Name: Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Poznaj prostą i wydajną metodę uzyskiwania linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr. Technika ta wymaga niewielkiej ilości krwi obwodowej i niskiej dawki IL-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kluczowe Projekty Chińskiej Akademii Nauk (KFZD-SW-205), System Wsparcia Technologii Strategicznych Zasobów Biologicznych Chińskiej Akademii Nauk (CZBZX-1 i ZSSB-004) oraz przez Granty z Narodowej Fundacji Nauki Chin (81401640) i Szanghajskiego Funduszu Nauk Przyrodniczych (14ZR1434800).

To badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Instytutu Genetyki i Biologii Rozwojowej Chińskiej Akademii Nauk, a protokół jest zgodny z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi dobra człowieka.
UWAGA: Zobacz Rysunek 1 dla schematu przepływu pracy.
1. Izolacja PBMC od pacjentów z CAEBV
<ol>
	<li>Oczyścić pierwotny PBMC z 2 ml krwi pełnej pacjentów z CAEBV przez wirowanie gradientowe (np. Ficoll-blaque) zgodnie z instrukcjami producenta. Alternatywnie rozmrozić kriokonserwowany PBMC z ciekłego azotu za pomocą pożywki RPMI 1640.</li>
	<li>Dodaj 2 μl błękitu trypanowego (0,4%) do 18 μl zawiesiny komórek, odczekaj 3 minuty, aby wybarwić komórki, przenieś zawiesinę na płytkę licznika komórek i zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórkową o gęstości 2-3×106 komórek/ml uzupełnioną kompletną pożywką hodowlaną RPMI 1640 zawierającą 20% surowicy ludzkiej (inaktywowanej termicznie w temperaturze 56 °C), 2 mM L-glutaminy i antybiotyki (100 μg/ml streptomycyny, 100 U/ml penicyliny). Nasiona 1 ml zawiesiny PBMC na dołek do 24-dołkowych płytek do hodowli komórkowych.</li>
	<li>Dodaj 150 U rhIL-2 na studzienkę.</li>
	<li>Umieścić płytki hodowlane w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W drugim dniu obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem (200-krotne powiększenie); komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe.</li>
</ol>
2. Rozszerzanie komórek i numerowanie komórek zdolnych do życia
<ol>
	<li>Obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem (powiększenie 200x) i monitoruj stan wzrostu komórek, numerując komórki przed zmianą pożywki: dodaj 2 μl błękitu trypanowego (0,4%) do 18 μl zawiesiny komórek i oblicz stężenie komórek (patrz 1.2, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Wyrzucić 500 μl pożywki do 24-dołkowej płytki i dodać 500 μl świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Dodaj 150U rhIL-2 na studzienkę.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu, jak w kroku 2.2.</li>
	<li>Narysuj krzywą wzrostu komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Gdy stężenie żywych komórek przekroczy 5×106 / ml, podziel komórki do nowych studzienek w stężeniu 1-2×106 komórek/ml w każdym dołku. Ten proces trwa 2-4 tygodnie.</li>
</ol>
3. Fenotypowanie komórek za pomocą cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Gdy komórki się rozwiną, zbierz 1×106 komórek, aby określić fenotypy linii komórkowych. Odwirować komórki przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (komórki NK/T wytrącą się na dnie probówki).</li>
	<li>Odrzucić sklarowany osad, przepłukać osad, dodając 7 ml PBS. Wirować przez 5 minut przy 240 x g w temperaturze pokojowej. Powtórz raz.</li>
	<li>Dodać 200 μl ludzkiej surowicy do każdej probówki, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w temperaturze 1×106/ml z zimnym PBSA (PBS + 0,2% BSA). Podziel komórki na 5 probówek, z których każda zawiera 2×105 komórek.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 240 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu PBSA lub PBSA zawierającego 10 μl PE (lub PE-Cy7) i 10 μl przeciwciał znakowanych FITC przeciwko receptorom komórek barwiących komórek T lub NK na lodzie, jak wskazuje <silna klasa = "xfig">Rysunek 4. Komórki zawieszone za pomocą buforu PBSA stosuje się jako kontrolę ujemną.</li>
	<li>Inkubuj komórki z przeciwciałami przez 20-30 minut na lodzie w ciemności.</li>
	<li>Umyj ogniwa dwukrotnie zimnym PBSA, ponownie zawieś ogniwa za pomocą 300 μl zimnego PBSA.</li>
	<li>Przeanalizuj fenotyp komórki za pomocą cytometru przepływowego.
	<ol>
		<li>Ustaw cytometr przepływowy w stanie "Utwórz arkusz roboczy". Skonfiguruj szablon eksperymentalny z wykresem kropkowym, który wyświetla rozproszenie do przodu (FSC) i punktowe do przodu (SSC).</li>
		<li>Załaduj rurkę kontrolną izotypu, aby zoptymalizować napięcia FSC i SSC oraz zoptymalizować wartość progową FSC, aby wyeliminować zanieczyszczenia bez zakłócania populacji komórek będących przedmiotem zainteresowania. Usuń wszystkie parametry z wyjątkiem FSC, SSC, FITC, PE i PE-Cy7.</li>
		<li>Przeprowadzić kompensację przy użyciu kontroli izotypu i pojedynczej kontroli pozytywnej w każdej grupie analizy 2-kolorowej.</li>
		<li>Załaduj próbki i utwórz wykresy punktowe HLA-DR VS CD19, CD4 VS CD8, CD56 VS CD16 i CD3 VS CD16 przedstawiające różne populacje komórek. 
		UWAGA: PBMC użyto do przeprowadzenia kompensacji przy użyciu kontroli ujemnej/izotypu i pojedynczej kontroli dodatniej. 2-kolorowa immunofluorescencja z cytometrem przepływowym była rutynowo stosowana do analizy ekspresji markerów powierzchniowych. Uwzględniono następujące przeciwciała: anty-HLA-DR, anty-CD4, anty-CD16 sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC), anty-CD8, anty-CD56, CD3 sprzężone z fikoerytryną (PE) i anty-CD19 sprzężone z PE-Cy7.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ekspansja i kriokonserwacja komórek NK/T
<ol>
	<li>Zmień pożywkę po zakończeniu analizy fenotypu komórki. Ostrożnie usunąć połowę supernatantu i unikać dotykania komórek znajdujących się na dnie płytki. Dodać taką samą objętość świeżej pożywki hodowlanej zawierającej 300 j./ml rhIL-2 do płytek komórkowych.</li>
	<li>Zmieniaj połowę pożywki co 3 dni (jak w 2.2), aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zazwyczaj proces ten trwa 2-3 tygodnie.</li>
	<li>Przenieść komórki z płytek 24-dołkowych do kolb hodowlanych T25 po zmieszaniu różnych studzienek z tej samej linii. Podwój objętość pożywki hodowlanej, gdy zmieni kolor na żółty, aż objętość pożywki rozszerzy się do 10-15 ml. Dodać rhIL-2 o stężeniu 150 U/ml.</li>
	<li>Zmień pożywkę 24 godziny przed zamrożeniem po 2-3 tygodniach wzrostu, kiedy masę komórkową można zaobserwować gołym okiem. Zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 240 x g i ponownie zawiesić osad komórkowy o gęstości 5-10 x 106 komórek/ml z zamrożonym roztworem podstawowym, który zawiera 90% płodowej surowicy bydlęcej i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). Zamrażać w tempie od 1 °C na minutę do -80 °C, a następnie przenieść bezpośrednio do ciekłego azotu.</li>
</ol>

<ol><li>Cohen, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus infection.</a> N Engl J Med. 343 (7), 481-492 (2000).</li>
<li>Cohen, J. I., Kimura, H., Nakamura, S., Ko, Y. H., Jaffe, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease+in+non-immunocompromised+hosts%3A+a+status+report+and+summary+of+an+international+meeting%2C+8-9+September+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease in non-immunocompromised hosts: a status report and summary of an international meeting, 8-9 September 2008.</a> Ann Oncol. 20 (9), 1472-1482 (2009).</li>
<li>Oshimi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+and+managing+natural+killer-cell+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding and managing natural killer-cell malignancies.</a> Br J Haematol. 139 (4), 532-544 (2007).</li>
<li>Kawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+allergy+and+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mosquito allergy and Epstein-Barr virus-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disease.</a> Blood. 98 (10), 3173-3174 (2001).</li>
<li>Kimura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%3A+is+this+an+infectious+disease%2C+lymphoproliferative+disorder%2C+or+immunodeficiency%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic active Epstein-Barr virus infection: is this an infectious disease, lymphoproliferative disorder, or immunodeficiency?</a> Rev Med Virol. 16 (4), 251-261 (2006).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+virologic+characteristics+of+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 98 (2), 280-286 (2001).</li>
<li>Ohshima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+categorization+of+pathological+states+of+EBV-associated+T%2Fnatural+killer-cell+lymphoproliferative+disorder+%28LPD%29+in+children+and+young+adults%3A+overlap+with+chronic+active+EBV+infection+and+infantile+fulminant+EBV+T-LPD%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Proposed categorization of pathological states of EBV-associated T/natural killer-cell lymphoproliferative disorder (LPD) in children and young adults: overlap with chronic active EBV infection and infantile fulminant EBV T-LPD.</a> Pathol Int. 58 (4), 209-217 (2008).</li>
<li>Okano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+and+problematic+standpoints+of+severe+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Overview and problematic standpoints of severe chronic active Epstein-Barr virus infection syndrome.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 44 (3), 273-282 (2002).</li>
<li>Straus, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronic+mononucleosis+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The chronic mononucleosis syndrome.</a> J Infect Dis. 157 (3), 405-412 (1988).</li>
<li>Jones, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+lymphomas+containing+Epstein-Barr+viral+DNA+in+patients+with+chronic+Epstein-Barr+virus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">T-cell lymphomas containing Epstein-Barr viral DNA in patients with chronic Epstein-Barr virus infections.</a> N Engl J Med. 318 (12), 733-741 (1988).</li>
<li>Kikuta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+genome-positive+T+lymphocytes+in+a+boy+with+chronic+active+EBV+infection+associated+with+Kawasaki-like+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus genome-positive T lymphocytes in a boy with chronic active EBV infection associated with Kawasaki-like disease.</a> Nature. 333 (6172), 455-457 (1988).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+natural+killer+%28NK%29-cell+and+gammadelta+T-cell+lines+established+from+primary+lesions+of+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas+associated+with+the+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel natural killer (NK)-cell and gammadelta T-cell lines established from primary lesions of nasal T/NK-cell lymphomas associated with the Epstein-Barr virus.</a> Blood. 97 (3), 708-713 (2001).</li>
<li>Nagata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+natural+killer-cell+clones+with+variable+proliferative+capacity+in+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathol+Int%22%5BJournal%5D)">Presence of natural killer-cell clones with variable proliferative capacity in chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Pathol Int. 51 (10), 778-785 (2001).</li>
<li>Tabata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroa+vacciniforme-like+lymphomatoid+papulosis+in+a+Japanese+child%3A+a+new+subset%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Hydroa vacciniforme-like lymphomatoid papulosis in a Japanese child: a new subset.</a> J Am Acad Dermatol. 32 (2 Pt 2), 378-381 (1995).</li>
<li>Tsuchiyama, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+human+natural+killer-cell+line+%28NK-YS%29+established+from+natural+killer+cell+lymphoma%2Fleukemia+associated+with+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel human natural killer-cell line (NK-YS) established from natural killer cell lymphoma/leukemia associated with Epstein-Barr virus infection.</a> Blood. 92 (4), 1374-1383 (1998).</li>
<li>Tsuge, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-infected+natural+killer+%28NK%29+cell+proliferation+in+patients+with+severe+mosquito+allergy%3B+establishment+of+an+IL-2-dependent+NK-like+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of Epstein-Barr virus (EBV)-infected natural killer (NK) cell proliferation in patients with severe mosquito allergy; establishment of an IL-2-dependent NK-like cell line.</a> Clin Exp Immunol. 115 (3), 385-392 (1999).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+cytological+and+cytogenetic+features+of+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29-positive+natural+killer+%28NK%29+cells+and+cell+lines+derived+from+patients+with+nasal+T%2FNK-cell+lymphomas%2C+chronic+active+EBV+infection+and+hydroa+vacciniforme-like+eruptions%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Common cytological and cytogenetic features of Epstein-Barr virus (EBV)-positive natural killer (NK) cells and cell lines derived from patients with nasal T/NK-cell lymphomas, chronic active EBV infection and hydroa vacciniforme-like eruptions.</a> Br J Haematol. 121 (5), 805-814 (2003).</li>
<li>Oyoshi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+expansion+of+Vgamma9-JgammaP%2FVdelta2-Jdelta3+gammadelta+T+cells+in+nasal+T-cell+lymphoma+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Preferential expansion of Vgamma9-JgammaP/Vdelta2-Jdelta3 gammadelta T cells in nasal T-cell lymphoma and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Am J Pathol. 162 (5), 1629-1638 (2003).</li>
<li>Imadome, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mouse+xenograft+models+reveal+a+critical+role+of+CD4%2B+T+cells+in+the+proliferation+of+EBV-infected+T+and+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Novel mouse xenograft models reveal a critical role of CD4+ T cells in the proliferation of EBV-infected T and NK cells.</a> PLoS Pathog. 7 (10), e1002326(2011).</li>
<li>Shibuya, A., Nagayoshi, K., Nakamura, K., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphokine+requirement+for+the+generation+of+natural+killer+cells+from+CD34%2B+hematopoietic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Lymphokine requirement for the generation of natural killer cells from CD34+ hematopoietic progenitor cells.</a> Blood. 85 (12), 3538-3546 (1995).</li>
<li>Spits, H., Yssel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+Human+T+and+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Cloning of Human T and Natural Killer Cells.</a> Methods. 9 (3), 416-421 (1996).</li>
<li>Liu, X., Xu, C., Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Red+Blood+Cell+Lysis+Method+for+the+Establishment+of+B+Lymphoblastoid+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines.</a> J Vis Exp. (119), (2017).</li>
<li>Kawabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+flow+cytometric+in+situ+hybridization+assay+to+Epstein-Barr+virus-associated+T%2Fnatural+killer+cell+lymphoproliferative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Application of flow cytometric in situ hybridization assay to Epstein-Barr virus-associated T/natural killer cell lymphoproliferative diseases.</a> Cancer Sci. 103 (8), 1481-1488 (2012).</li>
</ol>

D.Z., X.Z. i X.C. są współwynalazcami oczekujących wniosków patentowych obejmujących potencjalne zastosowania tej metody do ustanawiania linii komórkowych NK / T oraz linii komórkowych ustalonych w tym badaniu. D.Z., X.Z. i X.C. deklarują, że nie mają sprzecznych interesów finansowych w tej pracy. Pozostali autorzy deklarują, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W ramach tego protokołu opracowano nowatorską technikę tworzenia linii komórkowych NK/T z krwi pełnej pacjentów z CAEBV. W porównaniu z istniejącymi metodami, główną zaletą tej metody jest jej prostota i wymaganie jedynie niewielkiej objętości krwi, przy jednoczesnym wykazywaniu wysokiego wskaźnika powodzenia i dobrych warunków żywotności komórek. Co więcej, linie komórkowe NK / T można ustalić poprzez hodowlę PBMC bez wcześniejszego określania typów komórek, które EBV zainfekował utajony, ponieważ oznaczanie zużywałoby ...

Wirus Epsteina-Barr (EBV) jest wszechobecny i infekuje nie tylko limfocyty B, ale także komórki T i NK (NK), co powoduje szereg chorób limfoproliferacyjnych NK/T związanych z EBV (LPD) i chłoniaków/białaczek, takich jak limfohistiocytoza hemofagocytarna związana z EBV, chłoniak podobny do hydroa vacciniforme, pozawęzłowy chłoniak z komórek NK/T, typ nosa i agresywna białaczka z komórek NK1,2,3. Wśród nich znajduje się ciężka przewlekła aktywna choroba EBV (SCAEBV), która występuje głównie w Azji Wschodniej, a która jest obecnie uważana za LPD spowodowaną klonalną ekspansją komórek T lub NK zakażonych EBV4,5,6,7, ale bez widocznego niedoboru odporności obecnego w objawach podobnych do mononukleozy zakaźnej (IM), takich jak gorączka, hepatosplenomegalia, powiększenie węzłów chłonnych i wątroba dysfunkcja utrzymująca się lub nawracająca, a także wysoki ładunek EBV-DNA we krwi obwodowej <klasa SUP = 'xref'>8,<klasa SUP = 'xref'>9. Pacjenci z CAEBV mają złe rokowanie10,11, a jego patogeneza i rola EBV są niejasne. Dlatego linie komórkowe pochodzące z chorób limfoproliferacyjnych NK / T związanych z EBV i chłoniaków są bardzo pomocne jako modele komórkowe do wyjaśnienia mechanizmu indukowanej przez EBV proliferacji komórek NK lub T i jej związku z wysoką częstością występowania białaczki lub chłoniaka. 
Do tej pory utworzono kilka linii komórkowych za pomocą różnych technik12,13,14,15,16. Ludzka linia komórkowa NK, NK-YS, została utworzona z chłoniaka/białaczki z komórek NK, poprzez współhodowlę z mysią linią komórek zrębowych jako karmicielem i w obecności rhIL-2 w stężeniu 20U na ml15. KAI3 był kolejną linią komórkową NK utworzoną od pacjentów z ciężką alergią na komary lub SCAEBV z autologiczną limfoblastoidalną linią komórkową (LCL), komórkami B przekształconymi przez EBV, jako komórki zasilające i addycją rhIL-2 w 100U/mL16. SNK6 i SNT8 uzyskano z tkanek nowotworowych pacjentów z chłoniakiem z komórek NK / T nosa przez dodanie wysokiej dawki rhIL-2 (700U / mL) 12. Przy podobnej technice komórka SNK-1 pochodziła od pacjentów z CAEBV, wyhodowanych z PBMC poprzez usunięcie limfocytów T i dodanie 700U / ml rhIL-213,17. SNT13 i SNT15 zostały ustanowione przez usunięcie komórek CD4+ i CD8+18. Do tej pory inne linie komórek T i NK od pacjentów z EBV-NK/T LPD zostały opracowane tą metodą19.
Wady istniejących metod wymienionych powyżej obejmują zastosowanie komórek zasilających, wymóg wysokiej dawki IL-2, wykorzystanie aż 10 ml krwi pełnej, lub oczyszczanie komórek NK/T, co jest bardzo trudne w klinice ze względu na konieczność sprawdzenia, które typy komórek, które EBV infekuje utajenie, przed rozpoczęciem hodowli. Ponieważ CAEBV występuje głównie u dzieci w Azji, 10 ml krwi nie jest łatwe do zdobycia we wszystkich regionach. W tym badaniu opracowaliśmy nową, prostą metodę o wysokim wskaźniku sukcesu do tworzenia linii komórek NK i / lub T poprzez hodowlę PBMC od pacjentów z CAEBV przy użyciu niskiej dawki rhIL2 i objętości 2 ml krwi pełnej bez komórek żywiących. Wyniki tej metody dowiodły jej wysokiej skuteczności i oszczędności czasu.

<table><tbody><tr><td>Przeciwciało Hu HLA-DR FITC</td><td>BD</td> 560944 <td></td><td>dla FACS</td></tr><tr><td>Hu CD4 Przeciwciało FITC</td><td>BD</td><td>555346</td><td>dla FACS</td></tr><tr><td>Przeciwciało Hu/NHP CD8 PE</td><td>BD</td><td>557086</td><td>dla FACS</td></tr><tr><td>Hu CD3 PE</td><td>BD</td><td>555340</td><td>dla FACS</td></tr><tr><td>Hu CD16 FITC 3G8</td><td>BD</td><td>555406</td><td>przeciwciało dla FACS</td></tr><tr><td>Hu/NHP CD56 PE MY31</td><td>BD</td><td>Przeciwciało 556647</td><td>do FACS</td></tr><tr><td>hu/CD19 PE-Cy7</td><td>Przeciwciało 560728 BD</td><td></td><td>dla</td></tr><tr><td>FACS ludzkiej IL-2</td><td>Roche</td><td>11147528001</td><td></td></tr><tr><td>ludzkiej surowicy</td><td>MRC</td><td>CCC118-125</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2</td><td>SANYO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Techcomp</td><td></td><td>CT6T</td><td>Mikroskop wirówkowy</td></tr><tr><td></td><td>OLYMPUS CKX53</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Countstar</td><td>IC 1000</td><td>Do liczenia komórek</td></tr><tr><td>24-dołkowy klaster kultur komórkowych</td><td>Corning Incorporated</td><td>3524</td><td>Płytki polistyrenowe</td></tr><tr><td>25cm2 kolba do hodowli komórkowych</td><td>Nest</td><td>707001</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270</td><td>Składnik pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>żywotność</td><td>22400089</td><td>Do podłoża komórkowego</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Amresco</td><td>374</td><td>Składnik pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>100 x streptomycyna roztwór penicyliny BioRoYeeBRY-2309</td><td>BioRoYee</td><td>BRY-2309</td><td>Składnik pożywki komórkowej</td></tr><tr><td>Ficoll paque plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>Do izolacji in vitro limfocytów</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Do zamrażania komórek</td></tr><tr><td>cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td>BD FACSAria II</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie</td><td>BD</td><td>BD FACSDiva oprogramowanie</td> oprogramowanie <td>FACS analiza</td></tr></tbody></table>

skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych nk i t od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem epsteina-barr

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Opisano wiele metod tworzenia linii komórkowych NK/T od pacjentów z chłoniakiem lub zespołem limfoproliferacyjnym. Metody te wykorzystywały komórki karmicielskie, oczyszczone limfocyty NK lub T z aż 10 ml krwi lub wysoką dawką IL-2. Badanie to przedstawia nową metodę z potężną i prostą strategią tworzenia linii komórek NK i T poprzez hodowlę komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z dodatkiem rekombinowanej ludzkiej IL-2 (rhIL-2) i wykorzystuje zaledwie 2 ml krwi pełnej. Komórki mogą szybko się namnażać w ciągu dwóch tygodni i utrzymywać się przez ponad 3 miesiące. Dzięki tej metodzie ustalono 7 linii komórek NK lub T o wysokim wskaźniku sukcesu. Ta metoda jest prosta, niezawodna i ma zastosowanie do ustanawiania linii komórkowych z większej liczby przypadków chłoniaka z komórek CAEBV lub NK/T.

Po 3 dniach hodowli podczas tworzenia linii komórkowych zaczynają pojawiać się komórki polimorficzne (Rycina 2). Po 7 dniach komórki szybko rosną, a zarówno ich liczba, jak i żywotność zwiększają się w wysokim tempie (Rycina 3). Po 10–14 dniach wzrostu wyraźnie widoczne są małe skupiska komórek, gdy stężenie komórek może przekroczyć 3-6 × 106. W tym okresie należy przeprowadzić pasaż komórek poprzez ich podział do dwóc...

Prosta metoda pozyskiwania klonów komórek NK i T od pacjentów z CAEBV została opracowana z wysoką wydajnością, niewielką ilością krwi obwodowej i niską dawką IL-2.

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie linii komórkowych NK lub T od pacjentów z CAEBV, co ma ogromne znaczenie dla badań nad tą śmiertelną chorobą. Metoda ta pomaga uzyskać linie komórek NK lub T do badań nad mechanizmem CAEBV, takich jak badanie surowego VBV pod kątem proliferacji komórek, przesiewowych inhibitorów zakłócających proliferację komórek NK / T. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona bardzo prosta i wydajna, która wymaga jedynie niewielkiej ilości krwi obwodowej i niskiej dawki żelaza do ustanowienia linii komórek NK lub T od pacjentów z CAEBV.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ przeżycie komórek w pierwszym lub dwóch tygodniach hodowli jest niepewne, a ta metoda pokaże ci, jak określić proliferację komórek wczesnej hodowli. Kiedy po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, odkryliśmy, że żelazo w ludzkiej surowicy 2 może zawierać PBMC przez okres do dwóch tygodni. Wykazaliśmy, że demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ pokazuje kształt komórek i przyczynę proliferacji.I to rozszerzenie komórek i numeracja komórek Y-bar Aby rozpocząć tę procedurę, oczyść pierwotny PBMC z dwóch mililitrów pełnej krwi pacjentów z CAEBV przez wirowanie gradientowe. Alternatywnie, rozmrażać kriokonserwowany PBMC z ciekłego azotu za pomocą pożywki RPMI-1640. Następnie dodaj dwa mikrolitry 0,4% błękitu trypanowego do 18 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby wybarwić komórki przez trzy minuty, a następnie przenieś zawiesinę na płytkę licznika komórek i zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.Przygotuj zawiesinę komórkową o gęstości od dwóch do trzech razy od 10 do szóstej komórki na mililitr, uzupełnioną kompletną pożywką hodowlaną RPMI-1640 zawierającą 20% surowicy ludzkiej, dwie milimolowe L-glutaminę i antybiotyki. Następnie należy zasiać jeden mililitr zawiesiny PBMC na studzienkę w 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 150 jednostek na mililitr rhIL-2 do każdej studzienki.Umieść płytki hodowlane w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Drugiego dnia obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem w 200-krotnym powiększeniu. Komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe.W tym kroku dodaj dwa mikrolitry 0,4% błękitu trypanowego do 18 mikrolitrów zawiesiny komórek i oblicz stężenie komórek. Następnie obserwuj morfologię komórek i monitoruj stan wzrostu komórek, numerując komórki przed zmianą podłoża. Ważne jest, aby monitorować morfologię komórki i stan.To, czy komórki przeżywają, możemy ocenić na podstawie komórek polimorficznych i stanu komórek na wczesnym etapie hodowli. Następnie usuń 500 mikrolitrów pożywki z każdego dołka 24-dołkowej płytki i dodaj do niej 500 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Następnie dodaj 150 jednostek na mililitr rhIL-2 do każdej studzienki.Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu. Wykreśl krzywą wzrostu komórki. Gdy stężenie żywotnych komórek przekroczy pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr, podziel komórki do nowych studzienek o stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w każdym dołku.Ten proces trwa od dwóch do czterech tygodni. Kiedy komórki się rozwiną, zbierz jedną komórkę od 10 do szóstej, aby określić fenotypy linii komórkowych. Odwiruj je w ilości 240 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wytrącić komórki NKNT.Następnie wyrzuć supernatant, przemyj osad, dodając siedem mililitrów PBS. Wirować przez pięć minut w temperaturze pokojowej 240 g w temperaturze pokojowej. Powtórz procedurę jeszcze raz, a następnie dodaj 200 mikrolitrów ludzkiej surowicy do każdej probówki, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej Odwiruj komórki 240 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w ilości od 10 do szóstych komórek na mililitr za pomocą zimnego PBSA. Następnie podziel komórki na pięć probówek, z których każda zawiera dwa razy od 10 do piątej komórki. Następnie odwirować komórki w temperaturze 240 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu PBSA lub PBSA zawierającego 10 mikrolitrów PE i 10 mikrolitrów przeciwciał znakowanych FITC do barwienia receptorów komórkowych komórek T lub NK na lodzie.Komórki zawieszone za pomocą buforu PBSA stosuje się jako kontrolę ujemną. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałami przez 20 do 30 minut na lodzie w ciemności. Umyj komórki dwukrotnie zimnym PBSA i ponownie zawiesić komórki za pomocą 300 mikrolitrów zimnego PBSA przed analizą za pomocą cytometru przepływowego.Po zakończeniu analizy fenotypu komórek ostrożnie usunąć połowę supernatantu i unikać dotykania komórek na dnie płytki. Dodać taką samą objętość świeżej pożywki hodowlanej zawierającej rhIL-2 w ilości 300 jednostek na mililitr do płytek, a następnie zmieniać połowę pożywki co trzy dni, aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem. Następnie przenieś komórki z 24-dołkowych płytek do kolb hodowlanych T-25 po zmieszaniu różnych dołków z tej samej linii.Podwój objętość pożywki hodowlanej, gdy zmieni kolor na żółty, aż objętość pożywki rozszerzy się do 10 do 15 mililitrów. Następnie dodaj do niego rhIL-2 o stężeniu 150 jednostek na mililitr. Zmień pożywkę na 24 godziny przed zamrożeniem po dwóch do trzech tygodniach wzrostu, kiedy masę komórkową można zaobserwować gołym okiem.Zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut w stężeniu 240 razy g i ponownie zawiesić osad komórkowy o gęstości od pięciu do 10 razy od 10 do szóstych komórek na mililitr z zamrożonym roztworem podstawowym, który zawiera 90% płodowej surowicy bydlęcej i 10% DMSO. Zamroź go w tempie jednego stopnia Celsjusza na minutę do minus 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieś bezpośrednio do ciekłego azotu.Po trzech dniach hodowli podczas tworzenia linii komórkowych zaczynają pojawiać się komórki polimorficzne. Po siedmiu dniach komórki rosną szybko, ponieważ zarówno liczba, jak i żywotność komórek rosły w szybkim tempie. Małe skupiska komórek są wyraźnie widoczne po 10 do 14 dniach wzrostu, kiedy stężenie komórek przekracza trzy do sześciu razy od 10 do szóstej.W tym okresie komórki należy rozmnożyć przez podział na dwie lub trzy studzienki płytki hodowlanej. Około miesiąc później, gdy liczba komórek osiągnie od trzech do pięciu razy od 10 do siódmej, liczba jest wystarczająco wysoka, aby można było ją zachować. Kolejną ważną kwestią jest określenie fenotypów po pomyślnym wyhodowaniu komórek.Nasze wyniki wskazują, że komórki T i NK mogą być hodowane metodą opisaną powyżej, a linie komórkowe mogą być tworzone za pomocą tej techniki, ponieważ komórki rosły przez ponad trzy miesiące w dobrym stanie. Ta metoda, ta technika, może być wykonana jeszcze bardziej. Jest łatwy do prawidłowego wykonania.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu zmienności PBMC. W przypadku tej procedury można zastosować dowolną metodę, taką jak zestaw do testów MTT 8, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak toksyczność linii komórek NK lub T, które można wykorzystać w immunoterapii adoptywnej. Po każdym opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się CAEBV do zbadania mechanizmu NK/T związanego z EBV, które obejmują choroby operacyjne w systemie modelu komórkowego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustanowić rozszerzenie linii komórek NK i T zgodnie z tym protokołem. Nie zapominaj, że praca z patogenem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.

an-efficient-simple-method-to-establish-nk-t-cell-lines-from-patients

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisujemy metodę generowania przekształconych linii komórek B z wykorzystaniem wirusa Epstein-Barr. Przedstawiamy również nowatorski test, który pozwala zidentyfikować komórki B przeznaczone do transformacji już trzy dni po infekcji.

Tworzenie linii limfoblastoidalnych przekształconych przez wirusa Epsteina-Barr

W niniejszej pracy opisujemy pierwszą zgodną z dobrą praktyką wytwarzania (GMP) metodę produkcji wirusowo-specyficznych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) z krwi pępowinowej, która jest źródłem głównie naiwnych limfocytów T.

Ekspansja cytotoksycznych limfocytów T z krwi pępowinowej nakierowanych na cytomegalowirus, wirusa Epstein-Barr i adenowirusa

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

Mięsak Kaposiego (KS) to nowotwór wywołany przez zakażenie wirusem onkogennym ludzkim herpeswirusem-8/herpeswirusem KS (HHV-8/KSHV). Opisany tutaj model hodowli komórek śródbłonka jest wyjątkowo odpowiedni do badania mechanizmów, za pomocą których KSHV przekształca komórki gospodarza.

Model in vitro do badania transformacji komórkowej przez opryszczkę mięsaka Kaposiego

Prosta metoda lizy czerwonych krwinek do tworzenia B-LCL została opracowana z wysoką efektywnością nieśmiertelności, wymagając niewielkiej ilości krwi i oszczędzając czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Tutaj opisane są metody używane do badania funkcjonalnego efektu mutacji RYR1 endogennie wyrażanych w wirusie Epsteina-Barra, unieśmiertelnionych ludzkich limfocytach B oraz komórkach satelitarnych pochodzących z biopsji mięśni, zróżnicowanych w miotuby.

Charakterystyka funkcjonalna endogennych wariantów ludzkiego RYR1

Tutaj prezentujemy metodę rozszerzania naturalnego killera krwi obwodowej (PBNK), komórek NK z tkanek wątroby oraz chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-komórek NK pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) lub krwi pępowinowej (CB). Protokół ten demonstruje ekspansję komórek NK i CAR-NK przy użyciu ogniw zasilających 221-mIL-21 oprócz zoptymalizowanej czystości ekspandowanych komórek NK.

Metoda ekspansji komórek NK i CAR-NK przy użyciu linii komórkowej B zmodyfikowanej przez błonę IL-21

Opisujemy metodę łączącą kulki immunomagnetyczne i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu izolowania i analizowania zdefiniowanych subpopulacji komórek odpornościowych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (monocyty, limfocyty T CD4+, limfocyty T CD8+, limfocyty B i komórki NK). Za pomocą tej metody można oczyścić i przeanalizować komórki znakowane magnetycznie i fluorescencyjnie.

Oddzielenie subpopulacji komórek odpornościowych w próbkach krwi obwodowej od dzieci z mononukleozą zakaźną

Ten protokół pozwala na izolację cząsteczek wirusa Epsteina-Barr z ludzkiej linii komórkowej P3HR1 po wywołaniu cyklu litycznego wirusa za pomocą 12-mirystynianu 13-octanu forbolu. DNA jest następnie ekstrahowane z preparatu wirusowego i poddawane PCR w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia stężenia cząstek wirusa.

Izolacja i kwantyfikacja wirusa Epsteina-Barr z linii komórkowej P3HR1

Poznaj prostą i wydajną metodę uzyskiwania linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr. Technika ta wymaga niewielkiej ilości krwi obwodowej i niskiej dawki IL-2.

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr (Wideo) | JoVE Journal

Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

Przeglądaj więcej filmów