Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
15 grudnia 2017
Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.
Ogólnym celem tej metody jest wykrycie zmienności liczby kopii genu w próbkach surowicy lub osocza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaawansowanego raka prostaty, takie jak wykrywanie markerów przydatnych do przewidywania lub monitorowania redukcji zarodników. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa i szybka do wykonania. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zaawansowanego raka prostaty, ponieważ zmienność liczby kopii genu receptora androgenowego jest częstym zjawiskiem. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ stężenie i jakość DNA bezkomórkowego są często niższe niż oczekiwano. Do pobrania surowicy należy pracować z pięcioma mililitrowymi próbkami krwi pełnej i surowicy bez antykoagulantów utrzymywanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocząć od odwirowania próbek przez 15 minut w temperaturze 1 000 g. Supernatantem jest surowica. Przełóż go do dwumililitrowych probówek i wyrzuć granulkę. O ile surowica nie zostanie natychmiast przetworzona, próbki należy zamrozić w temperaturze 80
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsza publikacja opisuje analizę zmienności liczby kopii wykonaną w DNA z surowicy lub osocza z zastosowaniem metody real-time PCR. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania lekooporności u pacjentów z rakiem prostaty opornym na kastrację i może być pomocna w diagnostyce innych chorób.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Onkologia
- Genomika
- Badania kliniczne
Wstęp
- Zmienność liczby kopii (CNV) może wpływać na progresję choroby.
- Real-time PCR jest czułą metodą wykrywania CNV.
- Rak prostaty oporny na kastrację stwarza wyjątkowe wyzwania w leczeniu.
- Zrozumienie mechanizmów oporności na leki jest kluczowe dla prowadzenia pacjentów.
Cel badania
- Analiza CNV w DNA surowicy lub osocza.
- Ocena potencjału tej metody w przewidywaniu oporności na leki.
- Zbadanie możliwości zastosowania tej metody w innych chorobach.
Zastosowane metody
- Real-time PCR do analizy CNV.
- Pobieranie próbek z surowicy lub osocza.
- Analiza statystyczna danych CNV.
- Porównanie z wynikami klinicznymi u pacjentów z rakiem prostaty.
Główne wyniki
- Identyfikacja specyficznych CNV związanych z lekoopornością.
- Korelacja między wzorcami CNV a wynikami leczenia pacjentów.
- Wykazanie czułości i swoistości metody.
- Potencjalne implikacje dla strategii leczenia raka prostaty.
Wnioski
- Metoda real-time PCR jest skuteczna w analizie CNV.
- Wyniki mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia lekooporności w nowotworach.
- Konieczne są dalsze badania w celu walidacji wyników w innych chorobach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Wykrywanie przyrostu liczby kopii receptora androgenowego w krążącym wolnym DNA umożliwia nieinwazyjne monitorowanie mechanizmów oporności terapeutycznej w przerzutowym, kastracyjno-oporny raku prostaty. Podejście to wspiera wczesną identyfikację niepowodzenia leczenia i dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji klinicznych dzięki małoinwazyjnemu pobieraniu próbek. Metoda ta zapewnia szybki i skalowalny schemat oceny biomarkerów w zastosowaniach biopsji płynnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie amplifikacji genu AR jako czynnika napędzającego oporność terapeutyczną w modelach raka prostaty.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje cfDNA z surowicy/osocza, aby uniknąć inwazyjnego pobierania tkanek w badaniach podłużnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia ilościowe pomiary liczby kopii (CN) z wykorzystaniem dupleksowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym z genami referencyjnymi RNaseP i AGO1.
- Wartość operacyjna: Standaryzowana ilość wejściowa 60 ng DNA na badanie zapewnia powtarzalność w obrębie zestawów próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zwiększenie liczby kopii (CN gain) AR w cfDNA koreluje z progresją mCRPC, co wspiera wysiłki w zakresie kwalifikacji biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Nieinwazyjne pobieranie próbek umożliwia częste monitorowanie w kohortach przedklinicznych i klinicznych.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania biomarkerów, wspierając walidację celów za pomocą płynnej biopsji i umożliwiając późniejsze badanie mechanizmów oporności w modelach raka prostaty.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotezy, że wzrost liczby kopii (CN) receptora androgenowego (AR) w cfDNA przewiduje oporność na leczenie w zaawansowanym raku prostaty.
- Przesiew: Generowanie ilościowych danych CN odpowiednich do standaryzacji testu i oceny wpływu związków.
- Analityka: Dostarczanie stosunków CNV względem genów referencyjnych do porównań statystycznych między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Powiązanie biomarkerów cfDNA z wynikami klinicznymi w raku prostaty opornym na kastrację.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Protokół można dostosować do innych genów docelowych i jednostek chorobowych poza rakiem prostaty.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Mechanistyczna analiza ryzyka amplifikacji AR jako biomarkera oporności w raku prostaty.
- Wartość operacyjna: Szybki protokół wymagający niewielkiej ilości materiału, wykorzystujący standardowy sprzęt do rzeczywistej PCR.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań (go/no-go) na podstawie nieinwazyjnego monitorowania oporności.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację terapii ukierunkowanych na zmiany w szlaku AR w oparciu o analizę ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w ekstrakcji i kwantyfikacji cfDNA z próbek o niskiej wydajności.
- Zależne od aparatury do PCR w czasie rzeczywistym z możliwością multipleksowania.
- Wymaga standaryzacji między laboratoriami w zakresie wyboru genu referencyjnego i analizy danych.
- Ograniczone przez ilość i jakość cfDNA, co wymaga optymalizacji materiału wejściowego.
- Zaleca się walidację za pomocą metod ortogonalnych, takich jak cyfrowy PCR, w celu potwierdzenia przyrostu liczby kopii (CN gain).
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Collection of Serum or Plasma
2:20
Isolating Cell-free (cfDNA) from Serum or Plasma
5:15
Real-time PCR and Analysis of cfDNA
7:36
Results: Detection of Androgen Receptor (AR) Copy Number Variations in cfDNA of Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer (CRPC) Patients
8:25
Conclusion
