Name: Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium z makrofagów przy użyciu biotyny i streptawidyny. Technika ta umożliwia badanie dojrzewania fagosomów i przetwarzania antygenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania w laboratorium Robinsona są wspierane przez fundusze z Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases, University of Cologne, Germany (CECAD; finansowane przez DFG w ramach Inicjatywy Doskonałości niemieckiego rządu federalnego i krajów związkowych) oraz granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune i Fundacji Maria-Pesch Uniwersytetu w Kolonii, Niemcy.

Wszystkie kroki związane z użyciem patogennego S. typhimurium muszą być przeprowadzone w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego BSL-2 lub wyższym. Posiew i powlekanie S. Typhimurium, a także zakażenie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) muszą być przeprowadzane pod kapturem z przepływem laminarnym, aby zapobiec zakażeniu. Izolację fagosomów zawierających S. typhimurium można przeprowadzić na dowolnym stanowisku laboratoryjnym BSL-2.
Ekstrakcja szpiku kostnego od myszy w celu jego rozróżnicowania na makrofagi została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt i zatwierdzona przez Krajową Agencję ds. Przyrody, Środowiska i Ochrony Konsumentów Nadrenii Północnej-Westfalii [Landesamt für Natur, Umwelt and Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen; Nr pliku: 84-02.05.40.14.082 i 84-02.04.2015.A443] oraz Uniwersytet w Kolonii.
1. Hodowla S. typhimurium
<ol>
	<li>Zaszczepić S. typhimurium (szczep SL1344) z pojedynczej kolonii bakteryjnej w 5 ml bulionu z naparu do serca (BHI) za pomocą pętli bakteryjnej.</li>
	<li>Zawiesinę bakteryjną inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając.</li>
	<li>Następnego dnia przenieść 1 ml zawiesiny bakteryjnej do 19 ml bulionu BHI w kolbie stożkowej i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wytrząsaniem.</li>
	<li>Monitorować wzrost S. typhimurium, mierząc gęstość optyczną (OD) przy 600 nm (OD600) za pomocą spektrofotometru. Pomiary należy wykonywać co około 30 minut.</li>
	<li>Gdy OD600 osiągnie 1,0, usuń zawiesinę bakteryjną z inkubatora i przenieś do probówki o pojemności 50 ml. Odwirować bakterie przy 5 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
	<li>Wirować przy 5 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić bakterie w 4,9 ml sterylnego PBS.</li>
</ol>
2. Powlekanie S. typhimurium koralikami magnetycznymi sprzężonymi z NHS-Biotyną/Streptawidyną
<ol>
	<li>Dodać 100 μl 10 mg/ml roztworu łączącego biotynę (NHS-Biotyna rozpuszczona w dimetylosulfotlenku, DMSO) świeżo przygotowanego do zawiesiny bakteryjnej przygotowanej w poprzednim kroku. Na przykład rozcieńczyć 5 mg NHS-Biotyny w 0,5 ml sterylnego DMSO. Dokładnie wymieszaj, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Podziel mieszaninę na pięć probówek o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) na termobloku ze stałym wytrząsaniem przy 350 obr./min.</li>
	<li>Probówki odwirowywać przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić ponownie w 1 ml sterylnego PBS, odwirować przy 15 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
	<li>Powtórz krok 2.5 jeszcze dwa razy, aby całkowicie usunąć nadmiar roztworu łączącego biotynę.</li>
	<li>Po ostatnim praniu ponownie zawiesić osad w 1 ml jałowego PBS.</li>
	<li>Przenieś 100 μl roztworu kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną o stwortagidynie do probówki o pojemności 1,5 ml i pozostaw na stojaku magnetycznym na 5 minut.</li>
	<li>Usunąć rozpuszczalnik pipetą, pobrać roztwór kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną ze stojaka magnetycznego i ponownie zawiesić go z 1 ml zawiesiny bakteryjnej pokrytej biotyną, przygotowanej w kroku 2.7.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na termobloku ze stałym wytrząsaniem przy 350 obr./min.</li>
	<li>Umieść roztwór na stojaku magnetycznym, odczekaj 5 minut, a następnie usuń pipetą bakterie, które nie przylgnęły do ścianki (przechowuj ją w probówce oznaczonej jako "bakterie niepowlekane"). Frakcja przylegająca do ścianki rurki w kontakcie z magnesem to bakterie pokryte biotyną/streptawidyną.</li>
	<li>Wyjmij probówkę zawierającą oznakowane bakterie ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś w 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Umieść go ponownie na stojaku magnetycznym, odczekaj 5 minut i użyj pipety, aby usunąć PBS.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.13 i 2.14 jeszcze dwa razy, aby usunąć wszystkie bakterie, które nie są pokryte kulkami magnetycznymi sprzężonymi ze streptawidyną.</li>
	<li>Po ostatnim praniu ponownie wymieszaj powleczone bakterie w 500 μl sterylnego PBS i oznacz probówkę jako "bakterie powlekane".</li>
	<li>Policz jednostki tworzące kolonie (jtk) zarówno w roztworach "bakterii niepowlekanych", jak i "bakterii powlekanych", posiewając seryjne rozcieńczenia na płytkach agarowych BHI. Około 2 x 108 jtk/ml bakterii powlekanych otrzymuje się z 20 ml początkowej zawiesiny bakteryjnej o OD600 1,0. Zawiesinę bakteryjną w temperaturze 4 °C należy przechowywać do użycia następnego dnia w celu zakażenia makrofagów.</li>
</ol>
3. Zakażenie BDMD
<ol>
	<li>W tym samym dniu, w którym bakterie są pokryte kulkami magnetycznymi sprzężonymi z biotyną i streptawidyną, należy całkowicie ułożyć zróżnicowane BMDMs22 w 6 cm szalkach o gęstości 5 x 106 komórek na szalkę.</li>
	<li>Następnego dnia odwirować powleczoną zawiesinę bakteryjną o sile 15 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) o stężeniu 10 x10,6 jtk/ml.</li>
	<li>Aby zainfekować makrofagi przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10, należy usunąć pożywkę z BMDM i dodać 5 ml przygotowanej zawiesiny bakteryjnej. Optymalny MOI można ocenić dla każdego typu komórki lub celu eksperymentalnego izolowanych fagosomów.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zsynchronizować fagocytozę.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% stężeniemCO2 przez 30 minut w celu zainicjowania fagocytozy. Inne typy komórek mogą wymagać różnych czasów inkubacji, aby zapewnić internalizację bakterii.</li>
	<li>Usuń pożywkę zawierającą bakterie z naczyń i umyj komórki trzykrotnie RPMI, aby usunąć niezinternalizowane bakterie.</li>
	<li>Na koniec dodaj 10 ml RPMI zawierającego 10% FBS i 50 μg/ml gentamycyny, aby zabić wszelkie niefagocytowane bakterie.</li>
	<li>Inkubować zakażone BMDM w temperaturze 37 °C z 5% CO2 do pożądanego punktu czasowego. Pożądany punkt czasowy musi zostać wyznaczony doświadczalnie zgodnie z użytymi bakteriami i typem komórek oraz celem analizy. Do badania wczesnych zdarzeń fuzji fagosomu z endosomem w BMDM zakażonych S. Typhimurium zaleca się 30-minutową inkubację. W celu analizy późniejszych zdarzeń fagosomy można wyekstrahować po 2 godzinach lub 4 godzinach inkubacji. Przedłużająca się inkubacja makrofagów z S. Typhimurium powyżej 24 godzin powoduje śmierć makrofagów. Przedłużająca się infekcja wewnątrzkomórkowa przed ekstrakcją fagosomu może prawdopodobnie prowadzić do degradacji cząsteczek biotyny. Jednak nie zaobserwowaliśmy utraty biotyny na bakteriach powlekanych do 24 godzin.</li>
</ol>
4. Izolacja fagosomów zawierających S. typhimurium
<ol>
	<li>Przygotować objętość wymaganego buforu izolacyjnego fagosomów A (50 mM PIPES, pH.7, 50 mM MgCl2, 5 mM EGTA) przez dodanie ditiotreitolu (DTT) do końcowego stężenia 1 mM, cytochalazyny B do końcowego stężenia 10 μM oraz inhibitorów proteazy i fosfatazy zgodnie z zaleceniami producenta. 
	UWAGA: DTT i cytochalazynę B należy dodawać do buforu izolacyjnego fagosomu A zawsze bezpośrednio przed użyciem. Cytochalazyna B rozrywa cytoszkielet, ułatwiając pęknięcie błony komórkowej.</li>
	<li>W pożądanym momencie usuń pożywkę z zainfekowanych komórek i przemyj sterylnym PBS podgrzanym do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 750 μl buforu izolacyjnego fagosomu A na talerz i inkubować 20 minut na lodzie. W przypadku stosowania różnych numerów komórek, objętość bufora izolacyjnego A powinna być dostosowana proporcjonalnie.</li>
	<li>Dodać 250 μl buforu izolacyjnego fagosomu B (50 mM RURY, pH 7, 50 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 220 mM mannitol i 68 mM sacharozy). Rozbujaj talerz, aby upewnić się, że bufor dotrze do całej powierzchni naczynia. W przypadku stosowania różnych numerów komórek, objętość bufora izolacyjnego B powinna być dostosowana proporcjonalnie.</li>
	<li>Usuń komórki z naczynia, delikatnie zeskrobując je za pomocą gumowego policjanta i przenieś je do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez igłę 26G za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml co najmniej 15 razy (jedna aspiracja plus jeden wyrzut zawiesiny komórek liczy się jako jeden raz). To wystarczy, aby uwolnić cytozolową zawartość BMDM. Liczba przejść przez igłę musi być zoptymalizowana dla każdego typu komórki.</li>
	<li>Umieść zawieszenie ogniw na stojaku magnetycznym i odczekaj 5 minut. Cząstki przyczepione do magnesu to fagosomy zawierające powlekany S. Typhimurium. Zawiesina zawiera pozostałe składniki komórkowe.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml oznaczonej jako "cytozol".</li>
	<li>Wyjmij probówkę z wyizolowanymi fagosomami ze stojaka magnetycznego i umieść je ponownie w 1 ml sterylnego PBS.</li>
	<li>Umieść zawiesinę fagosomu na stojaku magnetycznym, odczekaj 5 minut i wyjmij PBS.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 4.9 i 4.10 w celu umycia wyizolowanych fagosomów zawierających S. typhimurium.</li>
	<li>Na koniec usunąć PBS i ponownie zawiesić fagosomy w wymaganym buforze, na przykład w buforze do testu radioimmunoprecypitacyjnego (RIPA) do analizy białek. Zgodnie z tym protokołem uzyskuje się około 50-200 μg białka na próbkę, w zależności od początkowej liczby komórek i MOI infekcji.</li>
</ol>

<ol><li>Freeman, S. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+receptors%2C+signal+integration%2C+and+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: receptors, signal integration, and the cytoskeleton.</a> Immunol Rev. 262 (1), 193-215 (2014).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 9 (10), 781-795 (2008).</li>
<li>Lafourcade, C., Sobo, K., Kieffer-Jaquinod, S., Garin, J., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+V-ATPase+along+the+Endocytic+Pathway+Occurs+through+Reversible+Subunit+Association+and+Membrane+Localization%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of the V-ATPase along the Endocytic Pathway Occurs through Reversible Subunit Association and Membrane Localization.</a> Plos One. 3 (7), e2758(2008).</li>
<li>Forgac, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuolar+ATPases%3A+rotary+proton+pumps+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Vacuolar ATPases: rotary proton pumps in physiology and pathophysiology.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 8 (11), 917-929 (2007).</li>
<li>Marshansky, V., Futai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-type+H%2B-ATPase+in+vesicular+trafficking%3A+targeting%2C+regulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).</li>
<li>Ullrich, H. J., Beatty, W. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+delivery+of+procathepsin+D+to+phagosomes%3A+Implications+for+phagosome+biogenesis+and+parasitism+by+Mycobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct delivery of procathepsin D to phagosomes: Implications for phagosome biogenesis and parasitism by Mycobacterium.</a> Eur J Cell Biol. 78 (10), 739-748 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+Physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: Physiology and pathophysiology.</a> Physiol Rev. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagosome%3A+Compartment+with+a+license+to+kill%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The phagosome: Compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8 (4), 311-330 (2007).</li>
<li>Scott, C. C., Botelho, R. J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+A+few+bugs+in+the+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membrane+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: A few bugs in the system.</a> J Membrane Biol. 193 (3), 137-152 (2003).</li>
<li>Turk, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+cathepsins%3A+From+structure%2C+function+and+regulation+to+new+frontiers%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Proteins+Proteom%22%5BJournal%5D)">Cysteine cathepsins: From structure, function and regulation to new frontiers.</a> Bba-Proteins Proteom. 1824 (1), 68-88 (2012).</li>
<li>Ramachandra, L., Song, R., Harding, C. V. <a target="_blank" href="http://serials.unibo.it/cgi-ser/start/en/spogli/df-s.tcl?prog_art=5883500">Class II MHC molecules and peptide complexes appear in phagosomes during phagocytic antigen processing.</a> Faseb J. 12 (4), A589-A589 (1998).</li>
<li>Robinson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterial+Phenolic+Glycolipid+Inhibits+Phagosome+Maturation+and+Subverts+the+Pro-inflammatory+Cytokine+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Mycobacterial Phenolic Glycolipid Inhibits Phagosome Maturation and Subverts the Pro-inflammatory Cytokine Response.</a> Traffic. 9 (11), 1936-1947 (2008).</li>
<li>Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+and+Legionella+pneumophila+phagosomes+exhibit+arrested+maturation+despite+acquisition+of+Rab7%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis and Legionella pneumophila phagosomes exhibit arrested maturation despite acquisition of Rab7.</a> Infect Immun. 68 (9), 5154-5166 (2000).</li>
<li>Smith, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+distinct+phospholipases+C+of+Listeria+monocytogenes+have+overlapping+roles+in+escape+from+a+vacuole+and+cell-to-cell+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The two distinct phospholipases C of Listeria monocytogenes have overlapping roles in escape from a vacuole and cell-to-cell spread.</a> Infect Immun. 63 (11), 4231-4237 (1995).</li>
<li>Woolard, M. D., Frelinger, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outsmarting+the+host%3A+bacteria+modulating+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response.</a> Immunol Res. 41 (3), 188-202 (2008).</li>
<li>Gallois, A., Klein, J. R., Allen, L. A. H., Jones, B. D., Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+pathogenicity+island+2-encoded+type+III+secretion+system+mediates+exclusion+of+NADPH+oxidase+assembly+from+the+phagosomal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Salmonella pathogenicity island 2-encoded type III secretion system mediates exclusion of NADPH oxidase assembly from the phagosomal membrane.</a> J Immunol. 166 (9), 5741-5748 (2001).</li>
<li>Ohl, M. E., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella%3A+A+model+for+bacterial+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Salmonella: A model for bacterial pathogenesis.</a> Annu Rev Med. 52, 259-274 (2001).</li>
<li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages%3A+Y-pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y-pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur J Cell Biol. 77 (1), 35-47 (1998).</li>
<li>Buchmeier, N. A., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Macrophage+Phagosome-Lysosome+Fusion+by+Salmonella-Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Macrophage Phagosome-Lysosome Fusion by Salmonella-Typhimurium.</a> Infect Immun. 59 (7), 2232-2238 (1991).</li>
<li>Luhrmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22 (4), 329-341 (2000).</li>
<li>Steinhauser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-labeling+facilitates+a+novel+magnetic+isolation+procedure+to+characterize+pathogen-containing+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Lipid-labeling facilitates a novel magnetic isolation procedure to characterize pathogen-containing phagosomes.</a> Traffic. 14 (3), 321-336 (2013).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Detilleux, P. G., Deyoe, B. L., Cheville, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+intracellular+localization+of+Brucella+spp.+in+Vero+cells%3A+fluorescence+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Pathol%22%5BJournal%5D)">Entry and intracellular localization of Brucella spp. in Vero cells: fluorescence and electron microscopy.</a> Vet Pathol. 27 (5), 317-328 (1990).</li>
<li>Arenas, G. N., Staskevich, A. S., Aballay, A., Mayorga, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+trafficking+of+Brucella+abortus+in+J774+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Intracellular trafficking of Brucella abortus in J774 macrophages.</a> Infect Immun. 68 (7), 4255-4263 (2000).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).</li>
<li>Li, Q., Jagannath, C., Rao, P. K., Singh, C. R., Lostumbo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+phagosomal+proteomes%3A+from+latex-bead+to+bacterial+phagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of phagosomal proteomes: from latex-bead to bacterial phagosomes.</a> Proteomics. 10 (22), 4098-4116 (2010).</li>
<li>Rao, P. K., Singh, C. R., Jagannath, C., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+approach+to+study+the+phagosomal+proteome+modulated+by+mycobacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Clin+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">A systems biology approach to study the phagosomal proteome modulated by mycobacterial infections.</a> Int J Clin Exp Med. 2 (3), 233-247 (2009).</li>
<li>Rogers, L. D., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+phagosomal+proteome+and+the+contribution+of+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum.</a> P Natl Acad Sci USA. 104 (47), 18520-18525 (2007).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowa metoda izolacji fagosomów zawierających S. typhimurium poprzez powlekanie bakterii biotyną i kulkami magnetycznymi sprzężonymi ze streptawidyną opisano tutaj. Po delikatnym przerwaniu błony komórkowej fagosomy zawierające bakterie można łatwo wyekstrahować za pomocą stojaka magnetycznego. Pokazujemy, że znakowanie bakterii zachowuje zdolność patogenu do wywoływania stanu zapalnego i nie zmienia właściwości fagocytarnych komórki gospodarza. Co ważne, fagosomy uzyskane tą metodą są wzbogacone w bakte...

Makrofagi krążą wyspecjalizowane komórki fagocytarne, które wykrywają, pochłaniają i degradują wszelkie obce cząsteczki obecne w tkankach obwodowych, począwszy od komórek apoptotycznych po atakujące mikroorganizmy, takie jak bakterie. Po rozpoznaniu za pośrednictwem receptora powierzchniowego markerów specyficznych dla patogenu powszechnie obecnych na powierzchni mikroorganizmów (znanych jako wzorce molekularne związane z patogenem lub PAMP), makrofagi inicjują złożoną reorganizację błony komórkowej w celu otoczenia i fagocytyzacji patogenu1.
Pochłonięty patogen jest następnie zatrzymywany przez makrofagi w wewnątrzkomórkowym pęcherzyku znanym jako fagosom. Poprzez serię zdarzeń fuzji i rozszczepienia z innymi pęcherzykami, takimi jak endosomy i lizosomy, fagosom zawierający patogen uzyskuje zestaw białek wymaganych do eliminacji zawartości fagosomalnej. Dlatego skład enzymatyczny fagosomu jest bardzo zmienny w trakcie tego procesu, znanego jako dojrzewanie fagosomu2.
Krótko po fagocytozie, multimeryczny kompleks wakuolarny ATPaza (v-ATPaza) jest włączany do błony fagosomu poprzez fuzję z endosomami3. Kompleks ten wykorzystuje ATP do pompowania protonów z cytozolu do światła fagosomu4. Zakwaszenie fagosomu jest niezbędne do fuzji z innymi pęcherzykami5 oraz do aktywacji dużej liczby enzymów degradacyjnych zależnych od pH6. Innym multimerycznym kompleksem enzymatycznym, który szybko gromadzi się na błonie fagosomu, jest kompleks oksydazy NADPH (NOX). Kompleks NOX utlenia NADPH w celu wytworzenia reaktywnych form tlenu (ROS), które są wydzielane do światła fagosomu i które znacząco przyczyniają się do zabijania pochłoniętych mikroorganizmów7.
Podczas początkowych etapów dojrzewania, fagosomy prezentują zazwyczaj takie markery, jak Rab5 i Rab7 odpowiednio wczesnych i późnych endosomów, wraz z podjednostką V0 klasy v-ATPase<sup="xref">8. Fuzja fagosomów z lizosomami i późnymi endosomami powoduje ekspozycję fagocytyzowanego patogenu na szeroką gamę enzymów hydrolitycznych, takich jak proteazy katepsynowe, lipazy i β-galaktozydaza9. Zakwaszenie światła jest również wymagane do aktywacji tych enzymów. Na przykład rozszczepienie katepsyny D w celu wytworzenia aktywnej krótkiej formy jest zależne od pH10. Enzymy te degradują patogen i pośredniczą w wytwarzaniu krótkich peptydów pochodzących z patogenów, które są prezentowane przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej makrofagów (MHC) klasy II limfocytom T w celu wywołania adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej11.
Stąd dojrzewanie fagosomu jest kluczowe dla wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i łączy wrodzone i adaptacyjne ramię układu odpornościowego. Nie jest niespodzianką, że patogeny wyewoluowały strategie przezwyciężania eliminacji przez makrofagi poprzez opisany powyżej proces dojrzewania fagosomów. Na przykład wewnątrzkomórkowe bakterie Mycobacterium tuberculosis i Legionella pneumophila zapobiegają dojrzewaniu fagosomów poprzez hamowanie składania v-ATPazy i w konsekwencji zakwaszenie światła12,13. Inne bakterie, takie jak Listeria monocytogenes lub Shigella flexneri, indukują tworzenie porów w błonie fagosomu, aby uciec do cytozolu14,15. Z drugiej strony, Salmonella enterica serowar typhimurium (S. typhimurium) jest w stanie modyfikować właściwości fagosomu w wakuoli, aby przekształcić go w odpowiednie miejsce do jego replikacji16. Ta zdolność sprawia, że S. typhimurium jest bardzo interesującym modelem do badania interferencji dojrzewania fagosomów za pośrednictwem patogenów.
S. typhimurium to fakultatywna bakteria wewnątrzkomórkowa, która powoduje zapalenie żołądka i jelit u ludzi. Po inwazji blaszki właściwej, bakterie S. Typhimurium są szybko wykrywane i fagocytowane przez makrofagi i zawarte w fagosomach17. Niektóre doniesienia opisywały wcześniej, że fagosomy zawierające S. typhimurium są twórcami zarówno endosomów, jak i lizosomów18, a inne badania wykazały, że fuzja fagosomu i lizosomu została zapobieżona po zakażeniu S. Typhimurium19.
Początkowo, dojrzewanie fagosomu po zakażeniu S. typhimurium było badane za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Opracowanie technik izolacji fagosomów zawierających bakterie umożliwiło dokładniejsze badanie zawartości fagosomów pod kątem markerów endosomów i lizosomów. Do tej pory główną metodą stosowaną do izolacji fagosomów zawierających bakterie jest frakcjonowanie subkomórkowe na gradientach krokowych sacharozy18,20. Jednak metoda ta wymaga wielu etapów wirowania, które mogą powodować mechaniczne uszkodzenia fagosomów, mogą wpływać na stabilność składników fagosomalnych (białek i lipidów) i są czasochłonne. Co więcej, wymaga użycia ultrawirówki: specjalistycznego sprzętu, który nie jest dostępny dla każdego laboratorium.
Ostatnio zastosowano nowe podejście do izolacji fagosomów zawierających bakterie, w których patogeny bakteryjne są znakowane biotynylowanym lipopetydem (Lipobiotin), a następnie ekstrahowane za pomocą sprzężonych ze streptawidyną kulek magnetycznych21. Proponujemy alternatywną metodę uzupełniającą polegającą na znakowaniu powierzchniowych makrocząsteczek bakterii zawierających aminy za pomocą NHS-Biotyny, a następnie kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną. Fagosomy otrzymane tą metodą są wysoko wzbogacone w markery endosomów i lizosomów i mogą być stosowane w szerokim zakresie testów, od analizy białek po analizę omiczną. Dodatkowo nie wymaga specjalistycznego sprzętu takiego jak ultrawirówki. Co więcej, eliminując etapy wirowania, znacznie zmniejsza się zarówno mechaniczne uszkodzenia fagosomów, jak i ilość poświęconego czasu. Metodę tę można łatwo dostosować do izolacji fagosomów zawierających inne bakterie, takie jak Gram-dodatni Staphylococcus aureus, również uwzględniony w tym manuskrypcie. Podsumowując, ta metoda izolacji fagosomów zawierających S. typhimurium jest prosta, opłacalna i mniej czasochłonna niż klasyczna izolacja za pomocą ultrawirowania w gradinie sacharozy, co pozwala uzyskać wysoce wzbogacone fagosomy zawierające bakterie.

<table><tbody><tr><td>EZ-Link NHS Biotyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>FluidMag Streptawidyna</td><td>Chemicell</td><td>4205</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Carl Roth</td><td>9156.2</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>A537.4</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.3</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Carl Roth</td><td>4175.1</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy i fosfataz Halt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1861280</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalazyna B</td><td>Sigma</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>DYNAL lub DynaMag Magnes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec 3000 Spektrofotometr</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2501</td><td></td></tr><tr><td>Pętla bakteryjna (10&micro; l)</td> <td>Sarstedt</td><td>86.1562.010</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella enterica serowar Typhimurium SL1344</td><td>Instytut Leibniza DSMZ-Niemiecka kolekcja mikroorganizmów i kultur</td><td></td><td></td>komórkowych</tr><tr><td>RPMI</td><td>Biochrom</td><td>FG1415</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-streptawidyna</td><td>Invitrogen</td><td>SA1011</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-beta-aktyny</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mCherry</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-34974</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Rab5</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46692</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Rab7</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-10764</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-v-ATPazy (V0)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-28801</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-V-ATPazy (V1)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-20943</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-katepsyny D</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6486</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-Tomm20</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-17764</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-kalneksyna</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-46669</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-GAPDH</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-20357</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

izolacja fagosomów zawierających salmonella typhimurium od makrofagów

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium to fakultatywna bakteria wewnątrzkomórkowa, która powoduje zapalenie żołądka i jelit u ludzi. Po inwazji blaszki właściwej bakterie S. typhimurium są szybko wykrywane i fagocytowane przez makrofagi oraz umieszczane w pęcherzykach zwanych fagosomami w celu degradacji. Izolacja fagosomów zawierających S. typhimurium jest szeroko stosowana do badania, w jaki sposób zakażenie S. typhimurium zmienia proces dojrzewania fagosomu, aby zapobiec degradacji bakterii. Klasycznie izolację fagosomów zawierających bakterie przeprowadzono przez wirowanie w gradionym tempie sacharozy. Proces ten jest jednak czasochłonny i wymaga specjalistycznego sprzętu oraz pewnego stopnia zręczności. Opisana tutaj jest prosta i szybka metoda izolacji fagosomów zawierających S. typhimurium z makrofagów poprzez pokrycie bakterii kulkami magnetycznymi sprzężonymi z biotyną i streptawidyną. Fagosomy uzyskane tą metodą można zawiesić w dowolnym buforze, co pozwala na wykorzystanie izolowanych fagosomów do szerokiego zakresu testów, takich jak analiza białek, metabolitów i lipidów. Podsumowując, ta metoda izolacji fagosomów zawierających S. typhimurium jest specyficzna, wydajna, szybka, wymaga minimalnego sprzętu i jest bardziej wszechstronna niż klasyczna metoda izolacji przez ultrawirowanie w gradinie sacharozy.

Izolacja fagozomów zawierających bakterie zgodnie z niniejszym protokołem wymaga w pierwszym kroku biotynylacji bakterii. W związku z tym oceniono skuteczność biotynylacji S. typhimurium poprzez analizę mikroskopową konfokalną BMDM zainfekowanych biotynylowanym mCherry-S. typhimurium i znakowanych Cy5-Streptawidyną. W skrócie, BMDM zainfekowano zgodnie z opisem w niniejszym protokole mCherry-S. typhimurium, który został uprzednio podda...

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów poprzez pokrycie bakterii biotyną i streptawidyną.

Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie nienaruszonych i wzbogaconych bakterii zawierających fagosomy. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak zmiany w dojrzewaniu fagosomów i przetwarzaniu antygenu, gdy drobnoustroje chorobotwórcze atakują komórki gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza wysokiej jakości bakterie zawierające fagosomy w prostych krokach i bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.Osoby, które nie znają tej metody, uznają ją za technicznie przystępną w porównaniu z metodologiami niebędącymi metodologiami. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł opracowania tej metody, gdy badaliśmy mechanizmy, za pomocą których patogeny wewnątrzkomórkowe przejmują kontrolę nad fagosomami na swoją korzyść. Tę procedurę zademonstruje Saray Gutierrez, post-doc z mojego laboratorium.Aby rozpocząć hodowlę Salmonella Typhimurium, użyj pętli bakteryjnej, aby zaszczepić pojedynczą kolonię bakteryjną w 5 mililitrach bulionu do infuzji serca mózgu. Następnie inkubować zawiesinę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając. Następnego dnia przenieść jeden mililitr tej zawiesiny bakt

isolation-salmonella-typhimurium-containing-phagosomes-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Gutiérrez, S., i wsp., Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium z makrofagów. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje hodowlę i przygotowanie Salmonella typhimurium w celu uzyskania czystej, metabolicznie aktywnej zawiesiny bakteryjnej nadającej się do użytku eksperymentalnego.

Przygotowanie kultury Salmonella typhimurium

Źródło: Sigal, N. i inni. Oczyszczanie RNA z wewnątrzkomórkowo hodowanej Listeria monocytogenes w komórkach makrofagów.  J. Vis. Exp. (2016).Ten film demonstruje izolację zinternalizowanych patogennych bakterii z zakażonych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM). Bakteriom pozwala się przyczepić do komórek gospodarza, a nieprzyłączone bakterie są wypłukiwane. Po internalizacji dodaje się antybiotyk eliminujący bakterie nieinternalizowane. Komórki gospodarza są lizowane, wirowane, a...

Izolacja wewnątrzkomórkowych bakterii patogennych z zakażonych komórek gospodarza

Source: Gutiérrez, S., et al., Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the magnetic isolation of phagosomes containing biotin–streptavidin bead–coated bacteria from infected macrophages. The protocol includes buffer treatments, cell disruption, magnetic separation, and washing to yield purified phagosomes for analysis.

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Inactivation of Bacteriophages Using Exogenous Lipopolysaccharide to Generate Phage-Free Salmonella Cultures

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania cytozolowego i wakuolarnego Salmonella typhimurium wewnątrz makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności. Makrofagi są zakażone Salmonellą wykazującą ekspresję białka fluorescencyjnego, która jest internalizowana w wyspecjalizowanej strukturze wakuolarnej zwanej wakuolą zawierającą Salmonellę lub SCV. Podzbiór bakterii ucieka z SCV i dostaje się do cytozolu. Bogata w cholesterol błona plazmatyczna...

Test do ilościowego oznaczania cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w zakażonych pierwotnych makrofagach

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Opracowano wysokoprzepustowy test in vitro fenotypu Salmonelli lub innych bakterii asocjacyjnych, inwazyjnych i replikacyjnych w komórkach fagocytarnych o wysokiej przepustowości. Metodę wykorzystano do oceny zmutowanych szczepów z nokautem genu Salmonelli pod kątem ich udziału w interakcjach gospodarz-patogen.

Wysokoprzepustowy test na fenotyp Salmonella enterica Typhimurium asocjacji, inwazji i replikacji w makrofagach

Opisujemy tutaj prosty protokół izolacji mysich makrofagów otrzewnowych. Po tej procedurze następuje ekstrakcja RNA w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów Toll-podobnych.

Izolacja mysich makrofagów otrzewnowej w celu przeprowadzenia analizy ekspresji genów po stymulacji receptorów toll-podobnych

Opisujemy kwantyfikację cytozolowej i wakuolarnej Salmonella typhimurium w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego za pomocą różnicowej przepuszczalności digitoniny.

Kwantyfikacja cytozolowej i wakuolarnej salmonelli w pierwotnych makrofagach przez różnicową przepuszczalność

Tutaj prezentujemy protokół oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy przy użyciu wzmocnionej zielonej fluorescencji wyrażającej białko Escherichia coli.

Wykorzystanie Escherichia coli z ekspresją białka zielonej fluorescencji do oceny fagocytozy makrofagów otrzewnowej myszy

Bakteriofagi, wszechobecne i różnorodne na Ziemi, infekują i namnażają się w organizmach bakteryjnych, odgrywając kluczową rolę w ekosystemach mikrobiologicznych. Pomimo ich znaczenia, ich obecność może zakłócić procesy przemysłowe. Opracowaliśmy metodę wykorzystującą lipopolisacharydy bakteryjne do eliminacji bakteriofagów z kultur Salmonelli.

Usuwanie bakteriofagów z zakażonych kultur salmonelli

Poznaj metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium z makrofagów przy użyciu biotyny i streptawidyny. Technika ta umożliwia badanie dojrzewania fagosomów i przetwarzania antygenów.

Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Przeglądaj więcej filmów