Name: Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę indukcji śmierci komórek makrofagów przez nasycone kwasy tłuszczowe i jej związek z akumulacją ceramidów. Technika ta pozwala badać mechanizmy zapalenia metabolicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez fundusze start-upowe Uniwersytetu w Louisville oraz granty National Cancer Institute (Bethesda, MD) R01CA177679, R01CA180986.

Protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu w Louisville.
1. Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy (BMDM)
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji 6- do 8-tygodniową, zdrową mysz typu dzikiego za pomocą CO2 . Przypnij go do płyty piankowej i spryskaj 70% etanolem, aż zostanie nasiąknięty. Usuń kości piszczelowe/udowe za pomocą kleszczy i nożyczek. Umieść je na szalce Petriego z 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wszystkie zabiegi wykonuj w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Rozciąć oba końce kości piszczelowej/udowej nożyczkami w sterylnym kapturze do hodowli tkanek. Przepłukać kość igłą 25 G z PBS + 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS) do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki szpiku kostnego w temperaturze 500 x g, w temperaturze 4 °C przez 5 min.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek w celu lizy czerwonych krwinek (RBC) przez mniej niż 1 minutę. Natychmiast rozcieńczyć 9 ml 1x PBS. Ponownie odwirować jak w kroku 1.3. Zdekantować supernatanty.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad komórek w 10 ml 1x PBS, przefiltrować zawiesinę komórek przez sterylną nylonową siatkę 40 μm do innej probówki o pojemności 15 ml w celu usunięcia resztek / grudek komórek. Ponownie odwirować jak w ppkt 1.3. Zdekantować supernatanty.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w 15 ml pożywki Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 5% FBS i 10 μg/ml gentamycyny, umieścić komórki w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej w inkubatorze o temperaturze 37 oC na 60 minut. Delikatnie zakręć naczyniem, wyjmij pływające komórki i policz je.</li>
	<li>Płytka 6x106 komórek w naczyniu o średnicy 100 mm z 12 ml pożywki różnicującej makrofagi (RPMI 1640 z 5% FBS i 10 μg/ml gentamycyny, zmieszane z 30% pożywką kondycjonowaną L92910) z 10 ng/ml rekombinowanego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów myszy (M-CSF) przez 2 dni.</li>
	<li>Po 2 dniach hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 należy nakarmić każde danie 6 ml świeżej pożywki różnicującej makrofagi o stężeniu 10 ng/ml M-CSF.</li>
	<li>W 5 dniu wyjmij 8 ml starej pożywki bez naruszania komórek i dodaj 10 ml świeżej pożywki różnicującej makrofagi z 10 ng / mL M-CSF.</li>
	<li>W dniu 7 zbierz makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) za pomocą podnośnika komórkowego. 
	UWAGA: Przyłączone makrofagi można również zdysocjować za pomocą 5 ml 1 mM EDTA w 1x PBS przez 5 do 10 minut po usunięciu komórek pływakowych i dwukrotnym przemyciu płytki 5 ml 1x PBS. Odwirować komórki jak w kroku 1.3, zawiesić je ponownie w świeżych pożywkach różnicujących makrofagi i policzyć je za pomocą hemocytometru.
	<ol>
		<li>Potwierdź fenotyp BMDM za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z opisem5. Przygotuj uzyskane makrofagi myszy w określonym stężeniu do kolejnych badań.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparat sprzężony z kwasem tłuszczowym BSA
<ol>
	<li>Przygotować 2 mM BSA w sterylnym PBS. Na przykład zważ 6,65 g BSA, dodaj 30 ml 1x PBS do rozpuszczenia, a następnie dodaj więcej PBS do 50 ml, skalując składniki, aby uzyskać 2 mM BSA w 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować 5 mM pojedynczą sól sodową kwasów tłuszczowych w 2 mM BSA. Podgrzać do temperatury 37 °C lub wyższej, jeśli to konieczne, i poddać sonikacji mieszaniny 2 mM BSA i soli sodowej kwasów tłuszczowych aż do uzyskania klarownego roztworu. 
	UWAGA: W porównaniu z nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, nasycone kwasy tłuszczowe potrzebują wyższej temperatury i dłuższego czasu sonikacji do rozpuszczenia.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór BSA kwasu tłuszczowego przez filtr 0,22 μm, podzielić go na sterylne probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku lub w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania. Nie należy zaobserwować opadów po przechowywaniu w lodówce w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy
<ol>
	<li>Umieść BMDM w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z 0,4 x 106/ml w pożywce różnicującej makrofagi.</li>
	<li>Traktować komórki 0,4 mM kwasem palmitynowym i kwasem stearynowym przez 16 do 24 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Stosować BSA jako kontrolę negatywną.</li>
	<li>Po poddaniu działaniu substancji należy zebrać komórki za pomocą podnośnika do komórek i odwirować je w temperaturze 500 x g, 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wybarwić komórki aneksyną V-Alexa 488 i 7-aminoaktynomycyną D (7-AAD) w 100 μl buforu wiążącego anektynę V przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć próbkę 200 μl buforu wiążącego aneksynę, delikatnie wymieszać, a następnie po okresie inkubacji przechowywać próbki na lodzie.</li>
	<li>Przeanalizuj wybarwione komórki tak szybko, jak to możliwe, za pomocą cytometrii przepływowej5. Aneksyna V-Alexa 488 jest wykrywana w kanale FITC, a 7-AAD jest wykrywana w kanale PerCP/PerCP-Cy5.5.</li>
</ol>
4. Wewnątrzkomórkowe barwienie ceramidami
<ol>
	<li>Po poddaniu działaniu kwasów tłuszczowych należy pobrać komórki, jak w kroku 3.3. Następnie utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie przez 30 minut.</li>
	<li>Przemyć próbkę 1 ml 1x PBS, odwirować w dół jak krok w 3.3 i zdekantować supernatant.</li>
	<li>Wybarwić komórki pierwszorzędowym przeciwciałem anty-ceramidowym (rozcieńczenie 1:200) w 100 μl 1x bufor permeabilizacyjny przez 30 min.</li>
	<li>Umyj i ponownie odwiruj ogniwa, jak w kroku 4.2.</li>
	<li>Wybarwić komórki przeciwciałem wtórnym anty-mysim IgM (rozcieńczenie 1:500) w 100 μl 1x bufor permeabilizacji przez 30 min.</li>
	<li>Umyj i ponownie odwiruj ogniwa, jak w kroku 4.2. Dodać 250 μL 1x PBS i przeanalizować wybarwione komórki metodą cytometrii przepływowej5. 
	UWAGA: Zapoznaj się ze szczegółową listą odczynników w Tabeli wyposażenia i odczynników.</li>
</ol>

<ol><li>Martins de Lima, T., Cury-Boaventura, M. F., Giannocco, G., Nunes, M. T., Curi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+fatty+acids+on+a+macrophage+cell+line+%28J774%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of fatty acids on a macrophage cell line (J774).</a> Clin Sci (Lond). 111 (5), 307-317 (2006).</li>
<li>Simard, J. R., Zunszain, P. A., Hamilton, J. A., Curry, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+high+and+low+affinity+fatty+acid+binding+sites+on+human+serum+albumin+revealed+by+NMR+drug-competition+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug-competition analysis.</a> J Mol Biol. 361 (2), 336-351 (2006).</li>
<li>Penn, A. H., Dubick, M. A., Torres Filho, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+Acid+Saturation+of+Albumin+Used+in+Resuscitation+Fluids+Modulates+Cell+Damage+in+Shock%3A+In+Vitro+Results+Using+a+Novel+Technique+to+Measure+Fatty+Acid+Binding+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Fatty Acid Saturation of Albumin Used in Resuscitation Fluids Modulates Cell Damage in Shock: In Vitro Results Using a Novel Technique to Measure Fatty Acid Binding Capacity.</a> Shock. , (2017).</li>
<li>Vusse, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Albumin+as+fatty+acid+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Albumin as fatty acid transporter.</a> Drug Metab Pharmacokinet. 24 (4), 300-307 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Fatty+Acid+Binding+Protein+Promotes+Saturated+Fatty+Acid-Induced+Macrophage+Cell+Death+through+Enhancing+Ceramide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adipose Fatty Acid Binding Protein Promotes Saturated Fatty Acid-Induced Macrophage Cell Death through Enhancing Ceramide Production.</a> J Immunol. 198 (2), 798-807 (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Fatty+Acid+binding+protein+promotes+skin+inflammation+induced+by+high-fat+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Epidermal Fatty Acid binding protein promotes skin inflammation induced by high-fat diet.</a> Immunity. 42 (5), 953-964 (2015).</li>
<li>Wen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-induced+NLRP3-ASC+inflammasome+activation+interferes+with+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling.</a> Nat Immunol. 12 (5), 408-415 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid-binding+protein+E-FABP+restricts+tumor+growth+by+promoting+IFN-beta+responses+in+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Fatty acid-binding protein E-FABP restricts tumor growth by promoting IFN-beta responses in tumor-associated macrophages.</a> Cancer Res. 74 (11), 2986-2998 (2014).</li>
<li>Ulloth, J. E., Casiano, C. A., De Leon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+and+stearic+fatty+acids+induce+caspase-dependent+and+-independent+cell+death+in+nerve+growth+factor+differentiated+PC12+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Palmitic and stearic fatty acids induce caspase-dependent and -independent cell death in nerve growth factor differentiated PC12 cells.</a> J Neurochem. 84 (4), 655-668 (2003).</li>
<li>Weischenfeldt, J., Porse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+Marrow-Derived+Macrophages+%28BMM%29%3A+Isolation+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications.</a> CSH Protoc. , (2008).</li>
<li>Dansen, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+binding+of+very-long-chain+fatty+acyl-CoA+esters+to+the+peroxisomal+non-specific+lipid-transfer+protein+%28sterol+carrier+protein-2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">High-affinity binding of very-long-chain fatty acyl-CoA esters to the peroxisomal non-specific lipid-transfer protein (sterol carrier protein-2).</a> Biochem J. 339 (Pt 1), 193-199 (1999).</li>
<li>Ulloth, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+methyl-beta-cyclodextrin+toxicity+in+NGF-differentiated+PC12+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of methyl-beta-cyclodextrin toxicity in NGF-differentiated PC12 cell death.</a> Neurotoxicology. 28 (3), 613-621 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak finansowego konfliktu interesów.

Właściwe przygotowanie roztworu kwasów tłuszczowych ma kluczowe znaczenie dla badania biologicznej funkcji kwasów tłuszczowych. Neutralizacja kwasu tłuszczowego zwiększa jego rozpuszczalność w roztworze wodnym. Jednak sole sodowe kwasów tłuszczowych, zwłaszcza nasyconych kwasów tłuszczowych, mają nadal niską rozpuszczalność w wodzie lub PBS, jak zaobserwowaliśmy. Jedną z metod jest użycie 95 - 100% etanolu, aby pomóc rozpuścić kwasy tłuszczowe1. Stosując tę metodę, można zaobserwować wyższą toksyc...

Kwasy tłuszczowe odgrywają kluczową rolę w metabolizmie energetycznym i w syntezie fosfolipidów błonowych w różnych rodzajach komórek. Kwasy tłuszczowe mają niską rozpuszczalność w wodzie. Odpowiednie przygotowanie kwasów tłuszczowych ma kluczowe znaczenie dla badania biologicznych funkcji kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków. Kiedy kwasy tłuszczowe są przygotowywane z etanolem, wiele kwasów tłuszczowych może wykazywać swoje toksyczne działanie mydła (detergentu) na błonę komórkową, nawet przy stosunkowo niskich stężeniach1. Jako naturalny, główny transporter wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy, albumina surowicy jest uważana za dobry nośnik do dostarczania kwasów tłuszczowych in vitro do testów funkcji kwasów tłuszczowych2,3,4. Jednak szczegóły dotyczące przygotowania koniugatu albuminy kwasu tłuszczowego i albuminy surowicy zwykle nie są dostępne, mimo że opublikowano wiele prac naukowych z użyciem kwasów tłuszczowych.
Makrofagi wykazują wysoką ekspresję białka wiążącego naskórkowe kwasy tłuszczowe i białka wiążącego kwasy tłuszczowe tłuszczu5,6,7,8. Aktywnie pobierają nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, które mogą regulować ich funkcje odpornościowe. Do zbadania wpływu kwasów tłuszczowych na makrofagi i inne komórki zastosowano różne metody przygotowania kwasów tłuszczowych1,7,9. Wykorzystanie odpowiednio przygotowanych koniugatów kwasów tłuszczowych i albumin surowicy w celu zbadania wpływu kwasów tłuszczowych na funkcję makrofagów ma kluczowe znaczenie w uzyskaniu danych o znaczeniu biologicznym. Badania nad wpływem kwasów tłuszczowych na funkcję makrofagów mogą dostarczyć podstawowej wiedzy i potencjalnych celów terapeutycznych związanych z metabolizmem kwasów tłuszczowych w chorobach związanych z makrofagami.

<table><tbody><tr><td>Kąpiel ultradźwiękowa CPX&nbsp;</td><td>Bransonic</td><td>Model 2800</td><td></td></tr><tr><td>Palmitynian sodu (PA)</td><td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1109</td><td>MWW 278</td></tr><tr><td>Stearynian sodu (SA)</td> <td>Nu-Chek Prep, Inc.</td><td>S-1111</td><td>M.W. 306</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA), bez kwasów tłuszczowych</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów myszy (mM-CSF)&nbsp;</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej,&nbsp; Inc.</td><td>5228</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>VWR International</td><td>71002-878</td><td></td></tr><tr><td>Aneksyna V, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalne przeciwciało antyceramidowe (mysie IgM)</td><td>Sigma</td><td>C8104-50TST</td><td>Klon: MID 15B4</td></tr><tr><td>Goat Anti-Mysz IgM Przeciwciało i mikrołańcuch, FITC koniugat</td><td>Sigma</td><td>AP128F</td><td></td></tr><tr><td>Bufor utrwalający</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td></td></tr><tr><td>Bufor permeabilizacji</td><td>Ebioscience</td><td>4307693</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do lizy czerwonych krwinek&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V Bufor wiążący</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>L929 komórki</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Podnośnik komórek&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-364</td><td></td></tr><tr><td>Uwaga: MW dotyczy masy cząsteczkowej.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami

Saturated Fatty Acids Induce Ceramide-associated Macrophage Cell Death

Makrofagi wykazują wysoką ekspresję białka wiążącego kwasy tłuszczowe naskórka i białka wiążącego kwasy tłuszczowe tłuszczu. Aktywnie pobierają nasycone i nienasycone kwasy tłuszczowe, które mogą odgrywać kluczową rolę w regulacji ich funkcji odpornościowych. Liczne badania wykazały, że różne kwasy tłuszczowe, nasycone lub nienasycone, mogą mieć różny wpływ na wzrost i funkcjonowanie komórek. Jednak podejścia stosowane do przygotowania kwasów tłuszczowych różnią się, co może prowadzić do wyników niefizjologicznych. Albumina surowicy, naturalny nośnik kwasów tłuszczowych we krwi obwodowej ssaków, jest zalecana do tworzenia sprzężonego kompleksu z solą sodową kwasów tłuszczowych w celu badania funkcji kwasów tłuszczowych w komórkach ssaków, minimalizując w ten sposób toksyczność mydła z kwasami tłuszczowymi. W ten sposób opracowano i przedstawiono prostą, stosunkowo szybką metodę podgrzewania i sonikacji do tworzenia koniugatu BSA-kwasów tłuszczowych. Opisujemy protokół wykorzystujący nasycone kwasy tłuszczowe, zwłaszcza kwasy stearynowe, w celu wywołania ciężkiej śmierci komórek w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Ponadto wykazujemy, że śmierć komórek wywołana nasyconymi kwasami tłuszczowymi jest pozytywnie związana ze skumulowanymi poziomami ceramidów w komórkach. Metoda ta może zostać rozszerzona o badania wpływu kwasów tłuszczowych na komórki innych ssaków.

Otyłość zwiększa stężenie wolnych kwasów tłuszczowych w surowicy. Jako profesjonalne fagocyty, makrofagi aktywnie pobierają kwasy tłuszczowe w celu utrzymania homeostazy organizmu. W przebiegu tych procesów nadmiar lipidów może indukować śmierć komórkową makrofagów. W tym celu hodowano BMDM in vitro z dietetycznymi stężeniami kwasów tłuszczowych charakterystycznymi dla otyłości, a śmierć komórkową makrofagów mierzono za pomocą barwienia cytometrycznego. W porównaniu z kontrolą BS...

Ilustrujemy prostą metodę pozyskiwania mysich pierwotnych makrofagów z komórek szpiku kostnego oraz prostą metodę przygotowania koniugatów BSA-kwasów tłuszczowych. Następnie wykazujemy, że nasycone kwasy tłuszczowe mogą indukować śmierć komórek makrofagów, a taka śmierć komórki jest pozytywnie związana z akumulacją komórek poziomu ceramidów.

Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami

Macrophages highly express epidermal fatty acid-binding protein and adipose fatty acid-binding protein. They actively uptake saturated and unsaturated ...

Ogólnym celem tego eksperymentu, w którym makrofagi są traktowane nasyconymi kwasami tłuszczowymi, jest wykazanie, że śmierć komórek makrofagów wywołana nasyconymi kwasami tłuszczowymi jest związana ze skumulowanymi poziomami komórkowymi ceramidów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia metabolicznego. Takich jak: śmierć komórek i stan zapalny wywołany nasyconymi kwasami tłuszczowymi.Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostego, ale szczegółowego podejścia do napędzania koniugatów kwasów tłuszczowych BSA. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ trudno jest przygotować dokładny, stabilny roztwór koniugatu kwasów tłuszczowych BSA ze spójnymi wynikami. Rozpocznij tę procedurę od usunięcia kości piszczelowej i udowej od poddanej eutanazji sześcio- lub ośmiotygodniowej zdrowej myszy typu dzikiego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Rozetnij oba końce kości piszczelowej i udowej nożyczkami i sterylnym kapturem do hodowli tkankowej. Przepłucz kości igłą o rozmiarze 25 z PBS i dwoma procentami płodowej surowicy bydlęcej do 15-mililitrowej probówki. Odwirować komórki szpiku kostnego w temperaturze 500 g w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze buforu do lizy czerwonych krwinek, aby lizować czerwone krwinki przez mniej niż jedną minutę. Natychmiast rozcieńczyć komórki dziewięcioma mililitrami 1x PBS. Ponownie odwirować, jak poprzednio, i zdekantować supernatant.Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 mililitrach 1x PBS. Następnie przefiltruj zawiesinę komórek przez sterylną 40-mikronową siatkę nylonową do innej 15-mililitrowej probówki, aby usunąć resztki komórek i grudki. Po odwirowaniu, jak poprzednio, ponownie zawiesić osad komórkowy w 15 mililitrach pożywki Roswell Park Memorial Institute 1640 z pięcioprocentową stężeniem FBS i 10 mikrogramami na mililitr gentamycyny.Następnie umieść komórki w 100-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i umieść je w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 60 minut. Delikatnie zakręć naczyniem, wyjmij pływające komórki i policz je. Następnie umieść 6 000 000 komórek w 100-milimetrowym naczyniu z 12 mililitrami pożywki różnicującej makrofagi i 10 nanogramami na mililitr rekombinowanego czynnika stymulującego kolonię makrofagów myszy lub MCSF przez dwa dni.Po dwóch dniach hodowli w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2, nakarm każde danie sześcioma mililitrami świeżych pożywek różnicujących makrofagi zawierających 10 nanogramów na mililitr MCSF. Piątego dnia wyjmij osiem mililitrów starej pożywki bez naruszania komórek i dodaj 10 mililitrów świeżych pożywek różnicujących makrofagi z 10 nanogramami na mililitr MCSF. Siódmego dnia zbierz makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego lub BMDM za pomocą podnośnika komórek.Potwierdź fenotyp BMDM za pomocą cytometrii przepływowej, zgodnie z zapisem w protokole tekstowym. Aby przygotować koniugat BSA z kwasami tłuszczowymi, należy przygotować pięciomilimolową pojedynczą sól sodową kwasów tłuszczowych w dwóch milimolowych BSA. W razie potrzeby podgrzej mieszaninę do 37 stopni Celsjusza lub wyższej.Następnie Sonic Heat mieszaninę dwóch milimolowych BSA i soli sodowej kwasów tłuszczowych, aż do uzyskania klarownego roztworu. Po sonikacji przefiltrować roztwór BSA kwasu tłuszczowego przez filtr 0,22 mikrona. Następnie przefiltrowany roztwór przelać do sterylnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra.Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do krótkotrwałego użytku lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania. Po przechowywaniu w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza nie należy zaobserwować opadów. Umieść BMDM w 24-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z 0,4 miliona komórek na mililitr w pożywkach różnicujących makrofagi.Traktuj komórki 0,4 milimolowym kwasem palmitynowym i kwasem stearynowym przez 16 do 24 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z pięcioprocentowym CO2. Użyj BSA jako kontroli negatywnej. Po zabiegu zbierz komórki za pomocą podnośnika komórkowego.Następnie wiruj komórki w temperaturze 500 g, cztery stopnie Celsjusza przez pięć minut. Wybarwić komórki aneksyną V-Alexa 488 i 7-AAD w 100 mikrolitrach buforu wiążącego Annexin-V przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć próbkę 200 mikrolitrami buforu wiążącego aneksyny i delikatnie wymieszać.Po okresie inkubacji próbki należy przechowywać na lodzie. Przeanalizuj wybarwione komórki tak szybko, jak to możliwe za pomocą cytometrii przepływowej. Aneksyna V-Alexa 488 jest wykrywana w kanale FITC, a 7-ADD jest wykrywana w kanale PerCP PerCP-Cy5.5.Po leczeniu kwasami tłuszczowymi zbierz komórki jak poprzednio. Następnie utrwal komórki w czteroprocentowym paraformaldehydzie przez 30 minut. Umyj próbkę jednomiliterową ilością 1x PBS przed odwirowaniem próbki jak poprzednio.Po dekantacji supernatantu wybarwić komórki pierwotnym przeciwciałem anty-ceramidowym w 100 mikrolitrach 1x buforu permeabilizacyjnego przez 30 minut. Po umyciu i odwirowaniu komórek jak poprzednio, wybarwić komórki przeciwciałem wtórnym anty-mysim IgM w 100 mikrolitrach 1x buforu permeabilizacyjnego przez 30 minut. Umyj i ponownie odwiruj ogniwa jak poprzednio.Następnie dodaj 250 mikrolitrów 1x PBS i przeanalizuj wybarwione komórki za pomocą cytometrii przepływowej. BMDM hodowano in vitro z otyłymi poziomami kwasów tłuszczowych w diecie, a śmierć komórek makrofagów mierzono za pomocą barwienia cytometrycznego przepływowego. W porównaniu z kontrolą BSA, nasycone kwasy tłuszczowe, w szczególności kwasy sterynowe, indukowały znaczną śmierć komórek BMDM.Martwe komórki pokazano jako podwójnie dodatnią populację wybarwioną aneksyną V i 7-AAD. Co więcej, śmierć komórek wywołana nasyconymi kwasami tłuszczowymi jest pozytywnie związana ze skumulowanymi poziomami ceramidów w makrofagach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować koniugacje kwasów tłuszczowych BSA i leczyć makrofagi koniugatami kwasów tłuszczowych BSA w celu zbadania śmierci komórek i stanu zapalnego.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się zapaleniem metabolicznym do zbadania śmierci komórek i stanu zapalnego wywołanego nasyconymi kwasami tłuszczowymi w otyłości.

saturated-fatty-acids-induce-ceramide-associated-macrophage-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Ten film pokazuje aktywację białek kaspazy u ludzkich makrofagów za pomocą białek reporterowych dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Prodomeny kaspazy-1 są połączone z niefluorescencyjnymi fragmentami białek Wenus, które są rekrutowane do kompleksów inflamasomowych. Bliskość inflamasomów indukuje ponowne fałdowanie i fluorescencję fragmentów Wenus, potwierdzając aktywację kaspazy w makrofagach.

Wizualizacja aktywacji kaspazy w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten film pokazuje ocenę wielokrotnych aktywacji kaspazy w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego poprzez stymulację wirusem grypy. Po lizie makrofagów, inaktywacji termicznej lizatu i odwirowaniu pobiera się kaspazy wewnątrzkomórkowe do późniejszej analizy immunologicznej.

Ocena aktywacji wielu kaspaz w makrofagach

Tutaj prezentujemy protokół do określania wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez fizyczną interakcję z sąsiednimi martwymi lub umierającymi komórkami. Protokół koncentruje się na zdarzeniach sygnalizacyjnych wywołanych przez rozpoznawanie martwych komórek za pośrednictwem receptora, w przeciwieństwie do ich wychwytu fagocytarnego lub uwalniania rozpuszczalnych mediatorów.

Identyfikacja wewnątrzkomórkowych zdarzeń sygnalizacyjnych indukowanych w żywotnych komórkach przez interakcję z sąsiednimi komórkami przechodzącymi apoptotyczną śmierć komórki

Ten protokół pozwala badaczowi na wyizolowanie i scharakteryzowanie makrofagów rezydujących w tkankach w różnych charakterystycznych tkankach objętych stanem zapalnym, pobranych z modeli zaburzeń metabolicznych wywołanych dietą.

Izolacja, charakterystyka i oczyszczanie makrofagów z tkanek dotkniętych stanem zapalnym związanym z otyłością

Opisujemy wykrywanie aktywacji inflamasomu NLRP3 na bazie komórkowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i barwienia dla aktywnej kaspazy-1 i adaptera, ASC. Przedstawiono test uwalniania dehydrogenazy mleczanowej w celu wykrycia lizy piroptotycznej w skali populacji. Techniki te można dostosować do badania wielu aspektów biologii inflamasomów.

Wykrywanie aktywacji inflamasomu i śmierci komórek piroptotycznych w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy

Ten protokół opisuje proces uzyskiwania makrofagów pochodzących z monocytów (MDM) z próbek ludzkiej krwi, prostą metodę skutecznego wprowadzania reporterów dwumolekularnej komplementacji fluorescencji kaspazy (BiFC) do ludzkiego MDM bez uszczerbku dla żywotności i zachowania komórek, oraz podejście oparte na obrazowaniu do pomiaru aktywacji kaspazy zapalnej w żywych komórkach.

Wizualizacja bliskości wywołanej zapalnymi kaspazami w ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów

Ten protokół opisuje kompleksową metodę oceny aktywacji kaspazy (kaspaza-1, kaspaza-3, kaspaza-7, kaspaza-8, kaspaza-9 i kaspaza-11) w odpowiedzi na modele infekcji zarówno in vitro, jak i in vivo (u myszy) infekcji, sterylnych zniewag i raka w celu określenia inicjacji szlaków śmierci komórki, takich jak piroptoza, apoptoza, nekroptoza i PANoptosis.

Ocena aktywacji kaspazy w celu oceny wrodzonej śmierci komórek odpornościowych

Ten protokół opiera się na indukowanej przez LPS i ATP śmierci makrofagów THP-1 zróżnicowanych PMA. Używamy cytometrii przepływowej do analizy podwójnego barwienia aneksyny V i 7-AAD w celu wykrycia śmierci komórki, wykorzystując całą komórkę i stosując skaningową mikroskopię elektronową do obserwacji morfologii błony komórkowej.

Śmierć makrofagów THP-1 różnicowanych przez PMA i ATP indukowana przez LPS i ATP i jej walidacja

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Poznaj metodę indukcji śmierci komórek makrofagów przez nasycone kwasy tłuszczowe i jej związek z akumulacją ceramidów. Technika ta pozwala badać mechanizmy zapalenia metabolicznego.

Nasycone kwasy tłuszczowe indukują śmierć komórek makrofagów związaną z ceramidami

Przeglądaj więcej filmów