Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego
January 1st, 2018
Celem tego protokołu jest zademonstrowanie skutecznej metody decelularyzacji i odkamieniania ślimaków myszy w celu wykorzystania ich jako rusztowań do zastosowań inżynierii tkankowej.
Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie skutecznej metody decellularizacji i odwapniania ślimaków myszy w celu wykorzystania rusztowania do zastosowań w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii słuchowej i tkankowej, takie jak: w jaki sposób ślimak 3D i różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na różnicowanie komórek macierzystych? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona badaczowi zbadanie, w jaki sposób komórki bezpośrednio oddziałują z macierzą zewnątrzkomórkową ślimaka, tworząc nabłonek czuciowy.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ aparat do izolacji kości skroniowej i rozlewu komórek może być trudny do prawidłowej wizualizacji na podstawie wyłącznie opisów tekstowych. Aby rozpocząć tę procedurę, przetnij czaszkę na pół w płaszczyźnie strzałkowej za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych. Następnie usuń tkankę mózgową z czaszki.
Następnie zidentyfikuj kość skroniową poprzez obecność korzeni nerwu słuchowego i przedsionkowego po wewnętrznej stronie czaszki i przewodu słuchowego od zewnątrz. Ostrożnie przeciąć czaszkę, aby odizolować kość skroniową od pozostałej części czaszki. Następnie włóż cienkie kleszcze do otworu kanału słuchowego na około pięć milimetrów, aby końcówki nie groziły przebiciem ślimaka.
Delikatnie rozłam kość bola, aby się złamała. Za pomocą cienkich kleszczy podważ pozostałą część bola z kości skroniowej, odsłaniając kostny błędnik ślimaka. Następnie zanurz kość skroniową w PBS z owalnymi i okrągłymi okienkami ślimaka skierowanymi do góry.
Za pomocą ultracienkiej pary kleszczyków usuń tętnicę strzemiączkową, która przechodzi przez strzemiączko. Następnie przełóż jedną końcówkę ultracienkich kleszczyków przez łuk strzemiączka, przez który przechodzi tętnica, i delikatnie unieś strzemiączko do góry. Następnie przebij owalne i okrągłe okna.
Następnie umieść rurkę, która jest podłączona do wypełnionej PBS strzykawki o rozmiarze 28,5 nad owalnym okienkiem. Obfite dwa milimetry 10% antybiotyku-atimykotycznego i 10% penicyliny-streptomycyny w PBS przez ślimak przez pięć minut, aby usunąć perylimfę. Następnie usuń i wyrzuć pozostałą tkankę mięśniową i fragmenty kości.
W celu decelularyzacji, za pomocą pipety transferowej delikatnie wciągnij ślimak do pipety, tak aby przeszedł przez odciętą krawędź o kilka milimetrów. Następnie wydalić ślimak do fiolki scyntylacyjnej wypełnionej 1% roztworem SDS. Wprowadzić dwa mililitry 1% SDS w wodzie dejonizowanej przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej.
Umieść fiolkę scyntylacyjną w rotatorze i pozwól jej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Wymieniaj na świeży roztwór 1% SDS co 24 godziny przez okres 72 godzin i uważaj, aby nie wystawiać ślimaka na działanie powietrza podczas wymiany roztworu. Następnie umyj ślimak trzy razy w tej samej fiolce scyntylacyjnej przez 30 minut w wodzie DI.
Na tym etapie ślimak powinien zostać zdecelularyzowany. W celu odwapnienia usuń pozostałą wodę demineralizowaną z fiolki scyntylacyjnej, pozostawiając tylko tyle, aby ślimak był zanurzony. Aby rozpocząć odwapnianie, dodaj pięć mililitrów 10% EDTA i wody DI do fiolki scyntylacyjnej zawierającej ślimak.
Wprowadzić dwa mililitry 10% EDTA w wodzie dejonizowanej przez ślimak w fiolce scyntylacyjnej za pomocą pipety transferowej. Umieść fiolkę scyntylacyjną z powrotem w rotatorze i pozwól fiolce scyntylacyjnej obracać się z prędkością 10 obr./min przez 72 godziny w temperaturze pokojowej. Zmieniaj roztwór 10%EDTA co 24 godziny przez okres 72 godzin.
Podczas zmiany roztworów należy zachować ostrożność, aby ślimak nie był wystawiony na działanie powietrza. Następnie przepłucz ślimak trzy razy przez dwie godziny, za pomocą PBS. Na tym etapie ślimak powinien zostać odwapniony.
Przed podaniem komórek należy rozpocząć inkubację zdeceluloizowanego i odwapnionego ślimaka w inkubatorze do hodowli komórkowych o stężeniu 5% dwutlenku węgla i temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej godzinę. Aby obfitość ślimaka, dodaj kroplę MSCGM do każdego ślimaka, aby zapobiec wysychaniu ślimaka. Przenieść je do nowej płytki 24-dołkowej za pomocą pipety do przenoszenia.
Delikatnie ustaw ślimak za pomocą bardzo cienkich kleszczyków tak, aby owalne i okrągłe okienka były skierowane do góry. Następnie za pomocą sterylnej strzykawki insulinowej o rozmiarze 28,5 G z podłączonymi rurkami, pobrać 0,2 mililitra ponownie zawieszonych ludzkich komórek galaretki Whartona. Następnie umieść rurkę nad owalnym okienkiem za pomocą wysterylizowanych drobnych kleszczyków.
Delikatnie i powoli napełnij ślimak 0,2 mililitra ponownie zawieszonych ludzkich komórek galaretki Whartona w ciągu pięciu minut. Ten krok obfitości jest ważny. Skuteczna obfitość płynów przez ślimak ma ogromny wpływ na wynik tego protokołu.
Po obfitości dodaj 0,8 mililitra wstępnie podgrzanego MSCGM o temperaturze 37 stopni Celsjusza do studzienki zawierającej ślimak, aby zwiększyć całkowitą objętość do jednego mililitra. Powtórz procedurę dla każdego ślimaka. Za każdym razem używając świeżej strzykawki i rurki.
Umieść obfity ślimak w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 stopni Celsjusza i zmieniaj pożywkę trzy razy w tygodniu. Pokazano tutaj udaną decelularyzację i odwapnienie ślimaka myszy bez wstrzykniętych komórek. Ogólnie rzecz biorąc, anatomia ślimaka jest zachowana z pustkami pozostawionymi bez delikatnych przebarwień.
Oto reprezentatywne wyniki pomyślnie wyhodowanych ludzkich komórek galaretki Whartona na rusztowaniu ślimaka. Obfite, wilgotne zabarwienie obserwuje się w całym ślimaku i na zewnętrznej powierzchni kostnej. Bliższe przyjrzenie się poszczególnym zwojom ujawnia, że drobne struktury ślimaka są zachowane po decelularyzacji i odwapnieniu, a wstrzyknięte komórki są przyłączone do macierzy zewnątrzkomórkowej natywnego ślimaka i/lub wchodzą z nią w interakcję.
Badano również decelularyzację w kolejnych hodowlach komórkowych za pomocą barwienia H&E. Ślimak bez komórek nie zawierał żadnej z komórek ślimaka natywnego, ale zachowuje większość anatomii narządu Cortiego, ponieważ macierz zewnątrzkomórkowa pozostaje. Wstrzyknięte do hodowanych komórek można zaobserwować przez narząd Cortiego, wchodząc w interakcję z pozbawioną komórek macierzą zewnątrzkomórkową.
Po opanowaniu, obfitość komórek w ślimaku bez komórek może zająć około 10 do 15 minut, jeśli ślimak jest już przygotowany, a wymagane narzędzia są odpowiednio rozłożone. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się ze ślimakiem z ostrożnością, ponieważ jest on delikatny. Ważne jest również, aby unikać wprowadzania powietrza do ślimaka, ponieważ pęcherzyki będą blokować przepływ płynów podczas obfitości.
Ta ogólna procedura może być stosowana do ślimaków innych gatunków, a także można wstrzykiwać szeroką gamę typów komórek. Konkretne czasy decellularizacji i odwapnienia będą się prawdopodobnie różnić, ale podstawowe koncepcje pozostaną takie same. Dr Peter Santi z University of Minnesota początkowo opracował technikę decelularyzacji, którą zmodyfikowaliśmy dla tego protokołu.
Mamy nadzieję, że uda nam się udostępnić naszą technikę i hodowlę komórkową na rusztowaniu ślimakowym innym inżynierom tkankowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skutecznie izolować, decellularizować i odkamieniać kości skroniowe przed wstrzyknięciem komórek do wykorzystania w eksperymentach hodowlanych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół przedstawia skuteczną metodę decelularyzacji i dekalcyfikacji ślimaków mysich w celu wykorzystania ich jako szkieletów w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Technika ta pozwala badaczom na badanie interakcji między komórkami a pozakomórkową matrycą ślimakową, co jest kluczowe dla zrozumienia formowania się nabłonka zmysłowego.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Inżynieria tkankowa
- Badania słuchu
- Interakcje komórkowe
Tło
- Decelularyzacja i dekalcyfikacja są niezbędne do stworzenia szkieletów.
- Rozumienie struktury ślimakowej jest istotne dla badań nad uchom wewnętrznym.
- Różnicowanie komórek macierzystych jest wpływane przez matrycę pozakomórkową.
- Metody wizualne poprawiają zrozumienie złożonych procedur.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody przygotowania szkieletu ślimakowego.
- Ułatwienie badań nad interakcjami komórek ślimakowych.
- Poszerzenie wiedzy w dziedzinie inżynierii tkankowej i słuchu.
Zastosowane metody
- Izolacja kości skroniowej z czaszki.
- Decelularyzacja ślimaków.
- Proces dekalcyfikacji do przygotowania szkieletu.
- Wizyjna demonstracja procedury dla jasności.
Główne wyniki
- Sukces w decelularyzacji i dekalcyfikacji ślimaków mysich.
- Poprawione zrozumienie interakcji komórka-matryca pozakomórkowa.
- Ulepszone metody badania formowania się nabłonka zmysłowego.
- Pomoce wizualne znacząco poprawiają zrozumienie procedury.
Wnioski
- Ta metoda dostarcza cennego narzędzia do badań nad uchom wewnętrznym.
- Otwierają drogi do badania zachowania komórek macierzystych w szkieletach ślimakowych.
- Demonstracje wizualne są kluczowe dla złożonych procedur biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to generate physiologically relevant cochlear scaffolds for studying stem cell interactions with native extracellular matrix, supporting target validation in auditory regenerative medicine. By preserving extracellular matrix architecture while removing cellular components, the method provides a defined system to de-risk mechanistic hypotheses about matrix-mediated cell behavior in inner ear tissue engineering. The approach supports preclinical model development for hearing loss therapeutics by allowing controlled evaluation of cell-scaffold dynamics in a 3D disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses regarding extracellular matrix influence on stem cell differentiation and sensory epithelium formation.
- Operational Value: Enables biological de-risking of targets by isolating matrix-specific effects from cellular variables in a controlled scaffold system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, reproducible biological systems for quantitative assessment of cell invasion, proliferation, and matrix interaction.
- Operational Value: Supports assay scalability and platform reuse through consistent decellularization and decalcification outputs across multiple cochleae.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Establishes disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation by maintaining native cochlear architecture.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal observation of cell-scaffold interactions over 30-day culture periods.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing extracellular matrix scaffolds post-isolation, enabling hypothesis testing in lead identification stages before preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking by allowing direct study of cell-extracellular matrix interactions without confounding cellular debris.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized scaffold preparation that preserves structural integrity for reliable compound or cell evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements via cell invasion depth, proliferation rates, and matrix interaction patterns observable through staining and imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining organ of Corti structure, enabling extrapolation to in vivo-like environments.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable scaffold platform applicable across cell types and species, reducing redundant isolation efforts in auditory tissue engineering programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduction of mechanistic ambiguity in extracellular matrix-mediated cell behavior.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined decellularization (72-hour SDS rotation) and decalcification (72-hour EDTA rotation) protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling early assessment of matrix-dependent cell responses, reducing late-stage biological risk in auditory regenerative programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of stem cell or matrix-modulating candidates based on scaffold-based functional readouts.
Implementation Considerations
- Required expertise in microsurgical temporal bone isolation and sterile cell perfusion techniques.
- Instrumentation needs include ultra-fine forceps, transfer pipets, rotators, and sterile syringe perfusion systems.
- Cross-team standardization requires adherence to solution exchange schedules and air-exposure avoidance during decellularization/decaltification.
- Adaptation considerations include species-specific timing adjustments and validation of scaffold integrity for alternative cell types beyond Wharton's jelly-derived MSCs.
- Practical limitations include cochlear fragility necessitating careful handling to prevent structural damage during isolation and perfusion.
