Synteza i ocena mitochondrialnego inhibitora wychwytu wapnia na bazie rutenu

Ogólnym celem syntezy i oczyszczania jest stosunkowo łatwe wyprodukowanie analogu rutenu 360 stosowanego w mitochondrialnych testach wychwytu wapnia, który jest 10 razy skuteczniejszy niż dostępny na rynku ruten 360. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii mitochondrialnego wapnia, zapewniając czysty inhibitor mitochondrialnego wychwytu wapnia. Główną zaletą tej techniki jest to, że produkt końcowy jest zarówno bardzo mocny, jak i czysty.

Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ oczyszczanie wymaga czasu i cierpliwości. Producentką będzie Sarah Nathan, doktorantka z mojego laboratorium. Procedurę tę należy rozpocząć od syntezy dichlorku chlororutenu pentaamminy, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Rozpuścić 100 miligramów dichlorku chlororutenu pentaaminy w 50 mililitrach jednego molowego roztworu wodorotlenku amonu w kolbie okrągłodennej o pojemności 200 mililitrów. Luźno przykryć kolbę szklanym korkiem i podgrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 75 stopni Celsjusza przez sześć godzin. Podgrzewanie szczelnego naczynia powoduje wzrost ciśnienia.

Upewnij się, że szklany korek jest luźny, aby umożliwić uwolnienie nadmiernego ciśnienia. Po sześciu godzinach usuń mieszaninę reakcyjną z ognia. I mieszaj w temperaturze pokojowej przez cztery dni, aby uzyskać ciemnozielony roztwór.

Aby oczyścić powstały pentachlorek trans-diaqua oktoaminy mu-oxo dirutenu za pomocą chromatografii kationowymiennej, najpierw zawiesić pięć gramów żywicy kationowymiennej siatki w 10 mililitrach 0,1 molowego HCL w 25-mililitrowej zlewce. Załaduj tę zawiesinę do 10-mililitrowej kolumny umieszczonej w 50-mililitrowym zbiorniku rozpuszczalnika. Umyj żywicę około 20 do 30 mililitrami 0,1 molowego HCL, aż elucja stanie się bezbarwna.

Następnie dodaj skoncentrowany HCL do wcześniej wyizolowanego zielonego roztworu reakcyjnego, aby dostosować pH do dwóch, w którym to momencie kolor roztworu zmieni się na brązowy. Załadować ten zakwaszony roztwór do kolumny z żywicą kationowymienną, delikatnie pipetując go na wierzch żywicy. Pozwól, aby elucja całkowicie spłynęła i kontynuuj ładowanie roztworu.

Powtarzaj ten proces, aż zostanie dodany cały roztwór. Wierzch żywicy będzie ciemnobrązowy lub. Żywica nieznacznie zmniejszy swoją objętość.

Następnie przykryj górną część żywicy szklanymi koralikami, aby zapobiec naruszeniu żywicy podczas dodawania nowych roztworów. Eluować kolumnę za pomocą 20 mililitrów jednego molowego HCL. Następnie wymyj kolumnę 50 mililitrami o zwiększonym stężeniu HCL wynoszącym 1,5 mola.

Żółty roztwór zacznie schodzić z kolumny. Następnie zwiększ stężenie HCL do dwóch molowców i kontynuuj elucję z 150 do 200 mililitrami. Eluant zacznie się od bardzo bladożółtego koloru i przejdzie w jasnożółty.

Poczekaj, aż eluant wychodzący z kolumny znów będzie bardzo blady. Na tym etapie cierpliwość ma kluczowe znaczenie. Eluant musi być bardzo blady.

Zwiększ stężenie HCL dalej do 2,5 mola. Zebrać eluant w postaci frakcji w probówkach. Na koniec zwiększ stężenie do trzech molowych HCL.

Produkt będzie wymywał się z kolumny w postaci zielono-brązowego roztworu. Czerwono-brązowa frakcja może również zacząć schodzić z kolumny. Frakcje te są brązowymi zanieczyszczeniami rutenu i nie powinny być łączone z frakcjami zielono-brązowymi.

Aby przetestować wszystkie frakcje za pomocą spektroskopii UV-Vis, dodaj 100 mikrolitrów danej frakcji do dwóch mililitrów trzymolowego amoniaku. Następnie przeanalizować mieszaninę za pomocą spektroskopii UV-Vis. Frakcje zawierające czysty produkt będą miały duży zakres absorbancji przy 360 nanometrach i mniej intensywną absorbancję przy 600 nanometrach.

Absorbancja przy 480 nanometrach wskazuje na brąz rutenowy, a absorbancja przy 533 nanometrach reprezentuje czerwone zanieczyszczenia rutenu. Inne zanieczyszczenia są widoczne przy absorpcji mniejszej niż 300 nanometrów. Frakcje basenowe zawierające czysty produkt i odparować roztwór do sucha przez odparowanie obrotowe przed analizą próbki w stanie stałym za pomocą spektroskopii w podczerwieni.

Przystąp do oceny hamowania mitochondrialnego wychwytu wapnia za pomocą spektroskopii fluorescencyjnej, jak opisano w protokole tekstowym. Widma UV-Vis oczyszczonego pentachlorku trans-diaqua octo amine mu-oxo dirutenium charakteryzują się głównymi i mniejszymi absorpcjami odpowiednio na 360 nanometrach i 600 nanometrach. I odwrotnie, zanieczyszczona mieszanina wykazuje pasma absorpcyjne w odległości 533 nanometrów od czerwonych zanieczyszczeń rutenu i w odległości od 275 do 300 nanometrów od materiału wyjściowego.

Charakterystyka ciała stałego za pomocą spektroskopii w podczerwieni ma oczekiwane rozciągnięcia od amin. Podobnie jak ruten, tlen, ruten rozciąga się na 850 odwrotnych centymetrów. Permeabalizowane komórki HeLa potraktowane wrażliwym na wapń barwnikiem fluorescencyjnym i trans-diaqua oktoaminą mu-oxo dirutenium pentachlorkiem wykazują hamowanie wychwytu wapnia do mitochondriów.

Podczas próby wykonania procedury należy pamiętać, aby pozwolić frakcjom całkowicie się wymyć. Cierpliwość zaowocuje czystym produktem. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować, oczyszczać i charakteryzować ten silny analog rutenu 360.

Poziom wapnia w mitochondriach reguluje szeroki zakres procesów międzykomórkowych, w tym bioenergetykę i kontrolowaną śmierć komórki. Inhibitor wytworzony tą metodą może być stosowany w badaniach mających na celu zrozumienie roli mitochondrialnej biologii wapnia w pośredniczeniu w innych procesach biologicznych. Nie zapominaj, że praca ze stężonymi kwasami i zasadami jest, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.