Test bioluminescencji ATP

Test bioluminescencji ATP jest powszechną techniką stosowaną do ilościowego określania poziomów ATP i wykrywania żywych, aktywnych metabolicznie komórek. ATP lub adenozynotrifosforan jest podstawowym źródłem energii dla wszystkich organizmów żywych, a przez "wszystkie" rozumiemy WSZYSTKO. Na poziomie komórkowym ATP jest generowane przez zestaw procesów metabolicznych zwanych oddychaniem komórkowym.

Dzisiaj pokrótce omówimy szlaki zaangażowane w oddychanie komórkowe. Następnie przedstawimy zasady stojące za testem bioluminescencji ATP i przejdziemy krok po kroku przez protokół wykonywania tej metody. Na koniec zobaczymy, jak naukowcy stosują tę technikę w swoich obecnych badaniach.

Zacznijmy od wprowadzenia oddychania komórkowego. Zjawisko to obejmuje kilka procesów metabolicznych, ale skupimy się na tym, który dotyczy metabolizmu glukozy.

W cytoplazmie szlak glikolizy przekształca glukozę w pirogronian, a przy tym wytwarza dwie cząsteczki ATP. Pirogronian jest transportowany do mitochondriów, gdzie jest przekształcany w acetylokoenzym A - proces, który również generuje dwutlenek węgla. Jeszcze w mitochondriach acetylokoenzym A wchodzi następnie w cykl kwasu trikarboksylowego lub TCA, podczas którego ponownie generowany jest dwutlenek węgla, podobnie jak wysokoenergetyczne cząsteczki NADH i FADH2. Cząsteczki te ostatecznie "przenoszą" elektrony do łańcucha transportu elektronów lub ETC.

W ETC elektrony są sekwencyjnie przenoszone między różnymi kompleksami białkowymi w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, zanim przekształcą tlen w wodę. Podczas tego procesu protony są "pompowane" do przestrzeni międzybłonowej mitochondriów. ATP jest faktycznie wytwarzane, gdy te protony dostają się z powrotem do macierzy mitochondrialnej, przechodząc przez białko zwane syntazą ATP. Łącznie cykl TCA i ETC powodują syntezę 36 cząsteczek ATP. Rozkład innych cząsteczek składników odżywczych, takich jak tłuszcze i białka, może również wpływać na cykl TCA i ETC, prowadząc do produkcji ATP.

Teraz, gdy wiemy, w jaki sposób komórki generują ATP, dowiedzmy się o zasadach stojących za testem bioluminescencji ATP, który jest powszechnie stosowany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów tej cząsteczki.

Strukturalnie ATP ma zasadę adeninową, cukier rybozę i trzy grupy fosforanowe - te ostatnie są połączone wiązaniami wysokoenergetycznymi. Wiązania te uwalniają energię po zerwaniu, a test bioluminescencji ATP wykorzystuje tę energię.

Zasadniczo test ten wymaga związku lucyferyny, który jest otrzymywany z "świecących" organizmów, takich jak świetliki, i odpowiadającego mu enzymu katalizatora zwanego lucyferazą. W obecności tlenu lucyferazy czerpie energię z ATP i przekształca lucyferynę w oksylucyferynę. Produktami ubocznymi tej reakcji są pirofosforan, czyli dwie grupy fosforanowe uzyskane z ATP - przekształcające je w monofosforan adenozyny lub AMP - dwutlenek węgla oraz światło lub luminescencję. Luminescencja jest odczytywana przez luminometr, maszynę, która określa ilościowo emisję światła. Ponieważ ilość wytwarzanej luminescencji jest wprost proporcjonalna do ilości ATP, służy to jako dobry wskaźnik żywotności komórek i metabolizmu.

Teraz, gdy rozumiesz zasady stojące za testem bioluminescencji ATP, przedstawmy ogólny protokół.

Najpierw komórki wysiewa się na 96-dołkowej płytce zawierającej pożywkę hodowlaną. Komórki są siane w trzech egzemplarzach o różnej gęstości, aby uwzględnić zmienność zależną od gęstości. Ponieważ najbardziej zewnętrzne studnie nie są otoczone innymi studniami ze wszystkich czterech stron, temperatura i szybkość parowania w tych studniach mogą być zmienne. Dlatego komórki nie są platerowane w zewnętrznych studzienkach, a zamiast tego są napełniane wodą, aby uniknąć parowania na całej płytce i zmian temperatury, które mogą wpływać na reakcję. Płytki są następnie inkubowane przez noc w temperaturze 37°C, aby umożliwić komórkom przyleganie do płytek hodowlanych.

Następnie pożywkę usuwa się, do każdej studzienki dodaje się lucyferazy i lucyferynę, a płytkę umieszcza się na wytrząsarce na 5-15 minut, aby ułatwić reakcję. Następnie porcję mieszaniny z każdej studzienki przenosi się na białą 96-dołkową płytkę; Często stosuje się białe płytki, ponieważ odbijają one światło w górę, co pozwala na dokładniejsze odczyty luminescencji. Ponadto należy unikać pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one zakłócać późniejsze analizy. Ponieważ sygnał luminescencji może z czasem maleć, płytka jest odczytywana w ciągu 10–12 minut na luminometrze.

Aby przeanalizować wyniki luminometru, oblicza się średnią wartość luminescencji ze studzienek o tej samej gęstości komórek. Porównując dane dotyczące luminescencji zebrane w ten sposób zarówno ze zdrowych próbek kontrolnych, jak i leczonych komórek, naukowcy mogą ocenić wpływ określonego leczenia na żywotność i metabolizm - w szczególności szukając zmniejszonej luminescencji w grupie eksperymentalnej.

Teraz, gdy już wiesz, jak wykonać test bioluminescencji ATP, omówmy jego zastosowania badawcze.

Naukowcy zawsze starają się opracować nowe leki przeciwwirusowe, które nie uszkadzają ani nie zabijają komórek gospodarza. W tym badaniu komórki ssaków wysiano na płytce wielodołkowej i zainfekowano specyficznym wirusem. Do tych próbek dodano różne związki przeciwwirusowe i wygenerowano krzywe logarytmiczne stężenie-odpowiedź w celu obliczenia efektywnego stężenia pięćdziesiąt lub EC50. EC50 to stężenie związku, przy którym żywotność komórki wynosi 50 procent. Jest to powszechnie stosowany parametr do oceny cytotoksyczności związku.

Poziomy ATP mogą również dostarczyć wskazówek na temat aktywności mitochondriów w różnych warunkach. W tym przypadku test bioluminescencji ATP przeprowadzono na preparatach mitochondriów pochodzących z komórek wątroby i mięśni gryzoni, co pomogło naukowcom ocenić zakres funkcji mitochondriów w normalnych tkankach. Co ważne, protokół ten może zostać rozszerzony, aby zapewnić sposób badania funkcji mitochondriów w stanach chorobowych.

Naukowcy wykorzystują również ten test do badania potencjalnych metod leczenia raka w systemach in vivo. W tym przykładzie ludzkie komórki nowotworowe zostały zmodyfikowane do ekspresji lucyferazy i wstrzyknięte do mózgów żywych myszy. Po tym, jak komórki nowotworowe osiedliły się u tych zwierząt, leczono je lekiem przeciwnowotworowym. Późniejszy test bioluminescencji ATP in vivo wykazał, że komórki nowotworowe u myszy narażonych na działanie leków miały niższy poziom ATP.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do testu bioluminescencji ATP. Powinieneś być teraz zaznajomiony z komórkowymi szlakami oddychania i protokołem używanym do pomiaru ATP, który jest produktem końcowym tych szlaków. Test bioluminescencji ATP służy jako doskonałe narzędzie przesiewowe dla biologów komórkowych zainteresowanych badaniem wpływu czynników fizjologicznych i patologicznych na metabolizm i żywotność komórek. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!