Etykietowanie załącznika V i jodku propidyny

Znakowanie komórek aneksyną V i jodkiem propidyny (PI) jest techniką stosowaną do identyfikacji śmierci komórki i rozróżniania jej różnych ścieżek: apoptozy lub zaprogramowanej śmierci komórki i martwicy. Komórki przechodzą wyraźne zmiany morfologiczne w zależności od szlaku. Identyfikując konkretne warunki, które prowadzą komórkę do apoptozy lub martwicy, naukowcy uzyskują wgląd w fizjologię komórkową i patofizjologię choroby. Znakowanie aneksyną V i PI, a następnie cytometria przepływowa, zostały uznane za jedną z najskuteczniejszych metod kategoryzacji rodzaju śmierci komórki.

Dzisiaj opiszemy, w jaki sposób ten test pomaga w identyfikacji ścieżek śmierci komórki, jak wykonać tę technikę oraz kilka ekscytujących przykładowych eksperymentów, które wykorzystują tę metodę, aby odpowiedzieć na ważne pytania w dziedzinie biologii komórki.

Najpierw przyjrzyjmy się zasadom barwienia aneksyny V i PI.

Jak wspomniano wcześniej, komórki apoptotyczne wykazują charakterystyczne cechy morfologiczne. Należą do nich kurczenie się komórek, pęcherzenie błony, fragmentacja jądra i pojawienie się ciał apoptotycznych. Ponadto po indukcji apoptozy – czyli we wczesnej fazie apoptozy – na błonie pojawiają się pewne charakterystyczne zmiany. Normalna błona komórkowa zawiera wszystkie reszty fosfatydyloseryny lub PS na wewnętrznej ulotce. Jednak we wczesnych komórkach apoptotycznych niektóre z tych reszt PS są przenoszone na powierzchnię zewnętrzną - ale jak?

Aby to zrozumieć, cofnijmy się o krok. Podczas apoptozy dobrze wiadomo, że aktywowane są kaspazy cytozolowe. Enzymy te z kolei aktywują enzym związany z błoną zwany scramblazą. Scramblase "miesza" błonę komórkową poprzez translokację reszt PS ze strony cytoplazmatycznej na powierzchnię zewnętrzną. Natomiast podczas martwicy pozostałości PS pozostają tam, gdzie są, ale sama membrana pęka. Oznakowanie Aneksyny V i PI wykorzystuje te różnice w zmianach błonowych tych dwóch typów śmierci komórki.

Aneksyna V sprzężona z barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak izotiocyjanian fluoresceiny - powszechnie znany jako FITC - jest nieprzepuszczalnym, naturalnym ligandem dla PS, a zatem łatwo identyfikuje wczesne komórki apoptotyczne poprzez wiązanie się z eksternalizowanym PS. Jednak po pęknięciu błony, do którego dochodzi podczas martwicy, a także w późniejszych stadiach apoptozy, aneksyna może również wiązać się z PS na wewnętrznej powierzchni i dawać fałszywie dodatnie wyniki.

Aby tego uniknąć, naukowcy używają PI. Ta cząsteczka barwnika wiążącego DNA jest ponownie nieprzepuszczalna dla błony i może dostać się do komórki tylko wtedy, gdy błona zostanie zerwana. Dlatego, jeśli komórka jest wybarwiona tylko aneksyną, jest wczesna apoptoza, podczas gdy komórka, która jest wybarwiona zarówno PI, jak i aneksyną, może być nekrotyczna lub późno apoptoza.

Teraz, gdy znasz już podstawowe zasady tego testu, przejdźmy przez procedurę barwienia i analizy śmierci komórki.

Po pierwsze, komórki są zbierane i odwirowywane z małą prędkością, aby zapobiec zakłóceniom morfologicznym, a następnie ponownie zawieszane w fizjologicznym buforze myjącym, takim jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami, znana również jako PBS. Po kolejnym etapie wirowania komórki są ponownie zawieszane w buforze wiążącym aneksynę V zawierającym wapń, który jest niezbędny do wiązania aneksyny z PS. Aneksyna V sprzężona z FITC jest następnie dodawana do roztworu, który inkubuje się w temperaturze pokojowej w ciemności, aby umożliwić asocjację aneksyny i PS. W następnym kroku PI dodaje się bezpośrednio do roztworu komórek barwiących aneksynę i inkubuje w ciemności. Po inkubacji komórki są myte w PBS przez odwirowanie, ponownie zawieszane w buforze płuczącym i trzymane na lodzie. Teraz są gotowe do analizy.

Aktywność fluorescencyjna komórek jest analizowana za pomocą cytometrii przepływowej, techniki laserowej, która przechwytuje dane fluorescencyjne z pojedynczych komórek zawieszonych w strumieniu płynu. Po kalibracji fluorescencji przy użyciu komórek oddzielnie barwionych każdym barwnikiem, pozyskiwane są dane z podwójnie barwionych komórek. Sygnały fluorescencyjne z populacji komórek są wykorzystywane do utworzenia wykresu, na którym intensywność FITC związana z anektyną jest wykreślana na logarytmicznej osi X, a PI na logarytmicznej osi Y. Komórki, które są dodatnie pod względem anektyny-FITC i ujemne PI, skupią się w prawym dolnym rogu wykresu, reprezentując wczesne komórki apoptotyczne, a komórki podwójnie dodatnie dla aneksyny-FITC i PI wystąpią w prawym górnym rogu, reprezentując komórki późnej apoptozy lub martwicy. Komórki, które pozostają niezabarwione lub nieznacznie wybarwione zarówno dla aneksyny, jak i PI, są żywymi komórkami.

Skoro już wiesz, dlaczego biolodzy komórkowi polegają na tej technice do badania śmierci komórki, dlaczego nie przyjrzymy się niektórym z jej zastosowań.

Korzystając z tej procedury, naukowcy mogą śledzić, które białka wewnątrzkomórkowe są zaangażowane w apoptozę. W tym filmie naukowcy przeanalizowali wpływ cisplatyny, leku przeciwnowotworowego, na normalne komórki nerkowe, aby sprawdzić, czy indukuje apoptozę. Jeden zestaw komórek został transdukowany w celu nadekspresji aktywnej formy enzymatycznej kinazy białkowej C lub PKC, a drugi zestaw został transdukowany formą niefunkcjonalną - dominującą ujemną PKC. Komórki wykazujące ekspresję PKC i leczone cisplatyną ulegały apoptozie w czasie, ale komórki wyrażające nieaktywną dominującą ujemną PKC były odporne na apoptozę, co wskazuje, że enzym ten jest kluczowym graczem w szlaku apoptozy indukowanej cisplatyną.

Naukowcy wykorzystują również te barwniki do testowania potencjału cytotoksycznego określonych limfocytów T. Cytotoksyczne limfocyty T mogą rozpoznawać specyficzne białka błonowe na komórce docelowej i indukować jej śmierć po związaniu się z nią. Tutaj naukowcy inkubowali limfocyty T specyficzne dla antygenu z docelowymi komórkami nowotworowymi i aneksyną V, a następnie obserwowali indukcję apoptozy komórek nowotworowych przez zaangażowanie limfocytów T. Dane z cytometrii przepływowej ujawniły odsetek śmierci komórek docelowych w obecności i bez cytotoksycznych limfocytów T.

Wreszcie, naukowcy wykorzystują tę metodę do oceny żywotności komórek po dostarczeniu genu. W tym przypadku naukowcy chcieli ocenić przeżywalność komórek po nukleofekcji – metodzie, która wykorzystuje kombinację substancji chemicznych i zastosowanego pola elektrycznego do tworzenia przejściowych porów w błonach komórkowych i jądrowych, ułatwiając w ten sposób dostarczanie genów. Używając aneksyny V i barwnika zwanego 7-aminoaktynomycyną D lub 7-AAD, który, podobnie jak PI wiąże się z DNA, wykazali, że nukleofekcja powoduje niską śmierć komórek przez apoptozę lub martwicę.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat etykietowania aneksyny V i PI. W tym filmie pokrótce omówiliśmy cechy wyróżniające komórki apoptotyczne i martwicze, dokonaliśmy przeglądu zasad stojących za tą metodą, obejrzeliśmy uogólnioną procedurę dla tej powszechnie stosowanej techniki i zapoznaliśmy się z niektórymi zastosowaniami. Biorąc pod uwagę znaczenie zrozumienia, w jaki sposób różne komórki umierają w różnych warunkach, znakowanie aneksyny V i PI służy jako ważne narzędzie dla biologów komórkowych zainteresowanych tym zjawiskiem. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!