Automatyczne, szybkie, iteracyjne badanie ujemnej geotaksji do analizy zachowania wspinaczy u dorosłych w modelu Drosophila neurodegeneracji
12 września 2017
Ten krok po kroku protokół analizuje zachowanie Drosophila w ujemnej geotaksji za pomocą zautomatyzowanego systemu wielocylindrowego, który pomieści setki much i synchronizuje ich działania za pomocą silnika elektrycznego. Po synchronizacji zachowanie ujemnej geotaksji much jest badane, nagrywane cyfrowo i analizowane za pomocą oprogramowania RflyDetection.
Głównym celem tego zautomatyzowanego szybkiego iteracyjnego testu negatywnej geotaksji jest analiza niedoborów wspinaczkowych dorosłych Drosophila związanych z neurodegeneracją. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurologii, takie jak mechanizm niedoborów lokomocyjnych związanych z neurodegeneracją. Główną zaletą tej techniki jest to, że aktywność wspinaczkowa much może być analizowana w sposób zautomatyzowany i o wysokiej precyzji.
Zastosowanie tej techniki rozciąga się na terapię i diagnozę neurodegeneracji, ponieważ choroby neurodegeneracyjne są często związane z postępującą utratą zdolności ruchowych i zmniejszonym czasem życia oraz neurodegeneracją zależną od wieku. Po raz pierwszy mieliśmy pomysł na tę metodę. Chcieliśmy mierzyć aktywność lokomotywną dorosłych Drosophila w bardziej dokładny sposób.
Aby przeprowadzić kolekcjonowanie much, należy początkowo utrzymywać je na standardowym pokarmie na 25 stopniach Celsjusza, 70% wilgotności i w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemności. Zbieraj dziewicze samice UAS-Dicer2 DDC-GAL4 pod znieczuleniem dwutlenkiem węgla. Skojarz dziewice z dwu dniowymi dorosłymi samcami o następujących genotypach, z proporcją samiec/samica jedno-do-dwóch.
Oddzielnie zbieraj nowo wyklutych samców i samice w trzy pojemniki na każdą grupę na eksperyment, umieszczając 10 much w każdym zwykłym pojemniku na muchy z standardowym pokarmem. Następnie ustaw pojemniki na 25 stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić zautomatyzowany test RING, przenieś 10 zebranych much każdego genotypu do każdego pojemnika.
Następnie zabezpiecz pojemnik za pomocą śruby. Analizuj muchy kontrolne i muchy o różnych genotypach razem dla każdego zestawu eksperymentów. Włącz cyfrową kamerę umieszczoną przed urządzeniem i gdy muchy są załadowane i gotowe, zacznij nagrywać.
Kamera powinna być umieszczona poziomo, a kamerę w odpowiedniej odległości od urządzenia RING, aby uchwycić pozycje we wszystkich muchach w stosunkowo dokładnych miejscach. Po pozwoleniu jednej minucie na osiedlenie się much w pojemnikach, włącz kontroler krokowy, który steruje sterownikiem krokowym. To napędza mały silnik elektryczny do sterowania podłączonym dźwigniem, tak aby kolejno wspinały się i stukały w urządzenie cztery razy w ciągu dwóch sekund.
Po stuknięciu urządzenia, zauważ, że muchy zaczynają wspinać się po ścianie. Przy nadal włączonym nagrywaniu, powtórz synchronizację tak jak właśnie pokazano, w 60-sekundowych odstępach przez trzy do pięciu kolejnych prób. Powtórz eksperyment dla 5, 15, 25 i 35-dniowych much.
Przeprowadź co najmniej trzy niezależne eksperymenty dla każdej grupy dla każdego eksperymentu, z co najmniej 30 zebranymi muchami lub trzema pojemnikami. Aby analizować dane, zaimportuj nagranie wideo do komputera. Dla każdej próby, weź zrzut ekranu z wideo sześć sekund po stuknięciu.
W oprogramowaniu R-fly detection, użyj menu pliku, aby zaimportować obraz zrzutu ekranu. Następnie, używając ikony linii bazowej na pasku narzędziowym, precyzyjnie ustaw górną i dolną linię bazową pojemnika, a następnie użyj kursora, aby zaznaczyć górną i dolną linie bazowe na obrazie. W pasku Ustawienia, w polu Flies in Rect, wprowadź liczbę much na pojemnik, a w polu Tube Height, wprowadź długość pojemnika.
Indywidualne pozycje much są wykrywane i oznaczane punktami na ekranie dla każdego pojemnika. Zauważ, że w tabeli na prawej panelu, oprogramowanie automatycznie określa odległość wspinaczki dla każdej muchy i wyświetla wartości średnie z 10 much w każdym pojemniku. Prezentuj dane jako średnia plus minus SEM.
Oblicz wartości P istotności przy użyciu jednoczynnikowej analizy wariancji z testem wielokrotnego porównania Bonferroniego. Analiza much Dicer2 przy użyciu zautomatyzowanego testu RING przedstawionego w tym filmie wykazała wiek zależny spadek odległości wspinaczki w sześciosekundowym przedziale czasowym zarówno dla samców, jak i samic, sugerując, że ekspresja aux w dopaminergicznych lub DA neuronach jest kluczowa dla aktywności lokomocyjnej much. Zdolność wspinaczkowa nie wydaje się być wpłynięta na nadmierną ekspresję auxGFP w neuronach DA i współwystępowanie auxR i auxGFP w neuronach DA ratowanych od fenotypu RNAi.
Po opanowaniu, można to wykonać w dwóch do trzech godzin, jeśli jest wykonywane poprawnie. Posiadanie tego rozwoju jest teraz sposobem dla naukowców w dziedzinie neurologii na badanie neurodegeneracji w Drosophila melanogaster. Nie zapominaj, że praca z elektrycznym urządzeniem RING może być niezwykle niebezpieczna, a każde potwierdzenie powinno być mocno zaciśnięte i starannie sprawdzone przed przeprowadzeniem tej procedury.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje zautomatyzowaną metodę analizy zachowania ujemnej geotaksji u Drosophila, koncentrując się na deficytach zdolności wspinaczkowych osobników dorosłych związanych z neurodegeneracją. Technika ta wykorzystuje system wielocylindryczny do synchronizacji i rejestracji ruchów much, co pozwala na uzyskanie informacji na temat deficytów lokomocyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Neurodegeneracja
Wstęp
- Muchówka Drosophila służy jako organizm modelowy do badania chorób neurodegeneracyjnych.
- Zachowanie w postaci ujemnej geotaksji jest miarą zdolności lokomocyjnych much.
- Neurodegeneracja często prowadzi do postępującego utraty sprawności ruchowej i skrócenia długości życia.
- Systemy zautomatyzowane zwiększają dokładność testów behawioralnych.
Cel badania
- Analiza deficytów wspinania się u Drosophila związanych z neurodegeneracją.
- Badanie mechanizmów leżących u podstaw deficytów lokomocyjnych.
- Poprawa dokładności pomiaru aktywności lokomocyjnej much.
Zastosowane Metody
- Zautomatyzowany system wielocylindryczny do synchronizowanego przemieszczania muszek.
- Cyfrowy zapis zachowań związanych z negatywną geotaksją.
- Analiza z wykorzystaniem autorskiego oprogramowania RflyDetection.
- Szybki iteracyjny test do wysokoprzepustowego gromadzenia danych.
Główne wyniki
- Skuteczna synchronizacja ruchów much w celu zapewnienia dokładnej analizy.
- Identyfikacja deficytów wspinania powiązanych z neurodegeneracją.
- Zautomatyzowana analiza okazała się wydajna i niezawodna.
- Potencjalne implikacje dla terapii i diagnostyki chorób neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Zautomatyzowany test zapewnia niezawodną metodę badania zachowań lokomocyjnych u Drosophila.
- Zdobyta wiedza może pomóc w opracowaniu podejść terapeutycznych w przypadku neurodegeneracji.
- Technika ta zwiększa zrozumienie zależności między ruchem a stanami neurodegeneracyjnymi.
Najczęściej zadawane pytania
Przemysłowe Znaczenie Praktyczne
Ten zautomatyzowany test wysokoprzepustowy umożliwia szybką kwantyfikację deficytów lokomocyjnych w modelach neurodegeneracji u Drosophila, wspierając wczesną walidację celów poprzez dostarczenie obiektywnych i powtarzalnych wyników behawioralnych. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach przesiewowych na etapie przedklinicznym, umożliwiając jednoczesną analizę setek much z wielu genotypów i grup wiekowych, co ułatwia efektywną ocenę związków lub modyfikatorów genetycznych. Jej integracja z procesami badawczymi pomaga w redukcji ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do celów neurodegeneracyjnych dzięki standaryzowanemu i skalowalnemu fenotypowaniu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację zależnych od wieku deficytów wspinania się powiązanych z neurodegeneracją w modelach genetycznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez wysokoprzepustowy pomiar aktywności lokomocyjnej jako wskaźnika integralności neuronalnej.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane behawioralne wspomagające selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację genotypów z istotnymi zaburzeniami motorycznymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie standaryzowanych i powtarzalnych pomiarów negatywnej geotaksji, odpowiednich do walidacji testów w kampaniach przesiewowych skoncentrowanych na neurodegeneracji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia szybki screening modyfikatorów genetycznych lub farmakologicznych dzięki zautomatyzowanemu przechwytywaniu wideo i analizie za pomocą oprogramowania RflyDetection.
- Skalowalność: Przetwarza dane z setek much w jednym przebiegu, co zwiększa przepustowość i zmniejsza zmienność w porównaniu z analizami manualnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie translacyjne: Zapewnia system istotny z punktu widzenia choroby do oceny fenotypów lokomotorycznych, które odpowiadają klinicznym deficytom ruchu w zaburzeniach neurodegeneracyjnych.
- Ciągłość przedkliniczna: Umożliwia podłużną ocenę w różnych grupach wiekowych much (5, 15, 25, 35 dni) w celu modelowania postępującej neurodegeneracji.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę eksperymentów z ratowaniem genetycznym (np. koekspresja auxR/auxGFP) w celu walidacji specyficzności celu i zaangażowania szlaku sygnałowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum odkryć – od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego – oferując ilościowy punkt końcowy w zakresie zachowania, który łączy manipulacje genetyczne z wynikiem fenotypowym w modelach neurodegeneracji.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez powiązanie ekspresji genów (np. aux w neuronach dopaminergicznych) z funkcją lokomotoryczną za pomocą iteracyjnych pomiarów negatywnej geotaksji.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowane wyniki gotowe do analizy (dystans wspinaczki w ciągu 6 sekund), co umożliwia wiarygodne porównanie między różnymi warunkami doświadczalnymi.
- Analityka: Generuje dane w formie średniej ± SEM z zachowaniem rygoru statystycznego (jednoczynnikowa ANOVA, korekta Bonferroniego) w celu wsparcia porównań międzygrupowych i testowania istotności.
- Badania translacyjne: Łączy odczyty behawioralne z mechanizmami neurodegeneracyjnymi, wspierając ocenę fenotypową zorientowaną na biomarkery w modelach przedklinicznych.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do podłużnego przesiewania behawioralnego dla wielu genotypów, grup wiekowych i grup terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki ilościowemu, wysokorozdzielczemu fenotypowaniu behawioralnemu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację poprzez zautomatyzowaną synchronizację, rejestrację cyfrową oraz analizę opartą na oprogramowaniu.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność podejmowania decyzji go/no-go, umożliwiając szybką ocenę deficytów lokomotorycznych w dużych próbach badawczych.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o solidne dane dotyczące progresji fenotypowej zależnej od wieku.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z Drosophila, prowadzeniu krzyżówek genetycznych oraz konfiguracji testów behawioralnych.
- Zależność od specjalistycznej aparatury, w tym zautomatyzowanego urządzenia RING, sterownika stopniowego, kamery cyfrowej i odpowiedniego oświetlenia.
- Wymaga infrastruktury komputerowej do importu wideo, wyodrębniania klatek oraz obsługi oprogramowania RflyDetection.
- Obejmuje standaryzację warunków środowiskowych (25°C, 70% wilgotności, 12-godzinny cykl światła/ciemności) oraz protokoły przygotowania fiolek.
- Uwzględnia kwestie bezpieczeństwa związane z komponentami elektrycznymi; aparatura musi zostać zabezpieczona i sprawdzona przed uruchomieniem.
