Skuteczna i prosta metoda tworzenia linii komórkowych NK i T od pacjentów z przewlekłym aktywnym zakażeniem wirusem Epsteina-Barr

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie linii komórkowych NK lub T od pacjentów z CAEBV, co ma ogromne znaczenie dla badań nad tą śmiertelną chorobą. Metoda ta pomaga uzyskać linie komórek NK lub T do badań nad mechanizmem CAEBV, takich jak badanie surowego VBV pod kątem proliferacji komórek, przesiewowych inhibitorów zakłócających proliferację komórek NK / T. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona bardzo prosta i wydajna, która wymaga jedynie niewielkiej ilości krwi obwodowej i niskiej dawki żelaza do ustanowienia linii komórek NK lub T od pacjentów z CAEBV.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ przeżycie komórek w pierwszym lub dwóch tygodniach hodowli jest niepewne, a ta metoda pokaże ci, jak określić proliferację komórek wczesnej hodowli. Kiedy po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, odkryliśmy, że żelazo w ludzkiej surowicy 2 może zawierać PBMC przez okres do dwóch tygodni. Wykazaliśmy, że demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ pokazuje kształt komórek i przyczynę proliferacji.

I to rozszerzenie komórek i numeracja komórek Y-bar Aby rozpocząć tę procedurę, oczyść pierwotny PBMC z dwóch mililitrów pełnej krwi pacjentów z CAEBV przez wirowanie gradientowe. Alternatywnie, rozmrażać kriokonserwowany PBMC z ciekłego azotu za pomocą pożywki RPMI-1640. Następnie dodaj dwa mikrolitry 0,4% błękitu trypanowego do 18 mikrolitrów zawiesiny komórek, aby wybarwić komórki przez trzy minuty, a następnie przenieś zawiesinę na płytkę licznika komórek i zmierz stężenie i żywotność komórek za pomocą automatycznego licznika komórek.

Przygotuj zawiesinę komórkową o gęstości od dwóch do trzech razy od 10 do szóstej komórki na mililitr, uzupełnioną kompletną pożywką hodowlaną RPMI-1640 zawierającą 20% surowicy ludzkiej, dwie milimolowe L-glutaminę i antybiotyki. Następnie należy zasiać jeden mililitr zawiesiny PBMC na studzienkę w 24-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych. Następnie dodaj 150 jednostek na mililitr rhIL-2 do każdej studzienki.

Umieść płytki hodowlane w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Drugiego dnia obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem w 200-krotnym powiększeniu. Komórki są w dobrym stanie, gdy są jasne i okrągłe.

W tym kroku dodaj dwa mikrolitry 0,4% błękitu trypanowego do 18 mikrolitrów zawiesiny komórek i oblicz stężenie komórek. Następnie obserwuj morfologię komórek i monitoruj stan wzrostu komórek, numerując komórki przed zmianą podłoża. Ważne jest, aby monitorować morfologię komórki i stan.

To, czy komórki przeżywają, możemy ocenić na podstawie komórek polimorficznych i stanu komórek na wczesnym etapie hodowli. Następnie usuń 500 mikrolitrów pożywki z każdego dołka 24-dołkowej płytki i dodaj do niej 500 mikrolitrów świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej. Następnie dodaj 150 jednostek na mililitr rhIL-2 do każdej studzienki.

Zmieniaj podłoże dwa razy w tygodniu. Wykreśl krzywą wzrostu komórki. Gdy stężenie żywotnych komórek przekroczy pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr, podziel komórki do nowych studzienek o stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do szóstych komórek na mililitr w każdym dołku.

Ten proces trwa od dwóch do czterech tygodni. Kiedy komórki się rozwiną, zbierz jedną komórkę od 10 do szóstej, aby określić fenotypy linii komórkowych. Odwiruj je w ilości 240 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby wytrącić komórki NKNT.

Następnie wyrzuć supernatant, przemyj osad, dodając siedem mililitrów PBS. Wirować przez pięć minut w temperaturze pokojowej 240 g w temperaturze pokojowej. Powtórz procedurę jeszcze raz, a następnie dodaj 200 mikrolitrów ludzkiej surowicy do każdej probówki, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej Odwiruj komórki 240 razy g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w ilości od 10 do szóstych komórek na mililitr za pomocą zimnego PBSA. Następnie podziel komórki na pięć probówek, z których każda zawiera dwa razy od 10 do piątej komórki. Następnie odwirować komórki w temperaturze 240 razy g przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza Wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą buforu PBSA lub PBSA zawierającego 10 mikrolitrów PE i 10 mikrolitrów przeciwciał znakowanych FITC do barwienia receptorów komórkowych komórek T lub NK na lodzie.

Komórki zawieszone za pomocą buforu PBSA stosuje się jako kontrolę ujemną. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałami przez 20 do 30 minut na lodzie w ciemności. Umyj komórki dwukrotnie zimnym PBSA i ponownie zawiesić komórki za pomocą 300 mikrolitrów zimnego PBSA przed analizą za pomocą cytometru przepływowego.

Po zakończeniu analizy fenotypu komórek ostrożnie usunąć połowę supernatantu i unikać dotykania komórek na dnie płytki. Dodać taką samą objętość świeżej pożywki hodowlanej zawierającej rhIL-2 w ilości 300 jednostek na mililitr do płytek, a następnie zmieniać połowę pożywki co trzy dni, aż skupiska komórek będą wyraźnie widoczne pod mikroskopem. Następnie przenieś komórki z 24-dołkowych płytek do kolb hodowlanych T-25 po zmieszaniu różnych dołków z tej samej linii.

Podwój objętość pożywki hodowlanej, gdy zmieni kolor na żółty, aż objętość pożywki rozszerzy się do 10 do 15 mililitrów. Następnie dodaj do niego rhIL-2 o stężeniu 150 jednostek na mililitr. Zmień pożywkę na 24 godziny przed zamrożeniem po dwóch do trzech tygodniach wzrostu, kiedy masę komórkową można zaobserwować gołym okiem.

Zmierz stężenie komórek za pomocą licznika komórek. Następnie odwiruj zawiesinę komórkową przez pięć minut w stężeniu 240 razy g i ponownie zawiesić osad komórkowy o gęstości od pięciu do 10 razy od 10 do szóstych komórek na mililitr z zamrożonym roztworem podstawowym, który zawiera 90% płodowej surowicy bydlęcej i 10% DMSO. Zamroź go w tempie jednego stopnia Celsjusza na minutę do minus 80 stopni Celsjusza, a następnie przenieś bezpośrednio do ciekłego azotu.

Po trzech dniach hodowli podczas tworzenia linii komórkowych zaczynają pojawiać się komórki polimorficzne. Po siedmiu dniach komórki rosną szybko, ponieważ zarówno liczba, jak i żywotność komórek rosły w szybkim tempie. Małe skupiska komórek są wyraźnie widoczne po 10 do 14 dniach wzrostu, kiedy stężenie komórek przekracza trzy do sześciu razy od 10 do szóstej.

W tym okresie komórki należy rozmnożyć przez podział na dwie lub trzy studzienki płytki hodowlanej. Około miesiąc później, gdy liczba komórek osiągnie od trzech do pięciu razy od 10 do siódmej, liczba jest wystarczająco wysoka, aby można było ją zachować. Kolejną ważną kwestią jest określenie fenotypów po pomyślnym wyhodowaniu komórek.

Nasze wyniki wskazują, że komórki T i NK mogą być hodowane metodą opisaną powyżej, a linie komórkowe mogą być tworzone za pomocą tej techniki, ponieważ komórki rosły przez ponad trzy miesiące w dobrym stanie. Ta metoda, ta technika, może być wykonana jeszcze bardziej. Jest łatwy do prawidłowego wykonania.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o zachowaniu zmienności PBMC. W przypadku tej procedury można zastosować dowolną metodę, taką jak zestaw do testów MTT 8, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak toksyczność linii komórek NK lub T, które można wykorzystać w immunoterapii adoptywnej. Po każdym opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się CAEBV do zbadania mechanizmu NK/T związanego z EBV, które obejmują choroby operacyjne w systemie modelu komórkowego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustanowić rozszerzenie linii komórek NK i T zgodnie z tym protokołem. Nie zapominaj, że praca z patogenem może być niezwykle niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.