Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego
1 stycznia 2018
Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie skutecznej metody decellularizacji i odwapniania ślimaków myszy w celu wykorzystania rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii słuchowej i tkankowej, takie jak: w jaki sposób ślimak 3D i różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na różnicowanie komórek macierzystych? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badaczowi zbadanie, w jaki sposób komórki bezpośrednio oddziałują z macierzą zewnątrzkomórkową ślimaka, tworząc nabłonek czuciowy.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ aparat do izolacji kości skroniowej i rozlewu komórek może być trudny do prawidłowej wizualizacji na podstawie wyłącznie opisów tekstowych. Aby rozpocząć tę procedurę, przetnij czaszkę na pół w płaszczyźnie strzałkowej za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych. Następnie usuń tkankę mózgową z czaszki.
Następnie zidentyfikuj kość skroniową poprzez obecność korzeni nerwu słuchowego i przedsionkowego po wewnętrznej stronie czaszki i przewodu słuchowego od zewnątrz. Ostrożnie przeciąć czaszkę, aby odizolować kość skroniową od pozostałej części czaszki. Następnie włóż cienkie kleszcze do otworu kanału słuchowego na około pięć milimetrów, aby końcówki nie groziły przebiciem ślimaka.
Delikatnie rozłam kość bola, aby się złamała. Za pomocą cienkich kleszczy podważ pozostałą część bola z kości skroniowej, odsłaniając kostny błędnik ślimaka. Następnie zanurz kość skroniową w PBS z owalnymi i okrągłymi okienkami ślimaka skierowanymi do góry.
Za pomocą ultracienkiej pary kleszczyków usuń tętnicę strzemiączkową, która przechodzi przez strzemiączko. Następnie przełóż jedną końcówkę ultracienkich kleszczyków przez łuk strzemiączka, przez który przechodzi tętnica, i delikatnie unieś strzemiączko do góry. Następnie przebij owalne i okrągłe okna.
Następnie umieść rurkę, która jest podłączona do wypełnionej PBS strzykawki o rozmiarze 28,5 nad owalnym okienkiem. Obfite dwa milimetry 10% antybiotyku-atimykotycznego i 10% penicyliny-streptomycyny w PBS przez ślimak przez pięć minut, aby usunąć perylimfę. Następnie usuń i wyrzuć pozostałą tkankę mięśniową i fragmenty kości.
W celu decelularyzacji, za pomocą pipety transferowej delikatnie wciągnij ślimak do pipety, tak aby przeszedł przez odciętą krawędź o kilka milimetrów. Następnie wydalić ślimak do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej 1% roztworem SDS. Wprowadzić dwa mililitry 1% SDS w wodzie dejonizowanej przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej.
Umieść fiolkę scyntylacyjną w rotatorze i pozwól jej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Wymieniaj na świeży roztwór 1% SDS co 24 godziny przez okres 72 godzin i uważaj, aby nie wystawiać ślimaka na działanie powietrza podczas wymiany roztworu. Następnie umyj ślimak trzy razy w tej samej fiolce scyntylacyjnej przez 30 minut w wodzie DI.
Na tym etapie ślimak powinien zostać zdecelularyzowany. W celu odwapnienia usuń pozostałą wodę demineralizowaną z fiolki scyntylacyjnej, pozostawiając tylko tyle, aby ślimak był zanurzony. Aby rozpocząć odwapnianie, dodaj pięć mililitrów 10% EDTA i wody DI do fiolki scyntylacyjnej zawierającej ślimak.
Wprowadzić dwa mililitry 10% EDTA w wodzie dejonizowanej przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej. Umieść fiolkę scyntylacyjną z powrotem w rotatorze i pozwól fiolce scyntylacyjnej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Zmieniaj roztwór 10%EDTA co 24 godziny przez okres 72 godzin.
Podczas zmiany roztworów należy zachować ostrożność, aby ślimak nie był wystawiony na działanie powietrza. Następnie przepłucz ślimak trzy razy przez dwie godziny, za pomocą PBS. Na tym etapie ślimak powinien zostać odwapniony.
Przed podaniem komórek należy rozpocząć inkubację zdeceluloizowanego i odwapnionego ślimaka w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Aby obfitość ślimaka, dodaj kroplę MSCGM do każdego ślimaka, aby zapobiec wysychaniu ślimaka. Przenieść je do nowej płytki 24-dołkowej za pomocą pipety do przenoszenia.
Delikatnie ustaw ślimak za pomocą bardzo cienkich kleszczyków tak, aby owalne i okrągłe okienka były skierowane do góry. Następnie za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 G z podłączonymi rurkami, pobrać 0,2 mililitra ponownie zawieszonych ludzkich komórek galaretki Whartona. Następnie umieść rurkę nad owalnym okienkiem za pomocą wysterylizowanych drobnych kleszczyków.
Delikatnie i powoli napełnij ślimak 0,2 mililitra ponownie zawieszonych ludzkich komórek galaretki Whartona w ciągu pięciu minut. Ten krok obfitości jest ważny. Skuteczna obfitość płynów przez ślimak ma ogromny wpływ na wynik tego protokołu.
Po obfitości dodaj 0,8 mililitra wstępnie podgrzanego MSCGM o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienki zawierającej ślimak, aby zwiększyć całkowitą objętość do jednego mililitra. Powtórz procedurę dla każdego ślimaka. Za każdym razem używając świeżej strzykawki i rurki.
Umieść obfity ślimak w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmieniaj pożywkę trzy razy w tygodniu. Pokazano tutaj udaną decelularyzację i odwapnienie ślimaka myszy bez wstrzykniętych komórek. Ogólnie rzecz biorąc, anatomia ślimaka jest zachowana z pustkami pozostawionymi bez delikatnych przebarwień.
Oto reprezentatywne wyniki pomyślnie wyhodowanych ludzkich komórek galaretki Whartona na rusztowaniu ślimaka. Obfite, wilgotne zabarwienie obserwuje się w całym ślimaku i na zewnętrznej powierzchni kostnej. Bliższe przyjrzenie się poszczególnym zwojom ujawnia, że drobne struktury ślimaka są zachowane po decelularyzacji i odwapnieniu, a wstrzyknięte komórki są przyłączone do macierzy zewnątrzkomórkowej natywnego ślimaka i/lub wchodzą z nią w interakcję.
Badano również decelularyzację w kolejnych hodowlach komórkowych za pomocą barwienia H&E. Ślimak bez komórek nie zawierał żadnej z komórek ślimaka natywnego, ale zachowuje większość anatomii narządu Cortiego, ponieważ macierz zewnątrzkomórkowa pozostaje. Wstrzyknięte do hodowanych komórek można zaobserwować przez narząd Cortiego, wchodząc w interakcję z pozbawioną komórek macierzą zewnątrzkomórkową.
Po opanowaniu, obfitość komórek w ślimaku bez komórek może zająć około 10 do 15 minut, jeśli ślimak jest już przygotowany, a wymagane narzędzia są odpowiednio rozłożone. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się ze ślimakiem z ostrożnością, ponieważ jest on delikatny. Ważne jest również, aby unikać wprowadzania powietrza do ślimaka, ponieważ pęcherzyki będą blokować przepływ płynów podczas obfitości.
Ta ogólna procedura może być stosowana do ślimaków innych gatunków, a także można wstrzykiwać szeroką gamę typów komórek. Konkretne czasy decellularizacji i odwapnienia będą się prawdopodobnie różnić, ale podstawowe koncepcje pozostaną takie same. Dr Peter Santi z University of Minnesota początkowo opracował technikę decelularyzacji, którą zmodyfikowaliśmy dla tego protokołu.
Mamy nadzieję, że uda nam się udostępnić naszą technikę i hodowlę komórkową na rusztowaniu ślimakowym innym inżynierom tkankowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie izolować, decellularizować i odkamieniać kości skroniowe przed wstrzyknięciem komórek do wykorzystania w eksperymentach hodowlanych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia skuteczną metodę decelularyzacji i dekalcyfikacji ślimaków myszy w celu ich wykorzystania jako rusztowań w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Technika ta umożliwia badaczom analizę interakcji między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową ślimaka, co jest kluczowe dla zrozumienia procesu formowania się nabłonka sensorycznego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Badania nad słuchem
- Interakcje komórkowe
Wstęp
- Decelularyzacja i dekalcyfikacja są niezbędne do tworzenia rusztowań.
- Zrozumienie budowy ślimaka jest kluczowe dla badań nad uchem wewnętrznym.
- Różnicowanie komórek macierzystych jest wpływane przez macierz zewnątrzkomórkową.
- Metody wizualne poprawiają zrozumienie złożonych procedur.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody przygotowania rusztowania ślimaka.
- Ułatwienie badań nad oddziaływaniami komórek ślimaka.
- Rozszerzenie wiedzy w dziedzinach inżynierii słuchu i tkankowej.
Zastosowane metody
- Izolacja kości skroniowej z czaszki.
- Decelularyzacja ślimaków.
- Proces dekalcyfikacji w celu przygotowania rusztowania.
- Wizualna demonstracja procedury dla przejrzystości przekazu.
Główne wyniki
- Skuteczna decelularyzacja i dekalcyfikacja ślimaków myszy.
- Głębsze zrozumienie oddziaływań między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową.
- Udoskonalone metody badania formowania się nabłonka sensorycznego.
- Pomoce wizualne znacząco ułatwiają zrozumienie procedury.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie w badaniach nad uchem wewnętrznym.
- Otwiera ona możliwości badania zachowania komórek macierzystych w rusztowaniach ślimakowych.
- Demonstracje wizualne są kluczowe w przypadku złożonych procedur biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym z sektora biofarmaceutycznego generowanie fizjologicznie istotnych rusztowań ślimakowych do badania interakcji komórek macierzystych z natywną macierzą zewnątrzkomórkową, co wspiera walidację celów w medycynie regeneracyjnej słuchu. Poprzez zachowanie architektury macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym usunięciu komponentów komórkowych, metoda ta zapewnia zdefiniowany system pozwalający na ograniczenie ryzyka w zakresie hipotez mechanistycznych dotyczących zachowania komórek pośredniczonego przez macierz w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego. Podejście to wspiera rozwój modeli przedklinicznych dla terapii utraty słuchu, umożliwiając kontrolowaną ocenę dynamiki komórka-rusztowanie w trójwymiarowym systemie istotnym dla przebiegu choroby.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne dotyczące wpływu macierzy zewnątrzkomórkowej na różnicowanie komórek macierzystych oraz tworzenie nabłonka sensorycznego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia biologiczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych poprzez odizolowanie efektów specyficznych dla macierzy od zmiennych komórkowych w kontrolowanym systemie rusztowaniowym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia przygotowanie standaryzowanych, powtarzalnych systemów biologicznych do ilościowej oceny inwazji komórek, proliferacji oraz oddziaływań z macierzą.
- Wartość operacyjna: Wspiera skalowalność testów i ponowne wykorzystanie platformy dzięki spójnym wynikom decelularyzacji i dekalcyfikacji w wielu ślimakach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ustanawia ciągłość systemu istotnego dla przebiegu choroby – od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną – poprzez zachowanie natywnej architektury ślimaka.
- Wartość operacyjna: Ułatwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem analizy ryzyka, umożliwiając podłużną obserwację interakcji między komórkami a rusztowaniem w trakcie 30-dniowych okresów hodowli.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania poprzez dostarczanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej po izolacji, co umożliwia weryfikację hipotez na etapach identyfikacji związków wiodących przed badaniami przedklinicznymi skuteczności.
- Biologia odkryć: Wspiera wyjaśnianie szlaków sygnałowych i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniego badania oddziaływań między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową bez zakłóceń wywołanych przez debris komórkowy.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu przygotowaniu rusztowania, które zachowuje integralność strukturalną niezbędną do wiarygodnej oceny związków lub komórek.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych poprzez badanie głębokości inwazji komórek, tempa proliferacji oraz wzorców oddziaływań z macierzą, obserwowalnych za pomocą barwienia i obrazowania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez utrzymanie struktury organu Cortiego, co umożliwia ekstrapolację wyników do środowisk zbliżonych do in vivo.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę rusztowań możliwą do ponownego wykorzystania dla różnych typów komórek i gatunków, co redukuje powtarzalne wysiłki związane z izolacją w programach inżynierii tkankowej słuchu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w zachowaniu komórek pośredniczonym przez macierz pozakomórkową.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zdefiniowanym protokołom decelularyzacji (72-godzinna rotacja w SDS) i dekalcyfikacji (72-godzinna rotacja w EDTA).
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki umożliwieniu wczesnej oceny odpowiedzi komórkowych zależnych od macierzy, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów regeneracji słuchu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja kandydatów z zakresu komórek macierzystych lub modulatorów macierzy z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne odczyty z rusztowań (scaffolds).
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna w zakresie mikrosurgicalnej izolacji kości skroniowej oraz sterylnych technik perfuzji komórek.
- Wymagane instrumentarium obejmuje ultrapunktowe pincety, pipety transferowe, rotatory oraz sterylne systemy perfuzji strzykawkowej.
- Standaryzacja międzyzespołowa wymaga przestrzegania harmonogramów wymiany roztworów oraz unikania ekspozycji na powietrze podczas decelularyzacji/dekalcyfikacji.
- Kwestie adaptacyjne obejmują dostosowanie czasu trwania procedur w zależności od gatunku oraz walidację integralności rusztowania dla innych typów komórek niż MSC pochodzące z galaretki Whartona.
- Ograniczenia praktyczne obejmują kruchość ślimaka, co wymaga ostrożnego obchodzenia się z tkanką w celu zapobieżenia uszkodzeniom strukturalnym podczas izolacji i perfuzji.
