Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie nienaruszonych i wzbogaconych bakterii zawierających fagosomy. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny immunologii, takie jak zmiany w dojrzewaniu fagosomów i przetwarzaniu antygenu, gdy drobnoustroje chorobotwórcze atakują komórki gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że wytwarza wysokiej jakości bakterie zawierające fagosomy w prostych krokach i bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Osoby, które nie znają tej metody, uznają ją za technicznie przystępną w porównaniu z metodologiami niebędącymi metodologiami. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł opracowania tej metody, gdy badaliśmy mechanizmy, za pomocą których patogeny wewnątrzkomórkowe przejmują kontrolę nad fagosomami na swoją korzyść. Tę procedurę zademonstruje Saray Gutierrez, post-doc z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć hodowlę Salmonella Typhimurium, użyj pętli bakteryjnej, aby zaszczepić pojedynczą kolonię bakteryjną w 5 mililitrach bulionu do infuzji serca mózgu. Następnie inkubować zawiesinę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając. Następnego dnia przenieść jeden mililitr tej zawiesiny bakteryjnej do 19 mililitrów bulionu BHI w kolbie stożkowej.

Ponownie inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając. Gdy OD600 osiągnie jeden, wyjmij kolbę z inkubatora i przenieś kulturę do 50-mililitrowej probówki. Następnie odwirować probówkę o sile 5400 x G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad bakteryjny w 10 mililitrach sterylnego PBS. Po jednokrotnym powtórzeniu wirowania ponownie zawiesić osad w 4,9 mililitra PBS. Następnie dodaj 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu łączącego biotynę do zawiesiny bakteryjnej.

Po podzieleniu tej zawiesiny na pięć 1,5 mililitrowych probówek, inkubować w bloku termicznym w temperaturze pokojowej z ciągłym wstrząsaniem przy 350 obr./min przez dwie godziny. Po odwirowaniu probówek w temperaturze 15 000 x G w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut, odrzucić supernatant. Po dwóch kolejnych etapach wirowania i całkowitym usunięciu roztworu łączącego biotynę, ponownie zawieś tę bakterię kodowaną biotyną w jednym mililitrowym sterylnym PBS w pojedynczej 1,5-mililitrowej probówce.

Przenieś 100 mikrolitrów roztworu kulek magnetycznych sprzężonych ze streptawidyną do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra i umieść ją w stojaku magnetycznym na pięć minut. Po wyjęciu rozpuszczalnika z probówki wyjmij probówkę ze stojaka magnetycznego. Następnie ponownie zawiesić kulki, które pozostały w probówce, za pomocą jednego mililitra zawiesiny bakteryjnej zakodowanej biotyną.

Inkubować probówkę na bloku termicznym w temperaturze pokojowej przez godzinę, wstrząsając z prędkością 350 obr./min. Następnie umieść rurkę na stojaku magnetycznym na pięć minut. Użyj pipety, aby usunąć bakterie, które nie przylegały do ścianki i przenieś do nowej probówki oznaczonej jako bakterie niekodowane.

Rurka z kulkami magnetycznymi przylegającymi do ścianki zawiera bakterie kodowane przez biotynę Streptawidynę. Wyjmij probówkę z bakteriami kodowanymi przez biotynę Streptawidynę ze stojaka magnetycznego i ponownie zawieś w jednym mililitrze sterylnego PBS. Po pięciu minutach umieszczenia probówki na stojaku magnetycznym wyjmij PBS.

Na koniec ponownie zawiesić umyte bakterie kodowane biotyną Streptawidyną w 500 mikrolitrach sterylnego PBS i oznaczyć probówkę jako zakodowane bakterie. W dniu poprzedzającym zakażenie płytka w pełni zróżnicowała BMDM w sześciocentymetrowej czaszy w RPMI uzupełnionych dziesięcioprocentowym FBS. Następnego dnia odwirować zakodowaną zawiesinę bakteryjną o sile 15 000 x G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad bakteryjny w pożywce RPMI uzupełnionej dziesięcioprocentowym FBS. Usuń pożywkę z BMDM i dodaj pięć mililitrów zakodowanej zawiesiny bakteryjnej do pożywki RPMI w celu zainfekowania komórek. Aby zsynchronizować fagocytozę, inkubuj w temperaturze pokojowej przez dziesięć minut.

Następnie, aby zainicjować fagocytozę, inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Po inkubacji usuń pożywkę z naczyń i umyj komórki trzy razy w prędkości RPMI, aby usunąć niezinternalizowane bakterie. Do zabicia wszelkich niefagocytowanych bakterii przy dziesięciu mililitrach RPMI zawierających dziesięć procent FBS w 50 mikrogramach na mililitr gentamycyny.

Na koniec inkubuj zainfekowane BMDM w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla do pożądanego punktu czasowego. Najpierw przygotuj wymaganą objętość buforu izolacyjnego A fagosomy, dodając DTT i cytochalazynę B tuż przed użyciem oraz inhibitory proteazy i fosfatazy zgodnie z zaleceniami producenta. Usuń pożywkę z zainfekowanych komórek w żądanym punkcie czasowym i umyj komórki sterylnym PBS wstępnie podgrzanym do temperatury pokojowej.

Następnie dodaj 750 mikrolitrów buforu izolacyjnego Fagosomy A do naczynia i inkubuj na lodzie przez 20 minut. Pamiętaj, aby od czasu do czasu kołysać talerzem. Następnie dodaj 250 mikrolitrów buforu izolacyjnego Fagosomy B, a następnie kołysz płytki, aby upewnić się, że bufor całkowicie pokrywa powierzchnię.

Delikatnie zeskrob komórki za pomocą gumowego policjanta, aby usunąć komórki z naczynia i przenieść je do wstępnie schłodzonej rurki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby przepuścić zawiesinę komórek przez igłę o rozmiarze 26 co najmniej 15 razy. Następnie umieść zawieszenie ogniw na stojaku magnetycznym na pięć minut.

Cząstki przyczepione do kulek magnetycznych to fagosomy zawierające kodowane S.Typhimurium. Następnie przenieś zawiesinę, która zawiera resztę składników komórkowych, do nowej 1,5 mililitrowej probówki oznaczonej jako cytozol. Wyjmij probówkę zawierającą wyizolowane fagosomy ze stojaka i ponownie zawiesić w jednym mililitrze sterylnego PBS.

Umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym na pięć minut, a następnie wyjmij PBS. Po jednokrotnym powtórzeniu przemywania PBS, usunąć PBS i na koniec ponownie zawiesić S.Typhimurium zawierające fagosomy w wymaganym buforze. Aby ocenić skuteczność biotynylacji S.Typhimurium za pomocą mikroskopii konfokalnej, BMDM zostały zakażone mCherry S.Typhimurium znakowanym biotyną.

Po utrwaleniu i inkubacji z Cy5-Streptawidyną, udana biotynylacja została potwierdzona sygnałem fluorescencyjnym Cy5-Streptawidyny. Sygnał ten zaobserwowano wyłącznie w biotynylowanym mCherry S.Typhimurium, podczas gdy nie było sygnału w niebiotynylowanym mCherry S.Typhimurium. Analiza immunoblokowa izolowanych fagosomów wykazała znaczne wzbogacenie mCherry eksprymującego S.Typhimurium w fagosomach, w porównaniu z frakcją cytozolową.

Analiza immunobloków z użyciem markerów endosomów i lizosomów w izolowanych fagosomach wykazała wzbogacenie badanych markerów w fagosomy wyizolowanych cztery godziny po zakażeniu w porównaniu do 30 minut po zakażeniu. Kiedy protokół ten zastosowano do Staphylococcus aureus, wykazano udaną biotynylację GFP eksprymującego S.aureus. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około półtorej godziny, w zależności od czasu inkubacji wybranego przez badacza do infekcji.

Aby zapewnić powodzenie izolacji bakterii zawierających fagosomy, należy upewnić się, że zawierają wskazane stężenia i że płytki są kołysane, aby zapewnić jednorodne pokrycie komórek. Należy również zachować ostrożność podczas skrobania komórek i przepuszczania zawiesiny komórek przez igłę. Po tej procedurze można wykonać inne techniki, takie jak proteomika lub metabolomika, z wyizolowanymi fagosomami w celu zbadania zmian spowodowanych przez patogeny pod wpływem czynników patogennych.