Name: Synteza i ocena mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia na bazie rutenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj syntezę i oczyszczanie analogu rutenowego inhibitora wychwytu wapnia w mitochondriach. Ta metoda biochemiczna umożliwia uzyskanie produktu dziesięciokrotnie skuteczniejszego niż dostępne komercyjnie opcje.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Cornell University. W pracy wykorzystano Cornell Center for Materials Research Shared Facilities, które są wspierane przez program NSF MRSEC (Grant DMR-1120296). S.R.N. dziękuje za wsparcie ze strony stypendium NSF Graduate Research Fellowship (Grant DGE-1650441) oraz dr Dave'a Holowki za pomoc w eksperymentach z wapniem. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autora (autorów) i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy National Science Foundation.

UWAGA: W tej syntezie stosuje się skoncentrowane kwasy i zasady. Podczas przeprowadzania reakcji należy stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa, w tym stosowanie kontroli technicznej (wyciąg) i środków ochrony indywidualnej (PPE), w tym okularów ochronnych, rękawic, fartucha laboratoryjnego, spodni o pełnej długości i butów z zakrytymi palcami.
1. Przygotowanie [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
<ol>
	<li>Synteza [Ru(NH3)5Cl]Cl2 12
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1,00 g RuCl3·nH2O(40% wagowo Ru, 4,1 mmol) w 5 mlH2O. Schłodzić ciemnobrązowy roztwór do temperatury 0 °C w łaźni lodowej. Dodać 11 ml (0,23 mola) 80% roztworu hydratu hydrazyny w kroplach. Początkowa reakcja będzie energiczna z gazem wydzielającym, w wyniku czego powstanie brązowy roztwór. Pozostaw powstały roztwór mieszać w temperaturze pokojowej przez 16 godzin; Ostatecznym rozwiązaniem będzie ciemnoczerwony. 
		Uwaga: Hydrazyna jest bardzo toksyczna i rakotwórcza. Dodatkowo bezwodne formy tego odczynnika są wybuchowe. Jak zawsze, podczas obsługi należy używać odpowiednich środków ochrony osobistej i dygestoriów. Nie należy koncentrować tych roztworów do suchości.</li>
		<li>Do tego roztworu dodaj około 5-10 ml stężonego HCl, aby dostosować pH do 2. W tym momencie roztwór będzie miał kolor żółto-brązowy.</li>
		<li>Podgrzać ten roztwór w temperaturze 105 °C, mieszając przez 1-2 godziny. Żółte ciało stałe wytrąci się z roztworu. Gdy nie tworzy się już widoczny osad, zdejmij z ognia.</li>
		<li>Pozostawić mieszaninę reakcyjną do ostygnięcia do temperatury pokojowej, a następnie umieścić w łaźni lodowej o temperaturze 0 °C na 10 minut. Zebrać żółte ciało stałe przez filtrację próżniową i przemyć po 5 ml etanolu i eteru dietylowego.</li>
		<li>Całkowicie rozpuść surowy produkt w 15-25 ml gorącej wody. Schłodzić 10 ml stężonego roztworu HCl w kolbie filtracyjnej, umieszczając ją w łaźni lodowej. Przefiltrować żółty roztwór do schłodzonego roztworu HCl w celu wywołania wytrącania się bladożółtego, czystego ciała stałego. Przefiltrować ten osad i przemyć po 5 ml 0,5 M HCl, etanolu i eteru.</li>
		<li>Scharakteryzować związek za pomocą spektroskopii w podczerwieni. Sprawdź czystość, określając częstotliwości rozciągania na 3226 cm-1, 1604 cm-1, 1297 cm-1 i 801 cm-1. Powszechne drobne zanieczyszczenie na wysokości 2069 cm-1 przypisuje się [Ru(NH3)5N2]Cl3.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Synteza [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
	<ol>
		<li>Rozpuścić 100 mg (0,34 mmol) [Ru(NH3)5Cl]Cl2 w 50 ml 1 M NH4OH w okrągłodennym zbiorniku ciśnieniowym o grubych ściankach. Luźno zakryć kolbę korkiem i podgrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 75 °C przez 6 godzin. Zdejmij z ognia i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 4 dni, aby uzyskać ciemnozielony roztwór. 
		Ostrożność! Podgrzanie szczelnego naczynia powoduje wzrost ciśnienia. Upewnij się, że używasz odpowiednich naczyń szklanych odpornych na ciśnienie. W tej reakcji celem uszczelnienia naczynia jest zminimalizowanie strat gazowego NH3. W związku z tym należy umieścić korek luźno, aby umożliwić uwolnienie nadmiernego ciśnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie metodą chromatografii kationowymiennej
	<ol>
		<li>W zlewce o pojemności 25 ml zawiesić 5 g żywicy kationowymiennej (np. Dowex 50WX2 200-400 mesh (forma H+)) w 10 ml 0,1 M HCl.</li>
		<li>Załaduj tę zawiesinę do kolumny o pojemności 10 ml (średnica 10 mm, wysokość 15 cm) umieszczonej w zbiorniku rozpuszczalnika o pojemności 50 ml. Przemyć żywicę około 20-30 ml 0,1 M HCl, aż eluat stanie się bezbarwny.</li>
		<li>Powrócić do zielonego roztworu reakcyjnego wyizolowanego w kroku 1.2.1. Do tego roztworu dodaj skoncentrowany HCl, aby dostosować pH do 2, w którym to momencie kolor roztworu zmieni się na brązowy.</li>
		<li>Zakwaszony roztwór należy załadować do kolumny z żywicą kationowymienną przygotowaną w kroku 1.3.2, delikatnie pipetując go na wierzch żywicy. Pozwól eluatowi całkowicie spłynąć i kontynuuj ładowanie roztworu. Powtarzaj ten proces, aż zostanie dodany cały roztwór. Wierzch żywicy będzie ciemnobrązowy/. Żywica nieznacznie zmniejszy swoją objętość.</li>
		<li>Użyj szklanych koralików, aby przykryć górną część żywicy. Zapobiegnie to naruszeniu żywicy podczas dodawania nowych roztworów.</li>
		<li>Eluować kolumnę za pomocą 20 ml 1 M HCl.</li>
		<li>Eluować kolumnę o zwiększonym stężeniu HCl wynoszącym 1,5 M (≈ 50 ml). Żółty roztwór zacznie schodzić z kolumny. Zwiększyć stężenie HCl do 2 M i kontynuować elucję, aż eluat stanie się bezbarwny lub bardzo bladozielono-żółty. Do tego procesu wymagana będzie całkowita objętość 150-200 ml.</li>
		<li>Zwiększ stężenie HCl do 2,5 M (20-50 ml). Zebrać eluat w postaci frakcji w probówkach. Zwiększenie do 3 M HCl. Produkt będzie wymywał się z kolumny w postaci zielono-brązowego roztworu. Czerwono-brązowa frakcja może również zacząć schodzić z kolumny. Ponieważ frakcje te są utlenionymi czerwonymi zanieczyszczeniami rutenu, nie łączą się z frakcjami zielono-brązowymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka i weryfikacja czystości [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5
	<ol>
		<li>Zbadać wszystkie frakcje z kroku 1.3.8 za pomocą spektroskopii UV-vis. Aby wykonać to zadanie, należy dodać 100 μL danej frakcji do 2 ml 3 M NH3 i przeanalizować za pomocą spektroskopii UV-vis. Frakcje zawierające czysty produkt będą miały duży zakres absorbancji przy 360 nm i mniej intensywną absorbancję przy 600 nm. Absorpcja przy 480 lub 533 nm wskazuje odpowiednio na utlenione zanieczyszczenia czerwieni rutenowej i czerwieni rutenowej.</li>
		<li>Frakcje basenowe zawierające czysty produkt i odparować roztwór do sucha przez odparowanie obrotowe. Produkt zostanie wyizolowany w postaci zielono-brązowego ciała stałego. Plony są zwykle rzędu 5-15 mg (10-20% wydajności). Monokryształy, nadające się do dyfrakcji rentgenowskiej, można otrzymać przez dyfuzję par etanolu do wodnych roztworów związku.</li>
		<li>Aby zweryfikować czystość, należy przeanalizować związek za pomocą spektroskopii UV-vis w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,4 (PBS). Czystość można ocenić, biorąc pod uwagę stosunek intensywności pików 360 nm i 600 nm. Stosunek ten wynosi 31 dla czystego związku. W przypadku zanieczyszczonych związków stosunek ten będzie mniejszy.</li>
		<li>Analizować próbkę w stanie stałym za pomocą spektroskopii w podczerwieni. Pasma diagnostyczne znajdują się na 3234 cm-1, 3151 cm-1, 1618 cm-1, 1313 cm-1 i 815 cm-1. Typowe pasma zanieczyszczeń są widoczne na 1762 cm-1 i 1400 cm-1, charakterystyczne dla NH4Cl. Czerwień rutenu można zidentyfikować po pasmach na 1404 cm-1, 1300 cm-1, 1037 cm-1 i 800 cm-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena hamowania mitochondrialnego wychwytu wapnia metodą spektroskopii fluorescencyjnej 
	Ostrożność! W poniższych procedurach wykorzystuje się komórki ssaków. Prace należy wykonywać w odpowiednich okapach z przepływem laminarnym, które są certyfikowane do badań na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2). 
	UWAGA: [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 będzie określany jako [Ru] w tej sekcji
	<ol>
		<li>Przygotować buforowany roztwór soli fizjologicznej zawierający glukozę (BGSS) jako pożywkę do oznaczania. BGSS jest roztworem zawierającym 110 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 5 mM bursztynianu sodu, 30 μM eteru bis(β-aminoetylowego) glikolu etylenowego (EGTA). Połącz wszystko oprócz EGTA, dostosuj pH do 7,4. Dodaj EGTA i dostosuj pH do 7,4. Na 50 ml pożywki do oznaczania dodać 0,5 ml 1 mg/ml glukozy.</li>
		<li>Hodowla komórek HeLa na 500 cm2 szalkach Petriego w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Amplifikować komórki HeLa rosnące na szalce Petriego o średnicy 100 mm, umieszczając je na pożywce Petriego o średnicy 500 cm2. Całkowita objętość podłoża w dużym naczyniu wynosi 115 ml. Z każdej dużej czaszy uzyska około 18 milionów komórek, co wystarczy do przeprowadzenia dwóch eksperymentów ze spektroskopią fluorescencyjną.
		<ol>
			<li>Hoduj komórki, aż osiągną 90-95% konfluencji. Usuń pożywkę i przepłucz komórki 15 ml pH 7,4 PBS. Dodać 15 ml 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do PBS i inkubować przez 10 minut w celu odłączenia komórek. Przenieść komórki do probówek sokoła z okrągłym dnem o pojemności 14 ml</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i hemocytometru z odwróconym mikroskopem i oblicz całkowitą liczbę komórek oraz objętość pożywki potrzebną do osiągnięcia 7,5 miliona komórek na 1,8 ml objętości pożywki. Odwirować komórki przez 10 minut w temperaturze 5310 × g. Zdekantować supernatant i dodać obliczoną objętość BGSS. Delikatnie zawieś komórki.
		<ol>
			<li>Do tego testu należy przygotować roztwory podstawowe 40 mM digitoniny w dimetylosulfotlenku (DMSO), 1 mM zieleni wapniowej-5N w H2O i 10 mM CaCl2 w H2O. [Ru] roztwory podstawowe, przygotowane w czystej wodzie, mogą mieć od 1 do 3 mM. 
			UWAGA: Calcium Green-5N jest wrażliwy na światło. Przechowywać w ciemności i zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustawić fluorymetr tak, aby wzbudzał przy długości fali 506 nm i odczytywać emisję przy długości fali 532 nm z uchwytem kuwety sterowanym w temperaturze 37 °C. Przygotować kuwetę akrylową z mieszadłem lub kołkiem, zawiesinę komórek o zawartości 1,8 ml z ppkt 1.5.2 powyżej, 1,8 μl roztworu digitoniny, 3,6 μl zieleni wapniowej-5N (roztwór) i 9 μl [Ru] (dla 1 mM roztworu podstawowego, 5 μM stężenie końcowe). Inkubować komórki przez 15 minut we fluorymetrze.
		<ol>
			<li>Odczytuj dane jako stosunek wzbudzenia/emisji, a nie absorpcję surową. Praktyka ta minimalizuje błędy związane z wahaniami natężenia źródła światła.</li>
			<li>Przeprowadzić analizę pierwszej próbki pod nieobecność [Ru] w celu zmierzenia wpływu dodania CaCl2 na odpowiedź komórek.</li>
			<li>Rozpocząć analizę na fluorymetrze z ustawieniami opisanymi w ppkt 1.5.4. Odczekać około 2 minuty, aby ustalić stabilny poziom emisji, a następnie dodać 1,8 μl CaCl2 (10 μM stężenie końcowe). Intensywność emisji wzrośnie natychmiast po dodaniu CaCl2, a następnie zaniknie w ciągu kilku minut, gdy jony wapnia dostaną się do mitochondriów. Poczekaj, aż rozpad się zakończy (≈5 min). Dodaj dodatkowe bolusy wapniowe, aby określić mitochondrialną odpowiedź wychwytu wapnia przez komórki, które nie są leczone [Ru].</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W innej kuwecie zawierającej 5 μM [Ru] powtórzyć doświadczenie zgodnie z powyższym opisem w 1.5.4.3. W obecności inhibitora intensywność emisji wzrośnie, ale nie zaniknie. Ta obserwacja oznacza zablokowany mitochondrialny wychwyt wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Stefani, D., Rizzuto, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enjoy+the+trip%3A+Calcium+in+mitochondria+back+and+forth%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enjoy the trip: Calcium in mitochondria back and forth.</a> Annu. Rev. Biochem. 85, 161-192 (2016).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the calcium connection.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+homeostasis+as+potential+target+for+mitochondrial+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium homeostasis as potential target for mitochondrial medicine.</a> Mitochondrion. 12 (1), 77-85 (2012).</li>
<li>De Stefani, D., Raffaello, A., Teardo, E., Szabò, I., Rizzuto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+forty-kilodalton+protein+of+the+inner+membrane+is+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A forty-kilodalton protein of the inner membrane is the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 336-340 (2011).</li>
<li>Baughman, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+identifies+MCU+as+an+essential+component+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics identifies MCU as an essential component of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 476 (7360), 341-356 (2011).</li>
<li>Kamer, K. J., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular era of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 16 (9), 545-553 (2015).</li>
<li>Ying, W. -L., Emerson, J., Clarke, M. J., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+calcium+ion+transport+by+an+oxo-bridged+dinuclear+ruthenium+ammine+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial calcium ion transport by an oxo-bridged dinuclear ruthenium ammine complex.</a> Biochemistry. 30 (20), 4949-4952 (1991).</li>
<li>Emerson, J., Clarke, M. J., Ying, W. -L., Sanadi, D. R. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/244437951_The_component_of_ruthenium_red_responsible_for_inhibition_of_mitochondrial_calcium_ion_transport_Spectra_electrochemistry_and_aquation_kinetics_Crystal_structure_of_m-O-HCO2NH34Ru2Cl_3">The component of "ruthenium red" responsible for inhibition of mitochondrial calcium ion transport. Spectra, electrochemistry, and aquation kinetics. Crystal structure of µ-O-[(HCO2)(NH3)4Ru]2Cl3.</a> J. Am. Chem. Soc. 115 (25), 11799-11805 (1993).</li>
<li>Matlib, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-bridged+Dinuclear+Ruthenium+Amine+Complex+Specifically+Inhibits+Ca2%2B+Uptake+into+Mitochondria+in+Vitro+and+in+Situ+in+Single+Cardiac+Myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen-bridged Dinuclear Ruthenium Amine Complex Specifically Inhibits Ca2+ Uptake into Mitochondria in Vitro and in Situ in Single Cardiac Myocytes.</a> J. Biol. Chem. 273 (17), 10223-10231 (1998).</li>
<li>Oxenoid, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+mitochondrial+calcium+uniporter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the mitochondrial calcium uniporter.</a> Nature. 533 (7602), 269-273 (2016).</li>
<li>Nathan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Methods+for+the+Preparation+of+a+Functional+Analogue+of+Ru360%2C+a+Potent+Inhibitor+of+Mitochondrial+Calcium+Uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthetic Methods for the Preparation of a Functional Analogue of Ru360, a Potent Inhibitor of Mitochondrial Calcium Uptake.</a> Inorg Chem. 56 (6), 3123-3126 (2017).</li>
<li>Allen, A. D., Senoff, C. V. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/v67-220#.WW5AYYjyvIU">Preparation and infrared spectra of some ammine complexes of ruthenium(II) and ruthenium(III).</a> Can. J. Chem. 45 (12), 1337-1341 (1967).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Deak, A. T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25631032">Assessment of mitochondrial Ca⁺ uptake.</a> Meth. Molec. Biol. 1264, 421-439 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Mitochondrialny inhibitor wychwytu wapnia [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 można zsyntetyzować z [Ru(NH3)5Cl]Cl2, dobrze znanego materiału wyjściowego rutenu(III), jak opisano w tej procedurze. Synteza [Ru(NH3)5Cl]Cl2 jest łatwa do osiągnięcia z niewielkimi trudnościami. Po mieszaniu RuCl3 przez 16 godzin w hydrazynie hydrazyny, pH roztworu należy dostosować do wart...

Mitochondrialny wapń jest kluczowym regulatorem wielu procesów, które są kluczowe dla prawidłowego funkcjonowania komórek, w tym produkcji energii i apoptozy. 1,2,3 Mitochondrialny uniporter wapnia (MCU), białko transportujące jony, które znajduje się na wewnętrznej błonie mitochondrialnej, reguluje napływ jonów wapnia do mitochondriów. 4,5,6 Chemiczne inhibitory MCU są cennymi narzędziami do kontynuowania wysiłków na rzecz badania funkcji i roli komórkowej tego białka transportowego i mitochondrialnego wapnia. Związek [(HCO2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(O2CH)]3+, Ru360, jest jednym z niewielu znanych selektywnych inhibitorów MCU o zgłoszonej wartości Kd wynoszącej 24 μM.7,8,9,10 Kompleks ten jest powszechnym zanieczyszczeniem występującym w komercyjnych preparatach czerwieni rutenowej (RuRed), trirutenu di-μ-oksozo mostkowanego hexacation o wzorze [(NH3)5Ru(μ-O)Ru(NH3)4(μ-O)Ru(NH3)5)]6+, który był również stosowany jako inhibitor wychwytu wapnia. Chociaż Ru360 jest dostępny na rynku, jest bardzo kosztowny. Co więcej, synteza i izolacja Ru360 jest wyzwaniem ze względu na trudne procedury oczyszczania i niejednoznaczne metody charakteryzacji.
Niedawno informowaliśmy o alternatywnych procedurach dostępu do analogu Ru360, [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5. 11 Ten związek hamuje MCU z wysokim powinowactwem, podobnie jak Ru360. W tym protokole opiszemy naszą najskuteczniejszą syntezę tego związku, która rozpoczyna się od [Ru(NH3)5Cl]Cl2. Szczegółowo opisano oczyszczanie produktu za pomocą silnie kwaśnej żywicy kationowymiennej, a także typowe pułapki związane z tą procedurą. Przedstawiono również metody charakterystyki i oceny czystości związku oraz nakreślono proste podejście do badania jego skuteczności w blokowaniu mitochondrialnego wychwytu wapnia.

<table><tbody><tr><td>Hydrat trichlorku rutenu</td><td>Ciśnienie chemiczne</td><td>3750</td><td></td></tr><tr><td>Stężony kwas solny</td><td>J.T. Baker</td><td>9535</td><td></td></tr><tr><td>Skoncentrowany wodorotlenek amonu</td><td>Mallinckrodt Chemical Works</td><td>A669C-2 1</td><td></td></tr><tr><td>Dowex 50 WX2 200-400 Mesh</td><td>Alfa Aesar</td><td>13945</td><td></td></tr><tr><td>Zieleń wapniowa 5N</td><td>Invitrogen</td><td>C3737</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Aldrich</td><td>260746</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Aldrich</td><td>471267</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>USB</td><td>20598</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fluka</td><td>54466</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian sodu</td><td>Alfa Aesar</td><td>33386</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>J.T. Baker</td><td>8993-01</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Aldrich</td><td>G5000</td><td></td></tr><tr><td>200 Kolba okrągłodenna</td><td>ChemGlass</td><td>CG-1506-14</td><td></td></tr><tr><td>Szklany korek</td><td>ChemGlass</td><td>CG-3000-05</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolumna 10 mm x 15 cm ze zbiornikami</td><td>Niestandardowe - podobne do kolumn Chemglass</td><td>Podobne do CG-1203-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Rury Falcon z okrągłym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-11B&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>500 cm2 szalki Petriego</td><td>Corning</td><td>431110</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td></td><td>Hemacytometr ThermoFisher Scientific</td> 15250061 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Kuwety akrylowe Aldrich Z359629 <td></td></tr><tr><td></td><td>VWR&nbsp;</td><td>58017-875</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr UV-Vis</td><td>Agilent Model Cary 8454&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorymetr</td><td>SLM Model 8100C</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr IR</td><td>Bruker Hyprion FTIR z przystawką</td><td></td><td></td>ATR</tr><tr><td>Wirówka</td><td>ALC Model PM140R</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>VWR&nbsp;</td><td>89404-462</td><td></td></tr></tbody></table>

synteza i ocena mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia na bazie rutenu

Synthesis and Evaluation of a Ruthenium-based Mitochondrial Calcium Uptake Inhibitor

Szczegółowo opisujemy syntezę i oczyszczanie mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia, [(OH2)(NH3)4Ru(μ-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. Zoptymalizowana synteza tego związku rozpoczyna się od [Ru(NH3)5Cl]Cl2 w 1 M NH4OH w zamkniętym pojemniku, dając zielony roztwór. Oczyszczanie odbywa się za pomocą chromatografii kationowymiennej. Związek ten został scharakteryzowany i zweryfikowany jako czysty za pomocą spektroskopii UV-vis i IR. Właściwości hamujące wychwyt wapnia przez mitochondria ocenia się w permeabilizowanych komórkach HeLa za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej.

Niniejsza metoda opisuje syntezę inhibitora mitochondrialnego poboru wapnia [(OH2)(NH3)4Ru(µ-O)Ru(NH3)4(OH2)]Cl5 z wykorzystaniem [Ru(NH3)5Cl]Cl2, dobrze znanego materiału wyjściowego na bazie rutenu(III). Związek [Ru(NH3)5Cl]Cl2 charakteryzuje się w spektroskopii IR modami wibracyjnymi przy 3200 cm-1, 1608 cm-1, 1298 cm-...

Przedstawiono protokół syntezy, oczyszczania i charakterystyki inhibitora mitochondrialnego wchłaniania wapnia na bazie rutenu. Przedstawiono procedurę oceny jego skuteczności w przepuszczalnych komórkach ssaków.

Synteza i ocena mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia na bazie rutenu

We detail the synthesis and purification of a mitochondrial calcium uptake inhibitor, [(OH2)(NH3)4Ru(&#181;-O)Ru(NH3)4(OH2)]5+. The optimized synthesis of ...

Ogólnym celem syntezy i oczyszczania jest stosunkowo łatwe wyprodukowanie analogu rutenu 360 stosowanego w mitochondrialnych testach wychwytu wapnia, który jest 10 razy skuteczniejszy niż dostępny na rynku ruten 360. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mitochondrialnego wapnia, zapewniając czysty inhibitor mitochondrialnego wychwytu wapnia. Główną zaletą tej techniki jest to, że produkt końcowy jest zarówno bardzo mocny, jak i czysty.Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ oczyszczanie wymaga czasu i cierpliwości. Producentką będzie Sarah Nathan, doktorantka z mojego laboratorium. Procedurę tę należy rozpocząć od syntezy dichlorku chlororutenu pentaamminy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Rozpuścić 100 miligramów dichlorku chlororutenu pentaaminy w 50 mililitrach jednego molowego roztworu wodorotlenku amonu w kolbie okrągłodennej o pojemności 200 mililitrów. Luźno przykryć kolbę szklanym korkiem i podgrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Podgrzewanie szczelnego naczynia powoduje wzrost ciśnienia.Upewnij się, że szklany korek jest luźny, aby umożliwić uwolnienie nadmiernego ciśnienia. Po sześciu godzinach usuń mieszaninę reakcyjną z ognia. I mieszaj w temperaturze pokojowej przez cztery dni, aby uzyskać ciemnozielony roztwór.Aby oczyścić powstały pentachlorek trans-diaqua oktoaminy mu-oxo dirutenu za pomocą chromatografii kationowymiennej, najpierw zawiesić pięć gramów żywicy kationowymiennej siatki w 10 mililitrach 0,1 molowego HCL w 25-mililitrowej zlewce. Załaduj tę zawiesinę do 10-mililitrowej kolumny umieszczonej w 50-mililitrowym zbiorniku rozpuszczalnika. Umyj żywicę około 20 do 30 mililitrami 0,1 molowego HCL, aż elucja stanie się bezbarwna.Następnie dodaj skoncentrowany HCL do wcześniej wyizolowanego zielonego roztworu reakcyjnego, aby dostosować pH do dwóch, w którym to momencie kolor roztworu zmieni się na brązowy. Załadować ten zakwaszony roztwór do kolumny z żywicą kationowymienną, delikatnie pipetując go na wierzch żywicy. Pozwól, aby elucja całkowicie spłynęła i kontynuuj ładowanie roztworu.Powtarzaj ten proces, aż zostanie dodany cały roztwór. Wierzch żywicy będzie ciemnobrązowy lub. Żywica nieznacznie zmniejszy swoją objętość.Następnie przykryj górną część żywicy szklanymi koralikami, aby zapobiec naruszeniu żywicy podczas dodawania nowych roztworów. Eluować kolumnę za pomocą 20 mililitrów jednego molowego HCL. Następnie wymyj kolumnę 50 mililitrami o zwiększonym stężeniu HCL wynoszącym 1,5 mola.Żółty roztwór zacznie schodzić z kolumny. Następnie zwiększ stężenie HCL do dwóch molowców i kontynuuj elucję z 150 do 200 mililitrami. Eluant zacznie się od bardzo bladożółtego koloru i przejdzie w jasnożółty.Poczekaj, aż eluant wychodzący z kolumny znów będzie bardzo blady. Na tym etapie cierpliwość ma kluczowe znaczenie. Eluant musi być bardzo blady.Zwiększ stężenie HCL dalej do 2,5 mola. Zebrać eluant w postaci frakcji w probówkach. Na koniec zwiększ stężenie do trzech molowych HCL.Produkt będzie wymywał się z kolumny w postaci zielono-brązowego roztworu. Czerwono-brązowa frakcja może również zacząć schodzić z kolumny. Frakcje te są brązowymi zanieczyszczeniami rutenu i nie powinny być łączone z frakcjami zielono-brązowymi.Aby przetestować wszystkie frakcje za pomocą spektroskopii UV-Vis, dodaj 100 mikrolitrów danej frakcji do dwóch mililitrów trzymolowego amoniaku. Następnie przeanalizować mieszaninę za pomocą spektroskopii UV-Vis. Frakcje zawierające czysty produkt będą miały duży zakres absorbancji przy 360 nanometrach i mniej intensywną absorbancję przy 600 nanometrach.Absorbancja przy 480 nanometrach wskazuje na brąz rutenowy, a absorbancja przy 533 nanometrach reprezentuje czerwone zanieczyszczenia rutenu. Inne zanieczyszczenia są widoczne przy absorpcji mniejszej niż 300 nanometrów. Frakcje basenowe zawierające czysty produkt i odparować roztwór do sucha przez odparowanie obrotowe przed analizą próbki w stanie stałym za pomocą spektroskopii w podczerwieni.Przystąp do oceny hamowania mitochondrialnego wychwytu wapnia za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, jak opisano w protokole tekstowym. Widma UV-Vis oczyszczonego pentachlorku trans-diaqua octo amine mu-oxo dirutenium charakteryzują się głównymi i mniejszymi absorpcjami odpowiednio na 360 nanometrach i 600 nanometrach. I odwrotnie, zanieczyszczona mieszanina wykazuje pasma absorpcyjne w odległości 533 nanometrów od czerwonych zanieczyszczeń rutenu i w odległości od 275 do 300 nanometrów od materiału wyjściowego.Charakterystyka ciała stałego za pomocą spektroskopii w podczerwieni ma oczekiwane rozciągnięcia od amin. Podobnie jak ruten, tlen, ruten rozciąga się na 850 odwrotnych centymetrów. Permeabalizowane komórki HeLa potraktowane wrażliwym na wapń barwnikiem fluorescencyjnym i trans-diaqua oktoaminą mu-oxo dirutenium pentachlorkiem wykazują hamowanie wychwytu wapnia do mitochondriów.Podczas próby wykonania procedury należy pamiętać, aby pozwolić frakcjom całkowicie się wymyć. Cierpliwość zaowocuje czystym produktem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować, oczyszczać i charakteryzować ten silny analog rutenu 360.Poziom wapnia w mitochondriach reguluje szeroki zakres procesów międzykomórkowych, w tym bioenergetykę i kontrolowaną śmierć komórki. Inhibitor wytworzony tą metodą może być stosowany w badaniach mających na celu zrozumienie roli mitochondrialnej biologii wapnia w pośredniczeniu w innych procesach biologicznych. Nie zapominaj, że praca ze stężonymi kwasami i zasadami jest, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.

synthesis-evaluation-ruthenium-based-mitochondrial-calcium-uptake

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Niniejszy protokół opisuje metodę pomiaru przepływów wapnia w mitochondriach w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta wykorzystuje ratiometryczny sensor wapnia oparty na cyklicznie permutowanej białku YFP z podwójnym wzbudzeniem (ratiometryczny pericam-mt), który jest selektywnie ekspresowany w mitochondriach.

Monitorowanie dynamicznych zmian poziomu wapnia w mitochondriach podczas apoptozy z wykorzystaniem genetycznie kodowanego sensora wapnia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Ten film opisuje test oparty na czytniku płytek do pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach. Test analizuje sygnał fluorescencyjny wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego w celu zbadania kinetyki mitochondrialnego wychwytu wapnia i przeciążenia wapniem.

Mitochondrialny test wychwytu wapnia: metoda pomiaru wychwytu wapnia w izolowanych mitochondriach oparta na czytniku płytkowym

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Kompleksy fosforowo-wodorowe rutenu są powszechnie stosowane w jednorodnych reakcjach katalitycznych, takich jak uwodornienie. Przedstawiono syntezę szeregu nowych kompleksów rutenu trójzębnego zawierających ligand N-trifosu N(CH2PPh2)3. Dodatkowo opisano reakcję stechiometryczną kompleksu dwuwodorkowego Ru–N-trifosu z kwasem lewulinowym.

Synteza, charakterystyka i reaktywność szeregu kompleksówPh N-trifosu rutenu

Mitochondria mogą wykorzystywać potencjał elektrochemiczny w swojej wewnętrznej błonie (ΔΨm) do sekwestracji wapnia (Ca2+), co pozwala im kształtować cytozolową sygnalizację Ca2+ w komórce. Opisano metodę jednoczesnego pomiaru wychwytu Ca2+ i ΔΨm w mitochondriach w żywych komórkach za pomocą barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Jednoczesny pomiar mitochondrialnego wapnia i potencjału błony mitochondrialnej w żywych komórkach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół ma na celu opisanie metody badania krok po kroku zdolności zatrzymywania Ca2+ i wywołanego przez Ca2+ obrzęku mitochondriów izolowanych mitochondriów komórek SH-SY5Y.

Test zdolności retencyjnej mitochondriów Ca2+ i test obrzęku mitochondriów wywołany Ca2+

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Adaptacja metaboliczna jest fundamentalna dla limfocytów T, ponieważ decyduje o różnicowaniu, trwałości i cytotoksyczności. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół monitorowania oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych ex vivo cytokinami.

Monitorowanie oddychania mitochondrialnego w ludzkich pierwotnych limfocytach T różnicowanych cytokinami

Poznaj syntezę i oczyszczanie analogu rutenowego inhibitora wychwytu wapnia w mitochondriach. Ta metoda biochemiczna umożliwia uzyskanie produktu dziesięciokrotnie skuteczniejszego niż dostępne komercyjnie opcje.

Synteza i ocena mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia na bazie rutenu

Przeglądaj więcej filmów