Metoda barwienia DNA oparta na wytrącaniu się formazanu wywołanym ekspozycją na światło niebieskie
28 stycznia 2018
Ta metoda pozwala na selektywne barwienie i kwantyfikację DNA w żelach poprzez nasączenie żelu w roztworze SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium, a następnie wystawienie go na działanie światła słonecznego lub źródła niebieskiego światła. Powoduje to powstanie widocznego osadu i nie wymaga prawie żadnego sprzętu, dzięki czemu idealnie nadaje się do użytku w terenie.
Protokół barwienia DNA składa się z trzech ogólnych etapów. Pierwszym z nich jest umieszczenie żelu w roztworze SYBR Green I i nitro blue tetrazolium, znanego również jako NBT. Żel następnie miesza się przez 25 minut, jeśli jest to żel poliakrylamidowy i godzinę, jeśli jest to żel agarozowy.
Ostatnim krokiem jest wystawienie żelu na działanie źródła niebieskiego światła, takiego jak niebieskie diody LED lub światło słoneczne. Na tym etapie pojawiają się pewne pasma osadu. Pasma te mają bezpośrednią korelację ze stężeniem DNA, a żel może być następnie zdigitalizowany w skanerze biurowym w celu ilościowego określenia DNA.
Do żelu poliakryloamidowego przygotowuje się niedenaturujący żel poliakrylamidowy. Żel jest następnie ładowany próbkami i rozpoczyna się proces elektroforezy. SYBR Green I rozcieńcza się do 1,2 raza i przygotowuje się 20-milimolowe roztwory NBT.
Żel umieszcza się w plastikowym pojemniku i dodaje 16,75 mililitra rozcieńczonego SYBR Green I i 325 milimilimolów NBT o stężeniu 20 milimolów. Następnie pojemnik przykrywa się Parafilmem i folią aluminiową i miesza z prędkością 60 obr./min przez 25 minut. Na koniec usuwa się folię aluminiową i Parafilm, a żel wystawia się na działanie promieni słonecznych lub źródła niebieskiego światła.
W celu kwantyfikacji pasma i krzywych kalibracyjnych żel jest umieszczany w skanerze biurowym, a następnie obraz jest analizowany za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Na koniec wykonuje się przeszczep znormalizowanego sygnału w stosunku do stężenia. Powstaje żel agarozowy.
Studzienki są ładowane plazmidem, który jest odporny na ampicylinę, a żel jest cięty na dwie części, z których każda jest barwiona inną plamą. Następnie pasmo plazmidu jest ekstrahowane i przekształcane poprzez przemianę chemiczną w kompetentne komórki z pożywką zawierającą ampicylinę. 1% żel agarozowy jest przygotowywany w buforze TAE 1X i ładowany czterema mikrolitrami plazmidu w ilości około 100 nanogramów na mikrolitr.
Żel w komorze elektroforezy jest następnie uruchamiany pod napięciem 100 woltów przez jedną godzinę. Połowa żelu barwiona jest metodą SYBR Green I i NBT, a druga połowa metodą SYBR Green I UV. W przypadku żelu agarozowego metodę SYBR Green I NBT wykonuje się przy użyciu SBYR Green I w stężeniu 1,2X i NBT w stężeniu 2 milimolowym.
Żel umieszcza się w plastikowym pojemniku, a objętość roztworu zwiększa się, aby pokryć żel, a czas mieszania wydłuża się do jednej godziny. W przypadku żeli agarozowych powszechnie stosowaną metodę SYBR Green I wykonuje się poprzez pokrycie żelu 1X roztworem SYBR Green I i mieszanie przez godzinę. Następnie żel jest poddawany działaniu transiluminatora UV w celu wizualizacji pasma przez dwie minuty.
Po zabarwieniu żelu pasmo plazmidu jest cięte skalpelem, a plazmid ekstrahowany za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji. DNA jest znormalizowane do 9,1 nanogramów na mikrolitr w celu przekształcenia kompetentnych chemicznie bakterii Escherichia coli XL 10. Na koniec liczone są kolonie.
Obliczane są jednostki tworzące kolonie. Wynik jest szczepiony i porównywane wyniki uzyskane z SYBR Green I NBT i SYBR Green I UV. W miejscu, w którym znajduje się DNA, pojawia się fioletowy osad formazanu.
W eksperymencie załadowano drabinę DNA, aby uzyskać krzywą kalibracyjną z granicą wykrywalności wynoszącą 192 pikogramy przy 1500 parach zasad. Zastosowanie żeli agarozowych pozwala na odzyskanie próbki za pomocą dostępnego na rynku zestawu i nie zakłóca ekstrakcji. Pewne odzysk przy użyciu tej metody z niebieską diodą LED skutkuje lepszą jakością w porównaniu do SYBR Green I przy użyciu transiluminatora.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta umożliwia selektywne barwienie i ilościowe oznaczenie DNA w żelach przy użyciu roztworu SYBR Green I/Nitro Blue Tetrazolium. Proces wymaga minimalnego wyposażenia, co czyni go odpowiednim do zastosowań w terenie.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biochemia
- Biologia molekularna
- Zastosowania terenowe
Wstęp
- Ilościowe oznaczenie DNA jest niezbędne w wielu badaniach biologicznych.
- Tradycyjne metody często wymagają zastosowania skomplikowanej aparatury.
- Niniejsza metoda znacznie upraszcza ten proces.
- Wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki w celu uzyskania skutecznych wyników.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody barwienia DNA.
- Umożliwienie kwantyfikacji DNA w różnych typach żeli.
- Ułatwienie pracy w terenie przy minimalnych wymaganiach sprzętowych.
Zastosowane metody
- Namaczanie żelu w roztworze SYBR Green I i NBT.
- Mieszanie żelu przez 25 minut (poliakrylamidowy) lub 1 godzinę (agarozowy).
- Naświetlanie żelu niebieskim źródłem światła lub światłem słonecznym.
- Digitalizacja żelu w celu ilościowego oznaczenia DNA.
Główne wyniki
- Widoczne prążki osadu korelują z koncentracją DNA.
- Skuteczne barwienie osiągnięto przy użyciu minimalnego zaplecza sprzętowego.
- Wyniki można poddać kwantyfikacji przy użyciu standardowych skanerów biurowych.
- Metoda wykazuje niezawodność w warunkach terenowych.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia praktyczne podejście do ilościowego oznaczania DNA.
- Jest ona odpowiednia dla różnych rodzajów żeli oraz zastosowań w terenie.
- Zwiększa dostępność dla badaczy w odległych lokalizacjach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ta metoda barwienia DNA umożliwia bezpośrednią wizualizację i kwantyfikację kwasów nukleinowych bez użycia specjalistycznego sprzętu, co wspiera szybką walidację celu w warunkach ograniczonych zasobów. Poprzez wyeliminowanie zależności od transiluminatorów UV, zmniejsza ona ryzyko związane z bezpieczeństwem oraz złożoność operacyjną w początkowych etapach procesów odkrywania. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną dzięki powtarzalnej korelacji sygnału barwnika z stężeniem DNA, co ułatwia podejmowanie decyzji typu go/no-go w procesach identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez poprzez bezpośrednią korelację między intensywnością osadu formazanu a stężeniem DNA, co wspiera ocenę stopnia związania z celem.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje mieszanie w temperaturze pokojowej i ekspozycję na światło niebieskie, co pozwala uniknąć niebezpiecznych protokołów z użyciem UV oraz specjalistycznego sprzętu obrazującego.
- Wartość prognostyczna: Dostarcza ilościowe wyniki kompatybilne ze skanerami biurowymi, umożliwiając szybkie porównanie wydajności izolacji kwasów nukleinowych w różnych warunkach doświadczalnych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Powstają stabilne, widoczne prążki osadu, które służą jako zestandaryzowane odczyty dla formatów wysokoprzepustowego przesiewania kwasów nukleinowych.
- Powtarzalność: Określone czasy mieszania (25 min dla poliakryloamidu, 60 min dla agarozy) oraz skalowalne stężenia reagentów zapewniają spójne generowanie sygnału pomiędzy partiami.
- Kompatybilność z platformą: Metoda działa zarówno w żelach agarozowych, jak i poliakryloamidowych, co umożliwia płynną integrację z istniejącymi procedurami elektroforezy do analizy wariantów lub plazmidów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Wspiera odzyskiwanie funkcjonalnych plazmidów po barwieniu, co potwierdzono poprzez uzyskanie większej liczby jednostek tworzących kolonie w porównaniu z metodami opartymi na UV, umożliwiając tym samym późniejszą walidację funkcjonalną.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Zapobiega uszkodzeniom DNA indukowanym przez UV, zachowując integralność próbek dla dokładnej korelacji genotypowo-fenotypowej w testach przesiewowych fenotypowych.
- Użyteczność przedkliniczna: Umożliwia kwantyfikację konstruktów ekspresji genów lub mian wirusowych w modelach przedklinicznych w warunkach terenowych, bez konieczności posiadania infrastruktury laboratoryjnej.
Integracja procesów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od ekstrakcji kwasów nukleinowych po walidację testów funkcjonalnych – szczególnie w sytuacjach, gdy dostęp do sprzętu jest ograniczony lub wymagana jest szybka iteracja.
- Biologia odkrywcza: Wspiera walidację celu poprzez dostarczanie mierzalnych wyników odczytu DNA, które korelują z wydajnością transkrypcji lub edycji w badaniach nad modulacją szlaków.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzowaną kwantyfikację kwasów nukleinowych w celu potwierdzenia trafień (hit confirmation) w bibliotekach CRISPR lub nadekspresji, co poprawia powtarzalność testów.
- Analityka: Generuje liniowe krzywe sygnał-stężenie za pomocą obrazowania skanerem biurowym, co wspiera normalizację danych w formatach wielodołkowych lub żelowych.
- Badania translacyjne: Ułatwia odzyskiwanie nienaruszonych kwasów nukleinowych do funkcjonalnych testów in vitro, łącząc etap odkrywania z przedklinicznymi badaniami skuteczności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Wymaga jedynie SYBR Green I, NBT oraz źródła światła niebieskiego, co czyni go niskokosztowym, wielokrotnie wykorzystywalnym modułem dla wielu zespołów projektowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną poprzez uniknięcie artefaktów wywołanych promieniowaniem UV, co poprawia niezawodność danych w badaniach walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania ciemni lub transiluminatorów, zwiększając przepustowość i redukując zatory w wspólnych placówkach badawczych.
- Wartość strategiczna: Obniża wydatki inwestycyjne na kwantyfikację kwasów nukleinowych, umożliwiając zdecentralizowane testowanie w laboratoriach satelitarnych lub ośrodkach partnerskich.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowany do ryzyka postęp prac poprzez zapewnienie wczesnego, niezależnego od sprzętu potwierdzenia wydajności konstruktu przed inwestowaniem w dalsze etapy oczyszczania.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagane jest podstawowe przeszkolenie z zakresu biologii molekularnej w celu przygotowania żelu i przeprowadzenia elektroforezy.
- Wymagany jest dostęp do źródła światła niebieskiego (np. diod LED 470 nm) lub światła słonecznego oraz standardowego laboratoryjnego sprzętu do mieszania.
- Wymagane są standaryzowane czasy barwienia i stężenia odczynników, aby zapewnić powtarzalność między laboratoriami.
- Ze względu na manualne etapy obchodzenia się z żelem, metoda może wymagać optymalizacji dla formatów wysokoprzepustowych.
- Metoda ograniczona do detekcji kwasów nukleinowych; nie dotyczy analiz białek lub małych cząsteczek bez odpowiedniej adaptacji.
