Name: Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Poznaj metodę izolacji nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy do analizy ekspresji białek macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii przewodów. Technika wspiera badania rozwojowe i onkologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować April Wiles i Dr. Rogerowi Brodersonowi za pomoc w przeprowadzaniu sekcji zwłok zwierząt i izolacji gruczołów. Finansowanie tej pracy było wspierane przez Philadelphia College of Osteopathic Medicine Centers for Chronic Disorders of Aging.

Procedury z udziałem zwierząt w tym protokole zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Philadelphia College of Osteopathic Medicine, a wszystkie techniki były przeprowadzane zgodnie ze ścisłymi wytycznymi etycznymi.
1. Pobieranie i przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie zwierzę i umieść je w komorze CO2. Do tego eksperymentu użyj 8-10-tygodniowej samicy nieródyczki B6. Cg-CAV1TMIs/J oraz C57BI/6J.</li>
	<li>Włącz przepływ gazu do 30-40%. Gdy zwierzę jest widocznie nieprzytomne po około 2 minutach, otwórz zawór gazowy do pełnego ciśnienia na dodatkowe 5 minut. 
	UWAGA: Potwierdzić śmierć zwierzęcia, obserwując widoczne oznaki oddychania (np. ruch klatki piersiowej) przez okres 10 minut po zaprzestaniu dostarczania CO2 . Jeśli zwierzę nadal żyje, można je umieścić z powrotem w komorzeCO2. Można również zastosować zwichnięcie szyjki macicy, chociaż nie jest to zalecane, ponieważ wokół gruczołów sutkowych może gromadzić się krew, zakłócając rozwarstwienie i wyniki.</li>
	<li>Po złożeniu w ofierze przypiąć tuszę do pozycji leżącej na plecach i nasycić 70% etanolem.</li>
	<li>Uszczypnij skórę tuż nad łonem za pomocą kleszczy i naciąć małymi nożyczkami chirurgicznymi. Obracając nożyczki, przetnij skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej, przesuwając ogon do czaszki.</li>
	<li>Większymi nożyczkami lub hemostatem tępo obustronnie rozetnij powięź podskórną, uważając, aby nie przebić otrzewnej. Wytnij wzdłuż poziomych marginesów na obu dystalnych końcach nacięcia.</li>
	<li>Otwórz klapy futrzane i ponownie spryskaj 70% etanolem. 
	UWAGA: Chociaż zastosowanie 70% etanolu pozwoliło na lepsze wizualne rozróżnienie gruczołu od otaczającej tkanki podskórnej, należy uważać, aby uniknąć wysuszenia tkanki w wyniku stosowania tego roztworu. Aby uniknąć wysuszenia, usuń gruczoł w czasie nieprzekraczającym 4 minut. Jako alternatywę dla 70% etanolu, badacz może również zastąpić ogólny bufor izolacyjny, taki jak 1x PBS, aby uniknąć wysuszenia tkanek.</li>
	<li>Lokalizując interesujące Cię gruczoły sutkowe, przesuń ostrze skalpela #4 wzdłuż wewnętrznej strony płatów skóry, przecinając gruczoł sutkowy i związaną z nim tkankę tłuszczową skóry z dala od skóry właściwej. 
	UWAGA: 3,5-krotne mikrolupy chirurgiczne mogą pomóc w łatwiejszej wizualizacji gruczołów.</li>
	<li>Natychmiast zanurzyć nowo wyizolowany gruczoł w stożkowej probówce zawierającej 10:1 objętość roztworu-tkanki 10% neutralnej buforowanej formaliny przez 24-48 godzin 
	UWAGA: W zależności od celu badania, można zastosować wiele alternatywnych utrwalaczy, takich jak paraformaldehyd, etanol do badań genomicznych i dostępne na rynku konserwujące RNA.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instytucjonalnymi protokołami zatapiania parafiny, przesyłaj próbki do dostawcy w celu przetworzenia, zatopienia i krojenia/montażu szkiełkowego. Cięcie tkanek w temperaturze 5 μm. 
	UWAGA: Ze względu na nadmiar tkanki tłuszczowej otaczającej gruczoł rozważ usunięcie 100-200 μm tkanki przed cięciem i barwieniem.</li>
</ol>
2. Barwienie tkanek
<ol>
	<li>Immunohistochemia
	<ol>
		<li>Umieść szkiełka do barwienia na bloku grzewczym ustawionym na 58 °C na 1 godzinę, aby stopić parafinę. 
		UWAGA: Topniejący wosk parafinowy może spływać ze szkiełka. Uważnie monitoruj lub umieść chusteczkę pod szkiełkiem, aby uchwycić spływający wosk. 
		UWAGA: Ten krok nie jest konieczny i można go pominąć. Jeśli wyniki nie są zgodne z oczekiwaniami, dodanie tego kroku wstecz może poprawić wyniki.</li>
		<li>Inkubować szkiełka w słoiku zawierającym 100% ksylenu przez 30 minut, zapewniając całkowite zanurzenie. Powtórz raz. 
		UWAGA: W tym momencie należy przeprowadzić oględziny, aby upewnić się, że skrawki tkanek są wolne od tkanki tłuszczowej i parafiny. Jeśli widoczna jest dodatkowa tkanka tłuszczowa lub wosk, szkiełko należy ponownie zanurzyć w ksylenie. Należy zachować ostrożność, aby zminimalizować dodatkowe narażenie na ksylen, ponieważ może to spowodować kurczenie się tkanki.</li>
		<li>Nawadniaj tkanki w szkiełkowym słoiku zawierającym 100% etanolu przez 10 minut. Powtórz raz.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do słoika zawierającego 95% etanolu na 10 minut. Powtórz raz.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do słoika zawierającego 75% etanolu na 5 minut.</li>
		<li>Przenieś szkiełka do słoika zawierającego 50% etanolu na 5 minut.</li>
		<li>Zagotuj 10 mM roztworu cytrynianu sodu (pH 6,0) na płycie grzejnej lub w kuchence mikrofalowej i wlej do słoika Coplin. 
		UWAGA: Uważnie monitoruj roztwór podczas podgrzewania i uważaj, aby nie wykipić. Pojemnik będzie bardzo gorący. Używaj ochrony, aby uniknąć poparzeń.</li>
		<li>Powoli umieść szkiełka w słoiku Coplin, zapewniając całkowite zanurzenie, i inkubuj w temperaturze 100 °C przez 10 minut, aby pobrać epitopy. Wyjmij i ostrożnie osusz szkiełka.</li>
		<li>Narysuj barierę wokół tkanki za pomocą markera hydrofobowego. Dodać wystarczającą ilość endogennego blokera enzymów (nadtlenek wodoru i azydek sodu, dostępne w handlu), aby pokryć tkankę i inkubować przez 10 minut.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 10 min.</li>
		<li>Dodaj tyle 10% surowicy osła w 1x PBS, aby przykryć tkankę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. 
		UWAGA: W tym miejscu eksperyment można przerwać, przechowując szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze 4 °C przez noc. Chociaż stwierdzono, że surowica osła daje optymalne wyniki barwienia, badacz może chcieć przetestować różne surowice, takie jak albumina surowicy bydlęcej (BSA), surowica kozia lub surowica końska, aby określić optymalne wyniki. W przypadku stosowania BSA, badacz powinien przygotować go na świeżo przed użyciem.</li>
		<li>Zdekantować nadmiar blokera ze szkiełek i dodać odpowiednio rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe w 1% surowicy bezpośrednio do szkiełek, upewniając się, że tkanka jest równomiernie pokryta roztworem. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze. 
		UWAGA: Ten krok może być kontynuowany przez dłuższy czas w wilgotnej komorze przechowywanej w temperaturze 4 °C. Upewnij się, że na tym etapie dołączyłeś odpowiednie szkiełka kontroli ujemnej (np. szkiełko bez przeciwciała pierwszorzędowego, znaną tkankę antygenowo-ujemną itp.).</li>
		<li>Ostrożnie umyć szkiełka, przelewając około 1 ml diH2O na tkankę i inkubować w 1 zmianie 1x PBS przez 5 minut.</li>
		<li>Zdekantować nadmiar PBS i dodać tyle etykiety peroksydazy chrzanowej, aby pokryć tkankę i inkubować przez 30 minut w wilgotnej komorze. 
		UWAGA: Na tym etapie badacz może chcieć przejść do barwienia fluorescencyjnego przy użyciu fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał drugorzędowych. Jeśli jest to pożądane, kolejne opisane kroki powinny zostać odpowiednio zmodyfikowane.</li>
		<li>Ostrożnie umyć szkiełka, przelewając około 1 ml diH2O na tkankę i inkubować w 1 zmianie 1x PBS przez 5 minut.</li>
		<li>Przygotować roztwór diaminobenzydyny (DAB) plus chromogen zgodnie z sugerowanymi przez producenta proporcjami i wymieszać przez vortex. 
		UWAGA: Na rynku dostępnych jest wiele gotowych zestawów oprócz tego używanego w tym protokole.</li>
		<li>Zdekantować nadmiar buforu ze szkiełek i dodać 2-3 krople (10-50 μL) barwnika chromogenowego bezpośrednio do tkanek i inkubować przez 5 minut w wilgotnej komorze. Ostrożnie umyć szkiełka, przelewając około 1 ml diH2O na chusteczkę. 
		UWAGA: Chromogen DAB jest wysoce toksyczny. Unikać bezpośredniego kontaktu plamy ze skórą i zbierać spływ wraz z odpadami niebezpiecznymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hematoksylina i eozyna (H&E)
	<ol>
		<li>Po ostatnim płukaniu po inkubacji chromogenu, zanurz szkiełka w hematoksylinie Harrisa na 2-2,5 min. Delikatnie spłucz szkiełka pod bieżącą wodą przez 1-2 min. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie dopuścić do bezpośredniego strumienia wody na tkanki.</li>
		<li>Zanurz szkiełka na 2-3 s w roztworze różnicującym (0,25 ml kwasu solnego w 100 ml 70% etanolu). Szkiełka płuczemy delikatnie pod bieżącą wodą przez około 1-2 min.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w niebieskim środku (4,5 mg węglanu wapnia w 100 ml wody z kranu, pH dostosowane do 9,4) na 60 s. Płucz szkiełka w 95% etanolu przez 30 s.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w alkoholowej eozynie Y na 2-3 min.</li>
		<li>Odwodnić tkankę w 2 przemianach 95% etanolu przez 1 minutę każda.</li>
		<li>Odwodnić tkankę w 1 zmianie 100% etanolu przez 1 min.</li>
		<li>Ostrożnie osusz szkiełka niestrzępiącą się chusteczką. Nałożyć 1 kroplę (około 100-200 μl) syntetycznego, niewodnego podłoża montażowego na bazie żywicy, aby przesunąć i nałożyć szkiełko nakrywkowe. 
		UWAGA: Jeśli wybrano inną metodę barwienia, może być wymagane inne medium montażowe. Na przykład, jeśli badacz wybrał przeciwciało drugorzędowe sprzężone z fluorescencyjną, bardziej idealne byłoby mocowanie wodne.</li>
		<li>Pozostaw szkiełka do zastygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie czerwienią Picrosirius (PSR)
	<ol>
		<li>Wybierz szkiełka do barwienia i postępuj zgodnie z protokołem immunohistochemicznym do kroku 6 (moczenie w 50% etanolu).</li>
		<li>Zanurz szkiełka w bejcy PSR na 1 godzinę.</li>
		<li>Zanurz szkiełka w 0,5% kwasie octowym na 1-2 s, dwukrotnie, aby rozróżnić plamę.</li>
		<li>Odwodnić tkanki w 2 przemianach po 95% etanolu przez 1 minutę każda.</li>
		<li>Odwodnić tkanki w 1 zmianie 100% etanolu przez 1 min.</li>
		<li>Wyczyść szkiełka, zanurzając je na krótko w 100% ksylenie na około 3-4 s.</li>
		<li>Ostrożnie osusz szkiełka niestrzępiącą się chusteczką. Nałóż 1 kroplę (około 100-200 μl) syntetycznego, niewodnego podłoża montażowego na bazie żywicy, aby przesunąć i nałożyć szkiełko nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przykładowa analiza
<ol>
	<li>Analiza kanałowa
	<ol>
		<li>Wybierz szkiełka barwione na α-SMA. Używając mikroskopu świetlnego wyposażonego w obiektyw zamontowany na kamerze, zbierz reprezentatywne obrazy w 20-krotnym powiększeniu.</li>
		<li>Korzystając z ImageJ (NIH), rozróżnij i policz kanały na każdym obrazie. Można je wyliczyć ręcznie lub przypisać punktację numeryczną do poszczególnych kanałów. Aby przypisać wynik liczbowy, otwórz ImageJ i wybierz Wtyczki. Następnie wybierz Analizuj i wybierz Licznik komórek z menu rozwijanego. Kliknij przycisk Zainicjuj, a następnie podświetl opcję Typ 1, aby rozpocząć oznaczanie kanałów. Po zakończeniu wybierz pozycję Wyniki, aby wyświetlić liczbę kanałów kanałowych. 
		UWAGA: Zwróć uwagę, aby sprawdzić, czy struktury są przewodowe, a nie naczyniowe.</li>
		<li>W opcjach "Ustaw pomiar" zaznacz "Obwód" i "Obszar".</li>
		<li>Korzystając z narzędzia wielokąta odręcznego, narysuj linię wokół każdego kanału w komorze mioepitelialnej (widoczność wspomagana przez barwienie α-SMA). Wybierz opcję "Zmierz" i zapisz obwód i obszar.</li>
		<li>Ponownie za pomocą narzędzia wielokąta odręcznego narysuj linię wzdłuż wierzchołkowej strony nabłonka przewodowego we wnętrzu światła. Wybierz opcję "Zmierz" i zapisz obwód i obszar.</li>
		<li>Odejmij obwód przedziału świetlnego od obwodu przedziału mioepitelialnego, aby uzyskać obwód nabłonka przewodowego. Odejmij obszar przedziału świetlnego od obszaru przedziału mioepitelialnego, aby uzyskać obszar nabłonka przewodowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza immunohistochemiczna
	<ol>
		<li>Przesyłanie obrazów w jasnym polu do oprogramowania analitycznego, takiego jak ImageJ lub FIJI Suite. 
		UWAGA: W tym protokole opisano kroki analizy barwienia przy użyciu narzędzia ImageJ i wtyczki IHC Toolbox.</li>
		<li>Otwórz program IHC Toolbox z menu Plugin (Wtyczka). W otwartym polu rozwijanym "Wybierz model" wybierz odpowiednią bejcę (np. H-DAB, PSR itp.). Wybierz opcję "Kolor", aby odizolować plamę. Spowoduje to otwarcie okna wyników. 
		UWAGA: Ta metoda jest odpowiednia, jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania znajduje się w przestrzeniach zewnątrzkomórkowych lub cytozolowych lub jest związane z błoną plazmatyczną. Jeśli interesujące nas białko jest jądrowe, wybranie opcji "Jądra" skłoni wtyczkę do przeanalizowania obrazu pod kątem dodatnio wybarwionych jąder.</li>
		<li>Użyj suwaka wyboru koloru, aby zapewnić właściwą izolację plamy bez wtrącania tła lub nadmiernego wykluczania plam. 
		UWAGA: Jeśli tryb automatyczny nie jest w stanie wykryć plamy lub nie daje akceptowalnych obrazów, narysuj kwadratowy obszar zainteresowania (ROI) na zidentyfikowanym poplamionym obszarze. W oknie IHC Toolbox wybierz opcję "Trenuj", aby skierować wtyczkę do odpowiedniego celu.</li>
		<li>Przekonwertuj obraz na 16-bitowy. Przejdź do opcji Image → Type (Obraz) → 16 bit.</li>
		<li>Próg obrazu. Przejdź do opcji Image (Obraz) → Dostosuj → Auto Threshold (Automatyczny próg).</li>
		<li>Ustaw skalę pomiaru obrazu, rysując linię ROI bezpośrednio nad paskiem skali na obrazie, a następnie przypisując długość. Aby ustawić podziałkę liniową, przejdź do pozycji Analizuj → Ustaw skalę. Wprowadź liczbę pikseli na żądaną jednostkę długości (np. 120 pikseli na 50 μm).</li>
		<li>Zmierz wynikowy obszar i średnią wartość szarości. Przejdź do pozycji Analizuj → ustaw pomiary i zbierz pomiary, klikając przycisk Analizuj → zmierz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gao-Feng Xiong, R. X. <a target="_blank" href="http://jcmtjournal.com/article/view/1713">Function of cancer cell-derived extracellular matrix in tumor progression.</a> J Cancer Metastasis Treat. 2, 357-364 (2016).</li>
<li>Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microenvironment+in+breast+cancer+progression%3A+biology+and+implications+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 227(2011).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4 (1), 38(2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Cox, T. R., Erler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+and+homeostasis+of+the+extracellular+matrix%3A+implications+for+fibrotic+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: implications for fibrotic diseases and cancer.</a> Dis Model Mech. 4 (2), 165-178 (2011).</li>
<li>Ioachim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+of+extracellular+matrix+components+tenascin%2C+fibronectin%2C+collagen+type+IV+and+laminin+in+breast+cancer%3A+their+prognostic+value+and+role+in+tumour+invasion+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression of extracellular matrix components tenascin, fibronectin, collagen type IV and laminin in breast cancer: their prognostic value and role in tumour invasion and progression.</a> Eur J Cancer. 38 (18), 2362-2370 (2002).</li>
<li>Barkan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+growth+from+dormant+cells+induced+by+a+col-I-enriched+fibrotic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment.</a> Cancer Res. 70 (14), 5706-5716 (2010).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Wang, J. P., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin%3A+How+Its+Aberrant+Expression+in+Tumors+May+Improve+Therapeutic+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibronectin: How Its Aberrant Expression in Tumors May Improve Therapeutic Targeting.</a> J Cancer. 8 (4), 674-682 (2017).</li>
<li>Qian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+tumor%2Fstromal+caveolin-1+expression+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of tumor/stromal caveolin-1 expression in breast cancer patients.</a> Cancer Sci. 102 (8), 1590-1596 (2011).</li>
<li>Simpkins, S. A., Hanby, A. M., Holliday, D. L., Speirs, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+functional+significance+of+loss+of+caveolin-1+expression+in+breast+cancer-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and functional significance of loss of caveolin-1 expression in breast cancer-associated fibroblasts.</a> J Pathol. 227 (4), 490-498 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absence+of+stromal+caveolin-1+expression+predicts+early+tumor+recurrence+and+poor+clinical+outcome+in+human+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">An absence of stromal caveolin-1 expression predicts early tumor recurrence and poor clinical outcome in human breast cancers.</a> Am J Pathol. 174 (6), 2023-2034 (2009).</li>
<li>Macias, H., Hinck, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammary gland development.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (4), 533-557 (2012).</li>
<li>Caligioni, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+reproductive+status%2Fstages+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assessing reproductive status/stages in mice.</a> Curr Protoc Neurosci. , Appendix 4 Appendix 4I (2009).</li>
<li>Cannata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+circulating+IGF-I+promotes+mammary+gland+development+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Elevated circulating IGF-I promotes mammary gland development and proliferation.</a> Endocrinology. 151 (12), 5751-5761 (2010).</li>
<li>Thompson, C., Rahim, S., Arnold, J., Hielscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+caveolin-1+alters+extracellular+matrix+protein+expression+and+ductal+architecture+in+murine+mammary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Loss of caveolin-1 alters extracellular matrix protein expression and ductal architecture in murine mammary glands.</a> PLoS One. 12 (2), 0172067(2017).</li>
<li>Williams, C. M., Engler, A. J., Slone, R. D., Galante, L. L., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+expression+modulates+mammary+epithelial+cell+proliferation+during+acinar+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fibronectin expression modulates mammary epithelial cell proliferation during acinar differentiation.</a> Cancer Res. 68 (9), 3185-3192 (2008).</li>
<li>Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+for+localized+drug+delivery+to+the+mouse+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W artykule opisaliśmy technikę izolacji nienaruszonych mysich gruczołów sutkowych do dalszych analiz histologicznych ekspresji ECM i morfologii przewodowej. W odniesieniu do analiz morfologii przewodów, metodologia ta umożliwia szybkie badanie architektury przewodów na podstawie barwionych skrawków histologicznych. Inne metody analiz przewodowych polegają na wstrzykiwaniu barwników w celu umożliwienia wizualizacji drzewa kanałowego, co może być technicznie trudne i czasochłonne.
W przypadku ra...

Rak piersi charakteryzuje się znacznym stopniem zwłóknienia tkanek1,2,3,4. Ta niekomórkowa jednostka, określana jako ECM, znajduje się w różnym stopniu we wszystkich tkankach i składa się przede wszystkim ze złożonej siatki fibrylarnych i niefibrylarnych kolagenów, elastyny i glikoprotein, a także różnych cząsteczek sygnałowych, które są sekwestrowane w tej macierzy. W warunkach homeostatycznych osadzanie i degradacja ECM jest ściśle kontrolowane. 5 Podczas nowotworzenia piersi równowaga między odkładaniem się a degradacją ECM zostaje zaburzona. W związku z tym donoszono, że guzy piersi wykazują ekspresję obfitych białek ECM, takich jak między innymi kolageny, fibronektyna i tenascyna-C. 6 Udokumentowano, że nieprawidłowa ekspresja tych białek, w połączeniu ze zwiększonymi wzorcami sieciowania macierzy, sprzyja progresji guza piersi, przerzutom i oporności na terapię1,3,4,7,8,9.
Aby ocenić skład ECM i morfologię przewodową, przeprowadzono izolację nienaruszonych gruczołów sutkowych. W tym przypadku użyliśmy samic nieródek myszy z niedoborem kaweoliny-1, integralnego białka błonowego, które zostało powiązane z agresywnym guzem piersi signature10,11,12, i kontrolujemy samice nieródek B6. Przetwarzanie histologiczne i barwienie tych tkanek pozwoliło na identyfikację kilku białek ECM wraz z charakterystyką morfologii przewodów.
Ogólnie rzecz biorąc, izolacja całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych daje badaczom możliwość zbadania zmian morfologicznych lub komórkowych w całej tkance zachodzących w odpowiedzi na czynniki egzogenne lub endogenne. Wady tej techniki wiążą się z analizą dwuwymiarowych (2D) przekrojów tkanek w przeciwieństwie do perspektywy 3D, która dałaby pełniejszy obraz złożonej morfologii drzewa przewodowego. Biorąc pod uwagę złożoność interakcji komórka-komórka i komórka-ECM, które zachodzą w gruczole sutkowym, izolacja całych, nienaruszonych gruczołów jest korzystna dla efektywnej analizy morfologii przewodu i ekspresji białka w różnych regionach mysiego gruczołu sutkowego.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop świetlny</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Olympus</td><td>cellSens Oprogramowanie</td><td></td></tr><tr><td></td><td>wejściowe NIH</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>3.5x-R Mikro lupy chirurgiczne</td><td>Róża Micro Solutions</td><td></td><td>Powiększenie według preferencji badacza</td></tr><tr><td>Mayo Nożyczki</td><td>Medline</td><td>DYND04035</td><td></td></tr><tr><td>Stojak do barwienia</td><td>Fisher Scientific</td><td>121</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia</td><td>Fisher Scientific</td><td>112</td><td></td></tr><tr><td>Słoiki z kopliny</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-4</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe szklane</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Rozmiar odpowiedni do tkanki</td></tr><tr><td>IHC EnVision+ Kit (HRP, Mysz, DAB+)</td><td>Dako</td><td>K400611-2</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirius Red Kit</td><td>Abcam</td><td>AB150681</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna Y, alkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>Harris Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HHS16</td><td></td></tr><tr><td>Serum osła</td><td>EMD Millipore</td><td>S30</td><td></td></tr><tr><td>10% neutralna buforowana formalina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny, odczynnik klasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>etanol, 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td>odpowiedni do biologii molekularnej</td></tr> Sól fizjologiczna <tr><td>buforowana fosforanami, 1x</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Węglan wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202932</td><td></td></tr><tr><td>Permanent Podłoże montażowe</td><td>Dako</td><td>S1964</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka montażowa Eukitta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało fibronektyny</td><td>Abcam</td><td>AB23750</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Tenascyny-C</td><td>Abcam</td><td>AB108930</td><td></td></tr><tr><td>Alfa Przeciwciało aktynowe mięśni gładkich</td><td>Abcam</td><td>AB124964</td><td></td></tr><tr><td>Dako Envision Dual Link System HRP</td><td>Dako</td><td>Zobacz materiał K4065</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Isolation of Intact, Whole Mouse Mammary Glands for Analysis of Extracellular Matrix Expression and Gland Morphology

Celem tej procedury było pobranie #4 gruczołów sutkowych w jamie brzusznej od samic nieródek myszy w celu oceny ekspresji ECM i architektury przewodowej. W tym przypadku za pomocą nożyczek Mayo utworzono małą kieszeń pod skórą, co umożliwiło oddzielenie gruczołów w tkance podskórnej od leżącej pod nią otrzewnej. Wizualizacja gruczołów została wsparta dzięki zastosowaniu mikrolup chirurgicznych 3,5x-R. Futro było odwrócone i przypięte do tyłu, co pozwoliło na identyfikację nienaruszonych poduszek tłuszczowych sutka. Każdy z #4 gruczołów brzusznych został tępo wypreparowany, przesuwając ostrze skalpela na boki między warstwą podskórną a gruczołami. Bezpośrednio po pobraniu gruczoły umieszczono w 10% neutralnej buforowanej formalinie w celu późniejszego przetwarzania tkanek. Wycięcie całego gruczołu jest korzystne, ponieważ przede wszystkim eliminuje ryzyko wykluczenia ważnych interakcji obejmujących całą tkankę między komórkami nabłonka przewodowego a innymi populacjami komórek mikrośrodowiska, które mogłyby zostać pominięte w biopsji częściowej. Jedną z wad tej metodologii jest wykorzystanie seryjnych odcinków z tkanek stałych, co ogranicza analizy morfogenezy przewodów i ekspresji białek do dyskretnych lokalizacji w gruczole. W związku z tym zmiany w architekturze przewodowej i ekspresji białek w 3 wymiarach (3D) nie są łatwe do uzyskania. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta ma zastosowanie w badaniach wymagających całych, nienaruszonych mysich gruczołów sutkowych do dalszych badań, takich jak rozwojowa morfogeneza przewodów lub rak piersi.

Samice myszy posiadają 5 par gruczołów mlekowych. Dokładniej: jedną parę gruczołów szyjnych (#1), dwie pary gruczołów piersiowych (#2 i #3), jedną parę gruczołów brzusznych (#4) oraz 1 parę gruczołów pachwinowych (#5) (Rysunek 1A). W niniejszej procedurze wyizolowano gruczoły #4, ponieważ są one łatwo identyfikowalne. W niektórych przypadkach gruczoły #4 i #5 izolowano razem, gdy rozróżnienie między nimi było utrudnione. Aby wyizolować nienar...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

The goal of this procedure was to harvest the #4 abdominal mammary glands from female nulliparous mice in order to assess ECM expression and ductal ...

Ogólnym celem całej tej techniki pobierania gruczołów sutkowych jest ułatwienie analizy histologicznej prezentacji tkanki sutka z nienaruszonego gruczołu ex vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, takie jak to, w jaki sposób tkanka zrębu jest przebudowywana w guzach lub jak nieprawidłowa ekspresja genów lub białek zmienia architekturę przewodu sutkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala naukowcom na scharakteryzowanie i ilościowe określenie ekspresji białek i architektury przewodowej w całych gruczołach sutkowych zdrowych i chorych myszy.Tę technikę zademonstruje Chris Thompson, doktorant w moim laboratorium. Po złożeniu w ofierze od ośmiu do 10 tygodni samic nieródek myszy zgodnie z protokołem tekstowym, przypnij tuszę do pozycji leżącej na plecach i użyj 70% etanolu do jej nasycenia. Użyj kleszczy, aby uszczypnąć skórę tuż nad łonem i naciąć ją małymi nożyczkami chirurgicznymi.Następnie, obracając nożyczki, przetnij skórę wzdłuż brzusznej linii środkowej, przesuwając ogonową do czaszkowej. Większymi nożyczkami lub hemostatem tępo obustronnie rozetnij powięź podskórną, uważając, aby nie przebić otrzewnej. Wytnij w

isolation-intact-whole-mouse-mammary-glands-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ta metoda opisuje sposób preparowania oraz oceny rozwoju i funkcji gruczołów mlekowych u myszy. Wycięte gruczoły mlekowe oceniane są pod kątem stopnia rozwoju za pomocą metody całego preparatu (whole mount), natomiast wydzielanie mleka jest oceniane przy użyciu testu skurczu komórek mioepitelialnych indukowanego oksytocyną.

Ocena rozwoju i funkcji gruczołu mlekowego w modelach mysich

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Protokół immunofluorescencji pośredniej opisany w tym artykule pozwala na wykrywanie i lokalizację białek w gruczole sutkowym myszy. Podano kompletną metodę przygotowania próbek gruczołu mlecznego, przeprowadzenia immunohistochemii, obrazowania skrawków tkanek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej oraz rekonstrukcji obrazów.

Immunofluorescencja pośrednia na zamrożonych odcinkach mysiego gruczołu sutkowego

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Rozwój gruczołu sutkowego u gryzonia był zazwyczaj oceniany za pomocą ocen opisowych lub poprzez pomiar podstawowych cech fizycznych. Gęstość rozgałęzień jest wskaźnikiem rozwoju sutka, który jest trudny do obiektywnego oszacowania. Protokół ten opisuje wiarygodną metodę ilościowej oceny charakterystyki rozgałęzień gruczołu mlekowego.

Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

Opracowaliśmy metodę skutecznego usuwania, przetwarzania, cięcia i barwienia, w celu oceny histopatologicznej, tkanki sutka, która pierwotnie była utrwalona na szkiełkach jako całe wierzchowce. Metoda ta może sprzyjać gromadzeniu i ocenie całych wierzchowców gruczołu mlekowego w badaniach wytycznych dotyczących badań reprodukcyjnych i rozwojowych.

Cięcie gruczołu sutkowego w całości w celu identyfikacji zmian chorobowych

Gruczoł sutkowy to dwuwarstwowa struktura, składająca się z zewnętrznych komórek nabłonka mięśniowego i wewnętrznego nabłonka światła. Przedstawiono protokół otrzymywania organoidów z wykorzystaniem trypsynizacji różnicowej. Ta skuteczna metoda pozwala naukowcom oddzielnie manipulować tymi dwoma typami komórek w celu zbadania pytań dotyczących ich roli w formie i funkcji gruczołu sutkowego.

Wytwarzanie organoidów mozaikowych sutków przez trypsynizację różnicową

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Ten protokół omawia podejście do generowania organoidów nabłonkowych z pierwotnej normalnej i nowotworowej tkanki sutkowej poprzez wirowanie różnicowe. Ponadto dołączono instrukcje dotyczące trójwymiarowej hodowli, a także obrazowania immunofluorescencyjnego osadzonych organoidów.

Generowanie i obrazowanie organoidów nabłonkowych myszy i ludzi z normalnej i nowotworowej tkanki sutka bez pasażowania

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

Poznaj metodę izolacji nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy do analizy ekspresji białek macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii przewodów. Technika wspiera badania rozwojowe i onkologiczne.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Przeglądaj więcej filmów