Name: Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Poznaj metodę PCR w czasie rzeczywistym do analizy wariacji liczby kopii DNA w surowicy i osoczu. Ta technika umożliwia przewidywanie oporności na leki u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Chiarze Molinari i Filippo Martignano za wsparcie w analizie danych.

Protokół polega na izolacji DNA z próbek surowicy lub osocza w celu przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym w celu analizy liczby kopii. Przeprowadzono ekstrakcję DNA, kontrolę ilości DNA (spektrofotometr) oraz PCR w czasie rzeczywistym dla określonych celów. W Rysunek 1, przedstawione jest podsumowanie procedur i oś czasu.
Protokół jest zgodny z wytycznymi Komitetu Etyki Badań Naukowych IRST.
1. Pobieranie i przetwarzanie surowicy
<ol>
	<li>Zebrać około 5 ml krwi pełnej do probówki z surowicą bez antykoagulantu, aby uzyskać surowicę. Utrzymać probówki z krwią w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.</li>
	<li>Probówki wirówkowe o ciśnieniu 1 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś surowicę do probówek o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Wyrzucić probówkę zbiorczą i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przetwarzanie osocza
<ol>
	<li>Zebrać około 10 ml krwi pełnej do probówki osocza z EDTA, aby uzyskać osocze. Całkowicie napełnij rurkę, a następnie odwróć ją 8 razy. Utrzymać probówki z krwią w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 1 800 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej bez ustawiania hamulca na wirówce.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść górną część osocza do probówek o pojemności 2 ml. Powtórzyć transfer, pozostawiając co najmniej 1 ml supernatantu nad warstwą krwinek białych. 
	UWAGA: Przeniesienie górnej części supernatantu zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia przez komórki lub szczątki komórek.</li>
	<li>Wyrzucić probówkę zbiorczą i natychmiast zamrozić supernatant w temperaturze -80 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Izolacja DNA z surowicy lub osocza
UWAGA: Izolacja DNA z surowicy lub osocza powinna być przeprowadzona przy użyciu komercyjnego protokołu zmodyfikowanego w następujących krokach.
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną podwielokrotność (zawierającą od 0,5 do 2 ml) surowicy lub osocza w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować i wymieszać próbkę i przenieść 0,5 ml surowicy lub osocza do przezroczystej probówki o pojemności 1,5 ml. Resztę materiału zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Dodać 50 μl proteinazy k (20 mg/ml) bezpośrednio do próbki.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml buforu do lizy do próbki i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Zamknąć probówki i inkubować próbki w temperaturze 56 °C przez 15 minut w bloku grzewczym.</li>
	<li>Dodaj wskazaną ilość 100% etanolu w buforze do przemywania 1 i 2, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Doprowadzić próbki z powrotem do temperatury pokojowej, dodać 0,5 ml absolutnego alkoholu etylowego i dobrze wymieszać przez pipetowanie.</li>
	<li>Dodać 650 μl mieszaniny otrzymanej w kroku 3.7 do kolumny rozdzielającej i odwirować przy 6 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i umieść kolumnę na nowej czystej probówce zbiorczej. Powtórz kroki 3.8 i 3.9 jeszcze raz.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu do przemywania 1, nie zwilżając brzegu kolumny i odwirować przy 6 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i zastąp ją nową czystą probówką zbiorczą.</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu płuczącego 2, nie zwilżając brzegu kolumny i odwirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 min.</li>
	<li>Wyrzuć probówkę, przez którą przepływa przepływ, i zastąp ją nową czystą probówką zbiorczą.</li>
	<li>Wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 3 minuty, aby usunąć resztki buforu myjącego.</li>
	<li>Umieść kolumnę w czystej probówce o pojemności 1.5 ml. Dodać 150 μl buforu elucyjnego i odczekać 7 minut, aby upewnić się, że bufor zwilżył kolumnę.</li>
	<li>Wirować przy 8 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Ponownie pipetować elucję z kroku 3.16 do tej samej kolumny i wirować z pełną prędkością (20 000 x g) przez 1 minutę, aby zapewnić maksymalny odzysk DNA.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja i rozcieńczenie DNA
<ol>
	<li>Przeprowadzić kwantyfikację DNA za pomocą spektrofotometru. Użyć 2 μl próbki na spektrofotometrze laboratoryjnym zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Jeśli ilość DNA nie jest wystarczająca do przeprowadzenia PCR w czasie rzeczywistym (co najmniej 120 ng), wykonaj nowy proces izolacji DNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA z surowicy lub osocza do 2,5 ng/μl w końcowej objętości wystarczającej do przeprowadzenia wszystkich testów PCR w czasie rzeczywistym (około 50 μl).</li>
</ol>
5. PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Testy liczby kopii rozmrażających, referencyjne testy genetyczne, próbki rozcieńczone DNA i kalibratory zebrane w lodzie. W temperaturze pokojowej zrównoważyć mieszankę wzorcową, która jest przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę 1 μl testu docelowego, 1 μl referencyjnego testu genetycznego i 10 μl mieszanki wzorcowej dla 3 powtórzeń każdej próbki i połączonych kalibratorów. Przygotować mieszaninę wraz z kontrolą ujemną (woda) i 2 dodatkowymi próbkami.</li>
	<li>W 96-dołkowej płytce podwielokrotnie 12 μl mieszanki do każdej studzienki. Nie pipetować ani nie wirować probówek.</li>
	<li>Dodać 8 μl (stężenie 2,5 ng/μl) każdej próbki DNA i skalibrować je w każdym dołku. Nie pipetować ani nie wirować probówek. Zmień końcówkę dla każdej studzienki. 
	UWAGA: 30 próbek DNA można przetworzyć dla każdego eksperymentu w czasie rzeczywistym przy użyciu płytki 96-dołkowej: 30 x 3 próbki + 1 x 3 kalibratory połączone + kontrola ujemna = 94.</li>
	<li>Krótko odwiruj talerz przy 1 000 x g.</li>
	<li>Uruchomić płytkę zgodnie z następującym protokołem: utrzymać stolik w temperaturze 95 °C przez 10 minut, 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę.</li>
</ol>
6. Analiza i interpretacja danych
<ol>
	<li>W sekcji "opcja", poniżej wyników wykresu amplifikacji, ustaw próg Ct na 0,2 dla pierwszego analizowanego genu docelowego. Powtórz zestaw dla każdego genu docelowego lub referencyjnego. Aby wyeksportować plik PCR w czasie rzeczywistym w .txt rozszerzeniu, naciśnij "Eksportuj" na pasku narzędzi. Oznacz tylko "wyniki" w wybierz dane do eksportu → wybierz jako typ pliku rozszerzenie .txt → naciśnij "rozpocznij eksport"→ zamknąć narzędzie eksportu.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie analityczne i zaimportuj plik .txt (pasek narzędzi → importu).</li>
	<li>Wybierz nazwę pliku do analizy i wybierz ustawienie analizy według paska narzędzi (symbol odtwarzania).</li>
	<li>Określ próbkę kalibratora i znaną liczbę kopii celu (np. 1 kopia dla genu AR). Naciśnij "zastosuj".</li>
	<li>Dla każdej próbki należy pominąć jedną studzienkę o innej delcie Ct (ΔCt) w porównaniu z innymi studzienkami.</li>
	<li>Ponownie przeanalizuj eksperyment (naciśnij symbol odtwarzania).</li>
	<li>Oceń wyniki za pomocą wykresu słupkowego kopiowania numeru lub tabeli. 
	UWAGA: Tabela wyników zawiera wiele parametrów, takich jak ufność, wskaźnik Z i analizowane repliki, które mogą być przydatne do interpretacji wyników.</li>
</ol>

<ol><li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+DNA+as+a+diagnostic+marker+for+cancer%3A+current+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Onco+Targets+Ther%22%5BJournal%5D)">Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights.</a> Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+DNA+as+a+liquid+biopsy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer.</a> Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).</li>
<li>Murtaza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+analysis+of+acquired+resistance+to+cancer+therapy+by+sequencing+of+plasma+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA.</a> Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).</li>
<li>Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+detection+of+genome-wide+somatic+copy+number+alterations+by+liquid+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies.</a> Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).</li>
<li>Diaz, L. A. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+evolution+of+acquired+resistance+to+targeted+EGFR+blockade+in+colorectal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers.</a> Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).</li>
<li>Dawson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circulating+tumor+DNA+to+monitor+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer.</a> N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+cell-free+AR+and+CYP17A1+copy+number+variations+may+associate+with+outcome+of+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer+patients+treated+with+abiraterone%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone.</a> Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Romanel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+AR+and+abiraterone-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer.</a> Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).</li>
<li>Conteduca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Androgen+receptor+gene+status+in+plasma+DNA+associates+with+worse+outcome+on+enzalutamide+or+abiraterone+for+castration-resistant+prostate+cancer%3A+a+multi-institution+correlative+biomarker+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study.</a> Ann Oncol. , (2017).</li>
<li>Attard, G., Antonarakis, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate+cancer%3A+AR+aberrations+and+resistance+to+abiraterone+or+enzalutamide%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Urol%22%5BJournal%5D)">Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide.</a> Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).</li>
<li>Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+genomic+DNA+in+plasma+and+serum+samples%3A+higher+concentrations+of+genomic+DNA+found+in+serum+than+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma.</a> Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).</li>
<li>Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+preanalytical+factors+on+the+molecular+size+of+cell-free+DNA+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood.</a> Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

AR Analiza CN w próbce surowicy i osocza stanowi nowe, nieinwazyjne podejście do stratyfikacji pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację (CRPC). Niedawno wykazano, że AR CN jest w stanie przewidzieć wyniki u pacjentów z CRPC leczonych abirateronem i enzalutamidem, przed i po chemioterapii 7,8,9,10.
Główną zaletą naszego podejścia je...

Wykazano, że krążące wolne DNA komórkowe (cfDNA) we krwi jest optymalnym źródłem biomarkerów do diagnozowania raka, prognozowania, monitorowania i przewidywania oporności na leczenie1,2. Wiele badań wykazało dobrą zgodność między zmianami DNA (mutacje, zmiany liczby kopii, modyfikacje epigenetyczne) w tkankach a tymi znalezionymi w odpowiednich próbkach osocza1, potwierdzając, że krążące DNA guza (ctDNA) jest informacyjne dla pierwotnych i przerzutowych zmian w tkance nowotworowej3. Możliwość badania ctDNA pozwala zatem na rekonstrukcję rearanżacji genomu i zmian liczby kopii (CNV) w określonych onkogenach4, identyfikując potencjalnie przerzutowe komórki klonalne i subklonalne. Wykazano, że CtDNA jest klinicznie przydatny, szczególnie do monitorowania leczenia raka, ponieważ zawiera specyficzne mutacje i CNV, związane ze specyficznymi terapiami celowanymi5,6. Eliminuje również potrzebę wykonywania biopsji tkanek i pozwala na uzyskanie wyników w różnych momentach podczas określonego leczenia raka w sposób nieinwazyjny.
W odniesieniu do raka prostaty, wykazano istotną korelację między krążącymi CNV receptorów androgenowych wolnych komórek (AR) a odpowiedzią na leczenie abirateronem i enzalutamidem, co wskazuje, że liczba kopii genu AR (CN) w cfDNA może być obiecującym biomarkerem zdolnym do przewidywania oporności na leczenie7,8,9,10,11. CNV określonych genów w ctDNA mogą być oceniane przy użyciu różnych podejść o różnej czułości, kosztach i szybkości (np. sekwencjonowanie w czasie rzeczywistym, Digital PCR i Next Generation Sequencing).
Tutaj opisujemy proste i szybkie podejście, oparte na testach dupleksowych w technologii PCR w czasie rzeczywistym, do oceny AR CN w cfDNA z próbek surowicy i osocza7,8. Rozważyliśmy dwa różne testy PCR zaprojektowane na dwóch różnych regionach genomu w obrębie intronu 5 AR (Xq12) i dwóch innych genów, jako wewnętrznych standardowych genów referencyjnych, o których wiadomo, że mają normalny status liczby kopii w raku prostaty (RNaseP, zlokalizowany na 14q11; AGO1, znajduje się na 1p34). Wybraliśmy dwa geny referencyjne, a nie jeden, aby zwiększyć precyzję i czułość wyników. Ilość DNA wynosząca 60 ng amplifikowano dla każdej kombinacji testów (test łączony dla AR-assay_1+RNaseP i dla AR-assay_2+AGO1). Trzy próbki DNA surowicy lub osocza od zdrowych mężczyzn zostały połączone i użyte jako kalibrator. Wzięliśmy pod uwagę wartości graniczne >1,5 dla wzmocnienia AR i <0,5 dla usuwania. Jedną z głównych zalet tej metody jest to, że jest ona elastyczna i że inne geny mogą być również oceniane, zmieniając standardowe wewnętrzne geny referencyjne na podstawie typu i cech guza.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer Probówki do surowicy</td><td>Becton Dickinson</td><td>367814</td><td>probówka z krwią pełną do surowicy</td></tr><tr><td>BD Vacutainer EDTA Probówki</td><td>Becton Dickinson</td><td>366643</td><td>pełna probówka z krwią do osocza</td></tr><tr><td>Absolutny etanol</td><td>VWR</td><td></td><td>użytkownik może korzystać również z innych firm</td></tr><tr><td>TaqMan Test liczby kopii</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4400291</td><td>Wstępnie zaprojektowane i zwalidowane testy z barwnikiem FAM. Użyliśmy następującego testu: AR_assay1: hs04107225 i AR_assay2: hs04511283</td></tr><tr><td>Test liczby kopii TaqMan (zmodyfikowany)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4467084</td><td>Wstępnie zaprojektowany test zmodyfikowany barwnikiem VIC: AGO1: Hs02320401_cn</td></tr> Test <tr><td>referencyjny numeru kopii TaqMan, człowiek, RNase P</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4403326</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4326708</td><td>Mieszanka główna do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Mini Kit (50)</td><td>Zestaw do ekstrakcji DNA</td> <td>Qiagen</td><td>51304</td></tr><tr><td>MicroAmp 96-dołkowe płytki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td>płytki do</td></tr><tr><td>spektrofotometru NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>-</td> <td>użytkownik może użyć również innych metod spektrofotometrycznych do ilościowego określenia systemu</td></tr><tr><td>szybkiego PCR</td> <td>w czasie rzeczywistym DNA 7500Applied Biosystem</td> <td>-</td> <td>użytkownik może korzystać również z innego instrumentu czasu rzeczywistego</td></tr><tr><td>CopyCaller Software</td><td>Applied Biosystem</td> <td>-</td> <td>oprogramowanie do analizy liczby kopii</td></tr></tbody></table>

wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą pcr w czasie rzeczywistym

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Wykazano, że wolne od DNA w surowicy i komórkach plazmatycznych (cfDNA) jest informacyjnym, nieinwazyjnym źródłem biomarkerów do diagnozowania raka, prognozowania, monitorowania i przewidywania oporności na leczenie. Wychodząc od hipotezy, że przyrost liczby kopii genu (CN) receptora androgenowego (AR) jest częstym zdarzeniem w raku prostaty z opornością na kastrację z przerzutami (mCRPC), proponujemy analizę tego zdarzenia w cfDNA jako potencjalnego biomarkera predykcyjnego.
Oceniliśmy AR CN w cfDNA za pomocą 2 różnych testów PCR w czasie rzeczywistym i 2 genów referencyjnych (RNaseP i AGO1). Do każdej kombinacji testów użyto ilości DNA wynoszącej 60 ng. Ar Przyrost CN potwierdzono przy użyciu Digital PCR jako dokładniejszej metody. Wykazano już, że analiza zmienności CN dostarcza informacji w przewidywaniu oporności na leczenie w warunkach mCRPC, ale może być również przydatna do innych celów w różnych warunkach pacjentów. Analiza CN cfDNA ma kilka zalet: jest nieinwazyjna, szybka i łatwa do przeprowadzenia, a zaczyna się od niewielkiej objętości surowicy lub osocza.

Całkowite stężenie cfDNA było mierzalne metodą spektrofotometryczną dla wszystkich analizowanych próbek, wykazując medianę 6,12 ng/µL (zakres: 2,0 - 23,71 ng/µL) dla próbek surowicy oraz medianę 3,21 ng/µL (zakres: 2,31 - 8,49 ng/µL) dla próbek osocza. Łącznie przeanalizowano 15 próbek za pomocą eksperymentów real-time PCR.
Czułość testu oceniono przy użyciu mieszanin DNA z surowicy pacjentów z wysokim lub niskim przyrostem licz...

Ten manuskrypt opisuje analizę zmienności liczby kopii przeprowadzoną w DNA surowicy lub osocza przy użyciu metody PCR w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest odpowiednia do przewidywania oporności na leki u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego opornym na kastrację, ale może być również pouczająca w przypadku innych chorób.

Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Ogólnym celem tej metody jest wykrycie zmienności liczby kopii genu w próbkach surowicy lub osocza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zaawansowanego raka prostaty, takie jak wykrywanie markerów przydatnych do przewidywania lub monitorowania redukcji zarodników. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa i szybka do wykonania. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zaawansowanego raka prostaty, ponieważ zmienność liczby kopii genu receptora androgenowego jest częstym zjawiskiem. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ stężenie i jakość DNA bezkomórkowego są często niższe niż oczekiwano. Do pobrania surowicy należy pracować z pięcioma mililitrowymi próbkami krwi pełnej i surowicy bez antykoagulantów utrzymywanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Rozpocząć od odwirowania próbek przez 15 minut w temperaturze 1 000 g. Supernatantem jest surowica. Przełóż go do dwumililitrowych probówek i wyrzuć granulkę. O ile surowica nie zostanie natychmiast przetworzona, próbki należy zamrozić w temperaturze 80

serum-and-plasma-copy-number-detection-using-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Rękopis opisuje cyfrowy test PCR oparty na chipie, który wykrywa rzadki wariant transkryptu CDH1 (CDH1a) w świeżo zamrożonych tkankach normalnych i nowotworowych pobranych od pacjentów z rakiem żołądka.

Wykrywanie rzadkiego wariantu transkryptu CDH1 w świeżo mrożonych tkankach raka żołądka za pomocą cyfrowego PCR opartego na chipie

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego ilościowego oznaczania wielu zmian genetycznych regionu docelowego w jednej reakcji za pomocą drop-off ddPCR i unikalnej pary sond hydrolizy.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy z pojedynczą kroplą do kompleksowego i jednoczesnego wykrywania mutacji w obszarach hotspotów

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania mutacji somatycznych nowotworu w krążącym DNA obecnym w płynach biologicznych pacjenta (biofluidach). Nasza metoda oparta na kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy (dPCR) umożliwia ilościowe określenie częstości alleli mutacji nowotworowych (MAF), ułatwiając minimalnie inwazyjne uzupełnienie diagnozy i czasowego monitorowania odpowiedzi guza.

Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta

Tutaj prezentujemy protokół pomiaru bezwzględnej liczby kopii mitochondrialnego (mt)DNA i poziomów heteroplazmii delecji mtDNA w pojedynczych komórkach.

Pomiar liczby kopii i heteroplazmii mitochondrialnego DNA pojedynczej komórki za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Ten protokół umożliwia ujawnienie wpływu profagów na ich gospodarzy. Kultury bakteryjne są synchronizowane w warunkach, które najlepiej wspierają stan lizogeniczny, ograniczając spontaniczną indukcję. RT-qPCR jednoznacznie odróżnia geny ograniczone do profagów i te niesprzężone z kontroli fagów od tych, które ulegają ekspresji podczas cyklu replikacji litycznej.

Zrozumienie wpływu bakteriofagów strefy umiarkowanej na ich lizogeny poprzez transkryptomikę

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Poznaj metodę PCR w czasie rzeczywistym do analizy wariacji liczby kopii DNA w surowicy i osoczu. Ta technika umożliwia przewidywanie oporności na leki u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty.

Wykrywanie liczby kopii w surowicy i osoczu za pomocą PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów