Name: Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj metodę decelularyzacji i odkwaszania ślimaków myszy do zastosowań w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego. Technika ta umożliwia badanie interakcji komórek z macierzą zewnątrzkomórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Obecny projekt został sfinansowany przez University of Kansas Proof of Concept Fund. Chcielibyśmy podziękować personelowi pielęgniarskiemu w KUMC (Kansas City, KS) za pomoc w uzyskaniu ludzkiej pępowiny oraz Davidowi Jorgensenowi za pomoc w posiewie ślimaków.

Wszystkie procedury, w tym eutanazja zwierząt, zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonym protokołem Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (ACUP #2014-2234) w Centrum Medycznym Uniwersytetu Kansas (KUMC).
UWAGA: HWJC zostały wyizolowane z ludzkiej pępowiny, która została oddana przez pacjentów, którzy wyrazili świadomą zgodę, a próbki zostały użyte zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Badań Ludzkich Uniwersytetu Kansas (KU-IRB #15402).
1. Skroniowe pobieranie kości i izolacja ślimaka
<ol>
	<li>Odetnij głowę odpowiednio uśpionej, 15-tygodniowej myszy, przecinając między czaszką a pierwszym kręgiem szyjnym ostrymi nożyczkami chirurgicznymi, a następnie spryskaj głowę 70% etanolem w celu dezynfekcji (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1A).</li>
	<li>Przeciąć czaszkę na pół w płaszczyźnie środkowej strzałkowej za pomocą tej samej ostrej pary nożyczek chirurgicznych (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B-C, linie przerywane).</li>
	<li>Usuń tkankę mózgową z czaszki za pomocą kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D, grot strzałki).</li>
	<li>Zidentyfikuj kość skroniową poprzez obecność korzeni nerwu słuchowego i przedsionkowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1E-F, groty strzałek) po wewnętrznej stronie czaszki i przewodu słuchowego od zewnątrz (<silna klasa="xfig">Rysunek 1F, strzałka). Ostrożnie przeciąć czaszkę, aby odizolować kość skroniową od reszty czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). 
	UWAGA: W niektórych przypadkach możliwe jest delikatne podważenie otaczających kości czaszki od kości skroniowej bez konieczności cięcia.</li>
	<li>Włóż cienkie kleszcze do otworu przewodu słuchowego na około 5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H), aby końcówki nie groziły przebiciem ślimaka. Delikatnie rozbij kość bulli (<silna klasa="xfig">Rysunek 1H, górny zacieniony czerwony obszar), aby się złamała (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I, czerwona przerywana linia). 
	UWAGA: W razie potrzeby mikroskop preparacyjny może pomóc w tym procesie, aby zapewnić dokładne umieszczenie i manipulację narzędziami.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy podważ pozostałą część pęcherza od kości skroniowej, odsłaniając kostny błędnik ślimaka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1J, czerwone nawiasy).</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego wystarczająco dużą, aby pomieścić kość skroniową (np. 30 mm lub więcej) pod polem widzenia lunety sekcyjnej i wypełnij ją wystarczającą ilością soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby pokryć kość skroniową (np. 0,5 do 1 ml).</li>
	<li>Zanurz kość skroniową z usuniętym pęcherzem w PBS z owalnymi i okrągłymi oknami ślimaka skierowanymi do góry. 
	UWAGA: Usunięcie układu przedsionkowego ze ślimaka nie jest konieczne, ponieważ układ przedsionkowy służy dobrze jako uchwyt do manipulowania i orientowania cech ślimaka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1I i <silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Za pomocą bardzo cienkiej pary kleszczy usuń tętnicę strzemiączkową, która przechodzi przez strzemiączko.</li>
	<li>Włóż jedną końcówkę ultracienkich kleszczyków przez łuk strzemiączka, przez który przechodzi tętnica, i delikatnie unieś strzemiączko do góry. Zdeformowane strzemiączko powinno unieść się z owalnego okna.</li>
	<li>Za pomocą jednej końcówki ultracienkich kleszczyków przebij owalne i okrągłe okna.</li>
	<li>Używając strzykawki 1x wypełnionej PBS o rozmiarze 28,5 z dołączoną rurką (średnica wewnętrzna 0,28 mm, średnica zewnętrzna 0,61 mm), umieść rurkę nad owalnym okienkiem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A - B). 
	UWAGA: Otworem rurki można manipulować za pomocą bardzo cienkich kleszczy, co pomaga zapewnić dokładne umieszczenie.
	<ol>
		<li>Do każdego ślimaka należy użyć świeżej strzykawki i rurki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przez ślimak przez 5 minut należy wprowadzić 2 ml 10% antybiotyku przeciwgrzybiczego (anty-anty) i 10% penicyliny-streptomycyny (wstrzykiwacz-paciorkowca) w PBS w celu usunięcia perylimfy. Zbyt szybkie perfuzja ze zbyt dużym naciskiem spowoduje uszkodzenie drobnych struktur w ślimaku. 
	UWAGA: Ręczne napędzanie strzykawki w celu przepuszczenia płynu przez ślimak jest skuteczne, chociaż alternatywą może być użycie pompy perfuzyjnej.
	<ol>
		<li>W przypadku ręcznego perfuzji użyj pary cienkich, samozamykających się kleszczy, aby ustabilizować ślimak (<silna klasa="xfig">Ryc. 2A) podczas perfuzji, chwytając przedsionkową część kości skroniowej. 
		UWAGA: Chociaż nie jest to wymagane, pozostawia to obie ręce wolne do obsługi instrumentów; jedną ręką można kierować strzykawką (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A), podczas gdy drugą można odpowiednio ustawić rurkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
		<li>Począwszy od tego etapu, należy uważać, aby nie wystawiać ślimaka niepotrzebnie na działanie powietrza. Wprowadzenie pęcherzyków powietrza do przestrzeni płynów zablokuje krążenie płynów, a dalsze wysychanie uszkodzi drobne struktury w ślimaku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń i wyrzuć pozostałą tkankę mięśniową i fragmenty kości za pomocą cienkich kleszczy.</li>
	<li>W razie potrzeby izolowane ślimaki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w 10% roztworze antyanty-anty-anty i 10% roztworze pen-strep w PBS przez okres do siedmiu dni, z regularną wymianą roztworu antybiotyku co 48 godzin.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie ślimakowe
<ol>
	<li>Decelularyzacja
	<ol>
		<li>Dla każdego ślimaka napełnij szklaną fiolkę scyntylacyjną o pojemności 20 ml 1% roztworem dodecylosiarczanu sodu (SDS) w wodzie dejonizowanej (DI), która służy do decelularyzacji ślimaka.</li>
		<li>Odetnij końcówkę plastikowej pipety transferowej o pojemności 7 ml za pomocą żyletki, tak aby otwór był wystarczająco duży, aby mógł przejść przez niego ślimak.</li>
		<li>Za pomocą pipety transferowej delikatnie wciągnij ślimak do pipety tak, aby przechodził przez krawędź odcięcia na kilka milimetrów.</li>
		<li>Wydalić ślimak do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej 1% roztworem SDS.</li>
		<li>Wprowadzić 2 ml 1% SDS w wodzie dejonizowanej (DI) przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej.</li>
		<li>Umieścić fiolkę scyntylacyjną w rotatorze i pozwolić fiolce scyntylacyjnej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej.
		<ol>
			<li>Zmieniaj 1% roztwór SDS co 24 godziny przez okres 72 godzin. Podczas wymiany karty charakterystyki należy zachować ostrożność, aby nigdy nie wystawiać ślimaka na działanie powietrza.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Umyj ślimak trzy razy po 30 minut wodą DI. Wykonaj płukanie w tej samej fiolce scyntylacyjnej, która jest używana do ładunków SDS; Na tym etapie ślimak jest pozbawiony komórek komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwapnienie
	<ol>
		<li>Usuń pozostałą wodę demineralizowaną z fiolki scyntylacyjnej, pozostawiając tylko tyle, aby ślimak był zanurzony.</li>
		<li>Aby rozpocząć odwapnianie, dodaj 5 ml 10% kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) (0,02 M) w wodzie demineralizowanej do fiolki scyntylacyjnej zawierającej ślimak.</li>
		<li>Wprowadzić 2 ml 10% EDTA w wodzie demineralizowanej przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej.</li>
		<li>Umieścić fiolkę scyntylacyjną z powrotem w rotatorze i pozwolić fiolce scyntylacyjnej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Zmieniaj 10% roztwór EDTA co 24 godziny przez okres 72 godzin. Podczas wymiany roztworów należy zachować ostrożność, aby ślimak nie był narażony na działanie powietrza.</li>
		<li>Przepłukać ślimak 3 razy po 2 godziny za pomocą 1x PBS; na tym etapie ślimak jest odwapniony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>składowanie
	<ol>
		<li>Ślimaki należy przechowywać do 72 godzin w 10% roztworze anty-anti-anti, 10% pen-strep w PBS w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Dłuższe okresy przechowywania mogą być możliwe przy regularnych zmianach roztworu antybiotyku; Przedłużone przechowywanie przetworzonych ślimaków nie zostało jednak zatwierdzone w niniejszym protokole.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Zaopatrzenie i rozbudowa hWJC
<ol>
	<li>Izoluj hWJC zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami22. Krótko mówiąc, podziel pępowinę na 3-centymetrowe odcinki.</li>
	<li>Ostrożnie wykonaj płytkie nacięcie skalpelem wzdłuż każdego segmentu pępowiny, aby rozwinąć i odsłonić galaretkę Whartona pępowiny. Użyj kleszczy, aby usunąć naczynia krwionośne.</li>
	<li>Przemyć segmenty pępowiny dwukrotnie wystarczającą ilością PBS (np. 40 ml na szalce Petriego o średnicy 60 mm), aby zanurzyć tkankę. Drobno zmielić segmenty tkanki skalpelem. Trawić tkankę na 100 mm szalce Petriego z 50 ml pożywki trawiącej (0,2% kolagenazy typu 2, 1% penicyliny-streptomycyny, w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Eagle's Medium (DMEM) o niskiej zawartości glukozy).</li>
	<li>Umieścić tkankę w pożywce trawiącej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 50 obr./min przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C. Następnego dnia rozcieńczyć pożywkę wytrawiającą w stosunku 1:16 w 2% antybiotyko-przeciwgrzybiczym w PBS, a komórki osadu przez odwirowanie w 500 x g w temperaturze pokojowej (~ 27 °C) przez 10 minut. Wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osady w mezenchymalnym podłożu do wzrostu komórek macierzystych (MSCGM) i ponownie połączyć komórki. Komórki płytki o gęstości 7 x 103 komórki/cm2 w kolbach T-75 poddanych hodowli tkankowej. Kultura HWJC w MSCGM i rozwinięcie do przejścia 5 dla eksperymentów. 
	UWAGA: HWJC mogą być hodowane do większych kolb T (np. T-150, T-300) podczas pasażowania w celu zwiększenia wydajności hWJC do eksperymentów.</li>
</ol>
4. Wlew hWJC do ślimaków decellularyzowanych
<ol>
	<li>Przygotuj ślimaki bez komórek
	<ol>
		<li>Stosując technikę aseptyczną, umyj przechowywane ślimaki w 1x PBS trzy razy przez 30 minut każdy.</li>
		<li>Przenieść ślimaki do oddzielnych studzienek na 24-dołkowej płytce i dodać 1 ml wstępnie ogrzanego MSCGM o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Ślimaki należy inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5%CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed infuzją komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odłączanie hWJC i ponowne zawieszanie
	<ol>
		<li>Umyj hWJC w 37 °C wstępnie podgrzanym 1x PBS dwukrotnie.</li>
		<li>Dodaj tyle wstępnie podgrzanej trypsyny o temperaturze 37 °C z 0,5% EDTA, aby pokryć powierzchnię naczynia komórkowego.</li>
		<li>Inkubować hWJC przez maksymalnie 5 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 i temperaturze 37 °C.
		<ol>
			<li>Sprawdź, czy 90% komórek oderwało się od powierzchni hodowli komórkowej, oglądając komórki pod odwróconym mikroskopem. 
			UWAGA: Komórki, które poruszają się, gdy naczynie hodowlane jest delikatnie stukane, odłączyły się. Ogniwa, które pozostają nieruchome, nie odłączyły się.</li>
			<li>Delikatnie postukać w boki kolby, aby jeszcze bardziej usunąć przyczepione komórki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Stosując technikę aseptyczną, przenieś hWJC z naczynia hodowlanego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej objętość równoważną objętości MSCGM objętości trypsyny używanej do dysocjacji komórek.</li>
		<li>Osadzać hWJC przez odwirowanie przy 500 x g w temperaturze pokojowej (~ 27 °C) przez 5 minut.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić hWJC w MSCGM w stężeniu 500 000 komórek/ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja ślimaków
	<ol>
		<li>Przenieść ślimak na nową 24-dołkową płytkę za pomocą pipety transferowej.</li>
		<li>Dodaj kroplę MSCGM do każdego ślimaka, aby zapobiec wysychaniu ślimaka.</li>
		<li>Delikatnie ustaw ślimak za pomocą bardzo cienkich kleszczyków tak, aby owalne i okrągłe okienka były skierowane do góry. 
		UWAGA: Należy zachować szczególną ostrożność podczas bezpośredniego kontaktu z każdym ślimakiem, ponieważ ślimak łatwo ulega uszkodzeniu.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 z podłączonym wężem pobrać 0,2 ml ponownie zawieszonych hWJC (100 000 komórek).</li>
		<li>Za pomocą wysterylizowanych cienkich kleszczy umieść rurkę nad owalnym okienkiem.</li>
		<li>Delikatnie i powoli perfundować ślimak 0,2 ml ponownie zawieszonych hWJC za pomocą strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 podłączonej do rurki polietylenowej (średnica zewnętrzna: 0,61 mm, średnica wewnętrzna: 0,28 mm) przez około 5 minut.</li>
		<li>Po perfuzji dodać 0,8 ml wstępnie podgrzanego MSCGM o temperaturze 37 °C do studzienki zawierającej ślimak, aby zwiększyć całkowitą objętość w studzience do 1 ml.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 4.3.3-4.3.7 dla każdego ślimaka, za każdym razem używając nowej strzykawki i rurki.</li>
		<li>Umieść perfundowane ślimaki w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C i zmieniaj pożywkę trzy razy w tygodniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zbiór i konserwacja ślimaka
UWAGA: Ślimaki mogą być hodowane i zbierane w dowolnym momencie do 30 dni po perfuzji.
<ol>
	<li>Aby zachować ślimaki, utrwal 4% paraformaldehydu w 1x PBS przez noc w temperaturze 4 °C na bujanej platformie.</li>
	<li>Po utrwaleniu umyj ślimaki 1x PBS trzy razy po 5 minut każdy.</li>
	<li>Stopniowo odwadniać ślimak etanolem i klarować rozpuszczalnikiem alifatycznych węglowodorów przed zatopieniem w parafinie.</li>
	<li>Próbki należy przeciąć do grubości 10 μm za pomocą mikrotomu i zamontować na szklanych szkiełkach mikroskopowych. 
	UWAGA: Próbki są teraz gotowe do przetwarzania histologicznego lub immunohistochemicznego przy użyciu standardowych protokołów.</li>
</ol>

<ol><li>Raphael, Y., Altschuler, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+innervation+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Structure and innervation of the cochlea.</a> Brain Res Bull. 60 (5-6), 397-422 (2003).</li>
<li>LeMasurier, M., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-Cell+Mechanotransduction+and+Cochlear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification.</a> Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).</li>
<li>Neal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+counts+in+a+rat+model+of+sound+damage%3A+Effects+of+tissue+preparation+%26+identification+of+regions+of+hair+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss.</a> Hear Res. 328, 120-132 (2015).</li>
<li>Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+a+recreational+noise+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).</li>
<li>Stucken, E. Z., Hong, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss%3A+an+occupational+medicine+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective.</a> Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).</li>
<li>Dille, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus+onset+rates+from+chemotherapeutic+agents+and+ototoxic+antibiotics%3A+results+of+a+large+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Acad+Audiol%22%5BJournal%5D)">Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study.</a> J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).</li>
<li>Sajjadi, H., Paparella, M. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18675691">Meniere's disease.</a> Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).</li>
<li>House, J. W., Brackmann, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinnitus%3A+surgical+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found+Symp%22%5BJournal%5D)">Tinnitus: surgical treatment.</a> Ciba Found Symp. 85, 204-216 (1981).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Ryals, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avian+species+differences+in+susceptibility+to+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Avian species differences in susceptibility to noise exposure.</a> Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).</li>
<li>Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+inner+ear+sensory+epithelia+from+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).</li>
<li>Sekiya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+transplantation+to+the+auditory+nerve+and+cochlear+duct%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct.</a> Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).</li>
<li>Shi, F., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+replacement+of+auditory+neurons+by+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells.</a> Hear Res. 297, 106-112 (2013).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+decellularized+cochleae+as+scaffolds+for+inner+ear+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering.</a> Stem Cell Res Ther. 8, (2017).</li>
<li>Santi, P. A., Johnson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+ear+tissues+as+scaffolds+for+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).</li>
<li>Davies, D., Holley, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+alpha+3+and+alpha+6+integrins+in+the+developing+mouse+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear.</a> J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).</li>
<li>Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+matrix+in+the+formation+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear.</a> Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).</li>
<li>Goodyear, R. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrices+associated+with+the+apical+surfaces+of+sensory+epithelia+in+the+inner+ear%3A+molecular+and+structural+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity.</a> J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+Viability+and+Transfection+Efficiency+with+Human+Umbilical+Cord+Wharton%27s+Jelly+Cells+Through+Use+of+a+ROCK+Inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor.</a> Cell Reprogram. , (2014).</li>
<li>Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Photo-conversion%3A+A+second+chance+to+label+unique+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells.</a> Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+cells+from+Wharton%27s+jelly+form+neurons+and+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia.</a> Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).</li>
<li>Mellott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonviral+Reprogramming+of+Human+Wharton%27s+Jelly+Cells+Reveals+Differences+Between+ATOH1+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues.</a> Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).</li>
<li>Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+versus+sTSLIM+3D+imaging+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea.</a> J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).</li>
<li>Nonoyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+ototoxicity+of+gadoteridol+%28ProHance%29+and+gadodiamide+%28Omniscan%29+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice.</a> Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).</li>
<li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhesus+Cochlear+and+Vestibular+Functions+Are+Preserved+After+Inner+Ear+Injection+of+Saline+Volume+Sufficient+for+Gene+Therapy+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery.</a> J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).</li>
<li>Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bioactivity+of+cartilage+extracellular+matrix+in+articular+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration.</a> Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Udało nam się wykazać, że natywne komórki ślimaka mogą być usuwane ze ślimaka w procesie decelularyzacji, co pozwala na wykorzystanie ślimaka jako skomplikowanego, trójwymiarowego rusztowania tkankowego. Santi i wsp. 15 opracowało wstępną metodę decelularyzacji ślimaków i dokładnie oszacowało objętość wielu struktur ślimaka za pomocą mikroskopii świetlnej23. Tak wczesne prace posłużyły jako solidna podstawa dla prezentowanych tu technik inżynierii tkankowej i hodow...

Ślimak to skomplikowana spiralna struktura znajdująca się w kości skroniowej. Składa się z zewnętrznego błędnika kostnego i koncentrycznego, wewnętrznego błoniastego labiryntu1. Błędnik błoniasty składa się z trzech płynnych przestrzeni: Scala vestibuli, Scala media i Scala tympani1. W pożywce scala znajduje się nabłonek czuciowy, który składa się z wielu typów komórek, ale szczególnie interesujące są czuciowe komórki rzęsate (HC), które przekształcają energię mechaniczną w falach dźwiękowych na impulsy nerwowe2. Narażenie na uraz akustyczny3,4,5, medicine6, disease7,8, and aging9 może prowadzić do upośledzenia funkcji słuchowych poprzez śmierć HC. Utrata komórek włosa u ssaków jest trwała, w przeciwieństwie do ptasich HC, które mogą się regenerować po urazie10.
Różnorodne współczesne wysiłki badawcze miały na celu przywrócenie utraconych HC, chociaż konkretne podejścia eksperymentalne różnią się między sobą. Manipulacja ekspresją genów w nabłonku czuciowym i implantacja komórek macierzystych różnicujących się poza organizmem są dominującymi podejściami w tej dziedzinie, chociaż próbowano metod indukcji, które mają na celu różnicowanie komórek macierzystych w organoidy ślimakowe11,12,13. Każde z tych podejść jest albo bezpośrednio zależne od komórek macierzystych, albo od sygnałów rozwojowych wykorzystywanych przez komórki macierzyste; jednak drugim wspólnym i potencjalnie krytycznym elementem jest ECM samego ślimaka14,15.
ECM nie tylko zapewnia fizyczne wsparcie dla komórek i tkanek, które obejmuje powierzchnię do adhezji, proliferacji, przeżycia i migracji komórek, ale także odgrywa kluczową rolę w rozwoju HCs i spiralnego zwoju15,16,17. Naturalnie występujący ECM dostarcza sygnałów indukcyjnych, które mogą kierować określaniem fenotypu komórki i/lub adhezją, proliferacją i przeżyciem komórki18. W związku z tym zastosowanie ślimaka bez komórek w połączeniu z hodowanymi hWJC stanowi wyjątkową okazję do zbadania roli ECM i regeneracji HC. HWJC to łatwo dostępny, niekontrowersyjny typ komórek wyizolowany z ludzkiej pępowiny, który zachowuje się jak mezenchymalne komórki macierzyste19. HWJC wykazały zdolność do różnicowania linii komórek neurosensorycznych20,21. W związku z tym obecny protokół szczegółowo opisuje izolację, decelularyzację i perfuzję ślimaków z tusz myszy C57BL za pomocą hWJC do inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego.

<table><tbody><tr><td>Wirówka Allegra X-14R</td><td>Beckman-Coulter</td><td>B08861</td><td></td></tr><tr><td>Rurki półsztywne Intramedic</td><td>Becton Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 2000 Oscylal Shaler</td><td>Eppendorf</td><td>M1190-0002</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Ultracienkie kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>50-mililitrowe rurki stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565271</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>U-100 Strzykawka insulinowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka scyntylacyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-73</td><td></td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-049</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotykowo-przeciwgrzybicza</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-240-062</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe SuperFrost PLUS</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Clear-Rite 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-046341</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma Series II 3110 Inkubator CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-998-078</td><td></td></tr><tr><td>Mezenchymalne podłoże do wzrostu komórek macierzystych</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-3232</td><td></td></tr><tr><td>TPP T-75 Kolba</td><td>hodowlana MidSci</td><td>TP90076</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana TPP T-150</td><td>MidSci</td><td>TP90151</td><td></td></tr><tr><td>Kolba hodowlana TPP T-300</td><td>MidSci</td><td>TP90301</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony Nikon Eclipse Ts2R-FL</td><td>Instrumenty Nikon</td><td>MFA51010</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego NuAire Class II, typ A2</td><td>NuAire</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>1% roztwór SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>436143-100G</td><td></td></tr><tr><td>10% EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

U ssaków, mechanosensoryczne komórki rzęsate, które ułatwiają słyszenie, nie mają zdolności do regeneracji, co utrudnia leczenie utraty słuchu. Obecne strategie medycyny regeneracyjnej koncentrują się na przeszczepianiu komórek macierzystych lub manipulacji genetycznej otaczających komórek podporowych w uchu wewnętrznym, aby zachęcić do wymiany uszkodzonych komórek macierzystych w celu skorygowania ubytku słuchu. Jednak macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) może odgrywać istotną rolę w indukowaniu i utrzymywaniu funkcji komórek rzęsatych i nie została dobrze zbadana. Wykorzystanie ECM ślimaka jako rusztowania do hodowli dorosłych komórek macierzystych może dostarczyć unikalnych informacji na temat tego, w jaki sposób skład i architektura środowiska zewnątrzkomórkowego pomaga komórkom w utrzymaniu funkcji słuchu. W tym miejscu przedstawiamy metodę izolacji i decelularyzacji ślimaków od myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań przyjmujących perfundowane dorosłe komórki macierzyste. W obecnym protokole ślimaki są izolowane od myszy poddanych eutanazji, decellularizowane i odkamieniane. Następnie ludzkie komórki galaretowate Whartona (hWJC), które zostały wyizolowane z pępowiny, zostały ostrożnie perfundowane do każdego ślimaka. Ślimaki wykorzystano jako bioreaktory, a komórki hodowano przez 30 dni przed poddaniem ich przetwarzaniu do analizy. Ślimaki pozbawione komórek zachowały możliwe do zidentyfikowania struktury zewnątrzkomórkowe, ale nie ujawniły obecności komórek ani zauważalnych fragmentów DNA. Komórki przenikające do ślimaka zaatakowały większość wnętrza i zewnątrz ślimaka i rosły bez incydentów przez okres 30 dni. W związku z tym obecna metoda może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób ECM ślimaka wpływa na rozwój i zachowanie komórek.

Stosując przedstawione tutaj metody, poprawność decelularyzacji ślimaków oceniano poprzez badanie obecności lub braku DNA za pomocą barwienia 4',6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI). Ślimaki uznano za w pełni zdecelularyzowane, jeśli w zdecelularyzowanym ślimaku nie zidentyfikowano DNA. W charakterze kontroli pozytywnej, w celu zilustrowania struktur i komórek występujących zazwyczaj w ślimaku myszy C57BL, wykorzystano natywny ślimak z poprzedniego eksperymentu, który nie został poddany dece...

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.

Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie skutecznej metody decellularizacji i odwapniania ślimaków myszy w celu wykorzystania rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii słuchowej i tkankowej, takie jak: w jaki sposób ślimak 3D i różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na różnicowanie komórek macierzystych? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badaczowi zbadanie, w jaki sposób komórki bezpośrednio oddziałują z macierzą zewnątrzkomórkową ślimaka, tworząc nabłonek czuciowy.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ aparat do izolacji kości skroniowej i rozlewu komórek może być trudny do prawidłowej wizualizacji na podstawie wyłącznie opisów tekstowych. Aby rozpocząć tę procedurę, przetnij czaszkę na pół w płaszczyźnie strzałkowej za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych. Następnie usuń tkankę mózgową z czaszki.Następnie zidentyfikuj kość skroniową poprzez obecność korzeni nerwu słuchowego i przedsionkowego po wewnętrznej stronie czaszki i przewodu słuchowego od zewnątrz. Ostrożnie przeciąć czaszkę, aby odizolować kość skron

a-protocol-for-decellularizing-mouse-cochleae-for-inner-ear-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Opisano tutaj i porównano dwa podejścia mikrochirurgiczne do miejscowego dostarczania leków do ucha wewnętrznego pod względem wpływu na parametry słuchu, cytoarchitekturę ślimaka i ekspresję markerów stanu zapalnego.

Badanie porównawcze metod dostarczania leków ukierunkowanych do ucha wewnętrznego myszy: pęcherzyk a wstrzyknięcie przezbębenkowe

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji wychwytu 3 kDa Texas Red-labeled dextranu w słuchowych komórkach rzęsatych z funkcjonalnymi kanałami mechanotransdukcji. Ponadto dektrans o stężeniu 3–10 kDa może być stosowany do badania endocytozy we włosach i komórkach podporowych narządu Cortiego.

Znakowanie i wychwyt dekstranu w żywych i funkcjonalnych mysich komórkach rzęsatych ślimaka

W tym badaniu prezentujemy metodę obrazowania w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopii konfokalnej do obserwacji komórek poruszających się w kierunku uszkodzonej tkanki poprzez inkubację ex vivo z nabłonkiem ślimaka zawierającym narząd Cortiego.

Obrazowanie poklatkowe żywych komórek in vitro w celu zbadania migracji komórek w kierunku narządu Cortiego

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Ten protokół, przeznaczony dla początkujących użytkowników tkanek ucha wewnętrznego myszy, szczegółowo opisuje etapy przetwarzania uszu wewnętrznego myszy na różnych etapach rozwoju w celu barwienia immunologicznego sekcji.

Kriosekcja i barwienie immunologiczne tkanki ucha wewnętrznego myszy: od stadium embrionalnego do dorosłego

Poznaj metodę decelularyzacji i odkwaszania ślimaków myszy do zastosowań w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego. Technika ta umożliwia badanie interakcji komórek z macierzą zewnątrzkomórkową.

Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego

Przeglądaj więcej filmów