa czerwieni alizarynowej S, 1% w/v aq. sol.</td><td>Alfa Aeros</td><td>42746</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do osteoaspekcji kości, płytki 24-dołkowe</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3987</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell 24-dołkowe płytki</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Kolba 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>353133</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki stożkowe 50 ml</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek 30 cm</td><td>TPP</td><td>Numer katalogowy 90003</td><td></td></tr></tbody></table>

metody analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro

Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis

Wykazano, że uran zakłóca fizjologię kości i jest dobrze znane, że metal ten gromadzi się w kościach. Niewiele jednak wiadomo na temat wpływu naturalnego uranu na zachowanie komórek kostnych. W szczególności nie udokumentowano wpływu uranu na osteoklasty, komórki odpowiedzialne za resorpcję macierzy kostnej. Aby zbadać tę kwestię, ustaliliśmy nowy protokół wykorzystujący octan uranylu jako źródło naturalnego uranu i mysią linię komórkową RAW 264.7 jako model prekursorów osteoklastów. W niniejszym artykule szczegółowo opisaliśmy wszystkie testy wymagane do zbadania cytotoksyczności uranu na prekursorach osteoklastów i oceny jej wpływu na osteoklastogenezę i funkcję resorpcji dojrzałych osteoklastów. Wypracowane przez nas warunki, w szczególności do przygotowania pożywek hodowlanych zawierających uran oraz do wysiewu komórek RAW 264.7, pozwalają na uzyskanie wiarygodnych i wysoce reprodukcyjnych wyników. Ponadto zoptymalizowaliśmy wykorzystanie narzędzi programowych, aby ułatwić analizę różnych parametrów, takich jak wielkość osteoklastów czy procent zresorbowanej matrycy.

Do wizualizacji osteoklastów jako dużych fioletowych komórek posiadających 3 lub więcej jąder zastosowano barwienie na fosfatazę kwasą odporną na winiany. Reprezentatywne obrazy osteoklastów uzyskanych z komórek RAW 264.7 hodowanych w obecności RANKL i jonów uranylu przedstawiono na Rysunku 1. Zmiany w liczbie i wielkości osteoklastów w odpowiedzi na uran są wyraźnie widoczne na obrazach kompozytowych całych studzienek oraz na powiększeniach.
<p class="jo...

Wiadomo, że uran wpływa na metabolizm kości. W tym miejscu przedstawiamy protokół mający na celu zbadanie wpływu ekspozycji na naturalny uran na żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów, komórek odpowiedzialnych za resorpcję kości.

Metody analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro

Uranium has been shown to interfere with bone physiology and it is well established that this metal accumulates in bone. However, little is known about ...

Ogólnym celem tej procedury jest zbadanie wpływu naturalnej ekspozycji na uran na żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie toksyczności środowiskowej dotyczące wpływu ekspozycji na uran na fizjologię i metabolizm kości. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona interesujące nowe narzędzie do badań przesiewowych oryginalnych źródeł uranu.Gdy hodowla komórkowa RAW 264.7 osiągnie zbieżność od 85 do 90%, użyj skrobaka do komórek, aby mechanicznie podnieść komórki z dna kolby do hodowli komórkowej i przenieść komórki do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Kilkakrotnie odpipetować roztwór komórek, aby rozbić grudki i policzyć powstałą zawiesinę jednokomórkową. Rozcieńczyć komórki do stężenia jednego razy 10 do czwartej komórki na mililitr w zmodyfikowanym alfa minimalnym niezbędnym podłożu, uzupełnionym L-glutaminą i 5% płodową surowicą bydlęcą i dodać jeden mililitr komórek na studzienkę do 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej na sześciogodzinną inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Ważnym parametrem dla odtwarzalności testu różnicowania i wchłaniania zwrotnego osteoklastów jest gęstość wysiewu komórek. Zwróć szczególną uwagę na zliczanie komórek, przygotowanie zawiesiny komórkowej i jej jednorodność przed posiewem komórek. Aby przygotować roztwór soli do pisuaru, zaczynając od sterylnego roztworu wodnego wodorowęglanu sodu przetestowanego na podstawie 7,5% hodowli komórkowej, najpierw przygotuj i ostudź 100 milimolowy wodorowęglan w wodzie na lodzie i dodaj jedną objętość 100-milimolowego roztworu octanu do pisuaru, kropla po kropli, do dziewięciu objętości lodowatego roztworu wodorowęglanu, delikatnie wstrząsając.Pozwól, aby roztwór zrównoważył się w temperaturze pokojowej. Po trzech godzinach rozcieńczyć odpowiednią objętość roztworu pisuaru, kropla po kropli, w pożywce różnicującej zawierającej 50 nanogramów na mililitr RANKL, aż do osiągnięcia pożądanego stężenia roboczego w pisuarze i odczekać kolejne trzy godziny równowagi w temperaturze pokojowej. Długie etapy inkubacji po każdym rozcieńczeniu soli moczowej są niezbędne do stabilizacji kompleksów pisuarowych w roztworach.Pod koniec drugiego okresu równowagi delikatnie zastąpić pożywkę w każdej studzience jednym mililitrem pożywki do pisuaru, w zależności od przypadku, i ponownie umieścić komórki w inkubatorze. Wielojądrzaste osteoklasty powinny pojawić się między trzecim a czwartym dniem hodowli. Aby ocenić wielkość i morfologię nowo zróżnicowanych osteoklastów, należy wybarwić komórki kwasową fosfatazą odporną na winian, zgodnie z instrukcjami producenta i zobrazować całą powierzchnię każdej studzienki w rozdzielczości wystarczającej do rozróżnienia jąder komórkowych.Po zobrazowaniu wszystkich studzienek otwórz obraz jednego dołka za pomocą oprogramowania ImageJ o otwartym kodzie źródłowym i zweryfikuj jednostki skali. Następnie zaznacz pole Globalne w wyskakującym okienku, aby zastosować nowe jednostki skali do wszystkich późniejszych obrazów. W menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz pola wyboru Obszar i Etykieta wyświetlania.Odznacz wszystkie inne pola. W menu Analizuj otwórz Narzędzia, a następnie Menedżer obszarów zainteresowań i wybierz narzędzie do zaznaczania prostokątnego w głównym oknie ImageJ. Nakreśl obszar zainteresowania o wymiarach około 1 000 na 1 000 mikrometrów i kliknij przycisk Dodaj, aby dodać zaznaczenie do Menedżera obszarów zainteresowania.Następnie kliknij Więcej, Zapisz, aby zapisać region. Aby utworzyć kopię jednego z pięciu regionów, które mają zostać przeanalizowane, wybierz region zainteresowania w Menedżerze obszarów zainteresowań i kliknij prawym przyciskiem myszy wewnątrz wybranego obszaru, aby zduplikować region. Zaznacz pola Pokaż wszystko i Etykiety, a następnie wybierz narzędzie do zaznaczania wielokątów, aby ręcznie obrysować jeden z osteoklastów w zduplikowanym obszarze zainteresowania.Aby dodać ten konspekt do Menedżera obszarów zainteresowań, kliknij przycisk Dodaj w oknie Menedżer obszarów zainteresowań. Po dodaniu wszystkich osteoklastów zaznacz wszystkie kontury i kliknij przycisk Zmierz, aby zmierzyć ich powierzchnie. Następnie przenieś pomiary, które pojawią się w oknie wyników, do arkusza kalkulacyjnego.Aby ocenić funkcję osteoklastów leczonych moczem, na dzień przed dodaniem pożywki różnicującej, umieść komórki RAW z 85 do 90% zlewającej się hodowli komórek na 24-dołkowej płytce do testu kostno-szkieletowego w pożywce wzrostowej, jak właśnie pokazano. Następnego dnia delikatnie zastąp supernatant pożywką zawierającą pisuar różnicujący i pozwól komórkom RAW zróżnicować się w osteoklasty, jak właśnie pokazano. W piątym dniu osteoklastogenezy zastąp pożywkę zawierającą pisuar 10% roztworem wybielacza, aby usunąć komórki z powierzchni mimetycznej kości.Po pięciu minutach w temperaturze pokojowej umyj studzienki dwa razy wodą dejonizowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Następnie wybarwić sole wapnia w niezasorbowanych obszarach każdej studzienki 1% roztworem soli sodowej Alizaryn Red S. Po 10 do 15 sekundach usuń roztwór Alizaryny i delikatnie umyj studzienki trzy do czterech razy wodą.Aby przekonwertować obraz RGB studzienek barwionych alizaryną na 8-bitowy format w skali szarości, w menu Obraz wybierz opcję Typ i 8-bitowy. Następnie, za pomocą narzędzia do zaznaczania owalu, obrysuj całą powierzchnię studzienki, która ma być analizowana pod kątem resorpcji i zapisz obszar zainteresowania, jak pokazano poniżej. Aby ułatwić wybór progu, wybierz opcję Edytuj i wyczyść na zewnątrz, aby wyczyścić wszystkie obiekty poza zdefiniowanym obszarem zainteresowania.Zduplikuj obszar zainteresowania, jak pokazano powyżej, i wybierz opcję Dostosuj próg w menu Obraz, dostosowując suwak, aby wybrać odpowiedni próg. Wszystkie obszary resorbowane powinny znajdować się powyżej progu i być białe, podczas gdy wszystkie obszary niezasorbowane powinny znajdować się poniżej progu i być czerwone. Aby sfinalizować wybór progu, kliknij przycisk Zastosuj w oknie Próg i zapisz końcowy obraz binarny w odpowiednim formacie.Aby zdefiniować pomiary, które mają zostać wykonane w obszarze zainteresowania, w menu Analizuj wybierz opcję Ustaw pomiary i zaznacz pola wyboru: Obszar, Ułamek powierzchni i Ogranicz do progu, a następnie usuń zaznaczenie wszystkich pozostałych pól. Następnie, aby uzyskać frakcję resorbowanego obszaru bezpośrednio w oknie wyników, odwróć zduplikowany obraz binarny, wybierając opcję Odwróć w menu Edycja i upewniając się, że główny obszar zainteresowania jest zaznaczony na końcowym obrazie binarnym i zmierz frakcję zresorbowanego obszaru. Zmiany w liczbie i wielkości nowo zróżnicowanych osteoklastów w odpowiedzi na uran są łatwo widoczne na złożonych obrazach całych studni, a także na powiększonych zdjęciach wybranych obszarów zainteresowania.Wielkość osteoklastów wyhodowanych w różnych warunkach hodowli można przeanalizować, jak właśnie wykazano, przedstawiając wszystkie osteoklasty w każdym regionie i mierząc obszar każdej zarysowanej komórki. Aby zbadać wpływ uranu na aktywność resorpcyjną osteoklastów, komórki RAW 264.7 są platerowane i różnicowane na płytkach powierzchniowych osteomimetycznych. Pod koniec testu osteoklasty są usuwane, a obszary nieresorbowane są barwione i obrazowane, jak pokazano.Obrazy są następnie konwertowane do 8-bitowej skali szarości i progowane, aby ułatwić obliczenie resorpowanych obszarów. Procedura ta może być również zastosowana do badania wpływu innych metali ciężkich na osteoklastogenezę.

methods-for-analyzing-impacts-natural-uranium-on-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W tym filmie pokazujemy wpływ różnych stężeń przeciwciał anty-c-fms na osteoklastogenezę, która jest procesem powstawania osteoklastów z komórek progenitorowych osteoklastów.

Wpływ przeciwciała anty C-fms na osteoklastogenezę w komórkach szpiku kostnego myszy in vitro

Osteoklasty są główną komórką resorpcyjną kości w organizmie. Zdolność do izolowania osteoklastów w dużych ilościach zaowocowała znaczącym postępem w zrozumieniu biologii osteoklastów. W tym protokole opisujemy metodę izolacji, hodowli i ilościowego określania aktywności osteoklastów in vitro.

Osteoklasty pochodzące ze szpiku kostnego myszy

Produkcja wody odpływowej (PBW) została potraktowana nanocząstkami tlenku miedzi (CuO-NPs) i oceniono toksyczność komórkową w hodowanych komórkach ludzkich. Celem tego protokołu było zintegrowanie rodzimej próbki środowiskowej z formatem hodowli komórkowej oceniającym zmiany toksyczności spowodowane traktowaniem CuO-NP.

Usuwanie pierwiastków śladowych przez nanocząstki tlenku miedzi z wody upustowej z odzysku uranu in situ i jej wpływ na żywotność komórek

Przedstawiamy protokół do porównywania stanu minerałów w pęcherzykach uwalnianych przez dwie linie ludzkich komórek kostnych: hFOB 1.19 i Saos-2. Ich profile mineralizacji analizowano za pomocą barwienia czerwienią Alizarin Red-S (AR-S), wizualizacji światła ultrafioletowego (UV), obrazowania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) oraz mikroanalizy rentgenowskiej z dyspersją energii (EDX).

Analiza minerałów wytwarzanych przez ogniwa hFOB 1.19 i Saos-2 przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej z mikroanalizą rentgenowską z dyspersją energii

Osteoklasty to specyficzne tkankowo polikariony makrofagów wywodzące się z linii monocyty-makrofag hematopoetycznych komórek macierzystych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób izolować komórki szpiku kostnego, aby uzyskać duże ilości osteoklastów przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka wypadków występujących przy tradycyjnych metodach.

Izolacja, oczyszczanie i różnicowanie prekursorów osteoklastów ze szpiku kostnego szczura

Ten protokół obejmuje preparację mysich kości długich i izolację szpiku kostnego, w celu wytworzenia makrofagów szpiku kostnego i wytworzenia osteoklastów za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF) i aktywatora receptora liganda czynnika jądrowego Kappa-B (RANKL) lub czynnika martwicy nowotworu alfa (TNF-α) i ich zatrzymanie przez przeciwciało anty-c-fms, receptor M-CSF.

Wpływ przeciwciała anty-c-fms na tworzenie i proliferację prekursora osteoklastów in vitro

Ten protokół przedstawia test wychwytu aminokwasów znakowany radioaktywnie, który jest przydatny do oceny zużycia aminokwasów zarówno w komórkach pierwotnych, jak i w izolowanych kościach.

Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych

Test przepływu metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym mierzy zużycie tlenu i stopień zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, co odpowiada produkcji mitochondrialnego i glikolitycznego trifosforanu adenozyny, przy użyciu czujników pH i tlenu. W manuskrypcie wyjaśniono metodę pozwalającą zrozumieć stan energetyczny osteoblastów oraz charakterystykę i interpretację statusu bioenergetycznego komórek.

Wykorzystanie analizatora strumienia metabolicznego komórek w czasie rzeczywistym do monitorowania bioenergetyki osteoblastów

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną procedurę testową dla testów resorpcyjnych z użyciem płytek do hodowli komórkowych pokrytych fosforanem wapnia.

Prosty protokół testu wgłębnego do wizualizacji i ilościowego określenia resorpcji osteoklastycznej in vitro

Tutaj prezentujemy protokoły, które oferują elastyczną i strategiczną podstawę do wirusowego manipulowania komórkami prekursorowymi oligodendrocytów w celu nadekspresji interesujących białek w celu specyficznego zbadania ich roli w oligodendrocytach za pomocą modelu mielinizacji ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Produkcja i wykorzystanie lentiwirusa do selektywnej transdukcji pierwotnych komórek prekursorowych oligodendrocytów do testów mielinizacji in vitro

Poznaj metodę analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro przy użyciu linii komórkowej RAW 264.7. Technika ta pozwala badać żywotność, różnicowanie i funkcję osteoklastów w kontekście toksyczności środowiskowej.

Metody analizy wpływu naturalnego uranu na osteoklastogenezę in vitro

Przeglądaj więcej filmów