Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy przy użyciu cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wystarczającej ilości komórek ze zwojów korzenia grzbietowego i nerwów kulszowych od pojedynczej myszy, aby móc przeprowadzić analizę komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ obwodowy materiał neuronalny generuje duże ilości zanieczyszczeń podczas trawienia. Główną zaletą tej metody jest to, że kilka markerów może być używanych jednocześnie do identyfikacji wielu typów komórek.

Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku diagnozy stanu zapalnego i immunopatologii podczas neuropatii. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w modele mysie, można ją również zastosować do innych organizmów, takich jak nerwy ludzkie i świńskie, z niewielkimi modyfikacjami. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą zmagać się z dużymi ilościami zanieczyszczeń generowanych przez trawienie.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy sekcji i dysocjacji komórek są trudne do wykonania, ponieważ materiał neuronalny na mysz jest ograniczony. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zobaczyliśmy protokół izolacji komórek łabędzia od nerwu kulszowego z laboratorium Steve'a Lacroix. Na początek przygotuj mysz zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym i ustaw ją brzuszną stroną do dołu, rozciągając kończyny dolne.

Następnie użyj kleszczy, aby obustronnie wypreparować całe nerwy kulszowe. Zacznij od oddzielenia tkanki mięśniowej od górnej części grzbietu uda i podążaj za nerwem w górę wzdłuż kręgosłupa. Przetnij nerw w miejscu, w którym wychodzi z kręgosłupa i bezpośrednio nad kolanem na drugim końcu.

Następnie przenieś wycięte nerwy do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej 1 mililitr lodowatego PBS. Przechowuj nerwy na lodzie. Następnie wyizoluj zwój korzenia grzbietowego.

Zacznij od przecięcia żeber równolegle do kręgosłupa i blisko niego po obu stronach. Następnie przeciąć poprzecznie kręgosłup na poziomie kości udowych po tylnej stronie i blisko czaszki po stronie przedniej. Usuń kręgosłup i użyj nożyczek do tęczówki, aby odciąć wszystkie mięśnie, tłuszcz i inne tkanki miękkie z kręgosłupa.

Następnie umieść kręgosłup stroną brzuszną skierowaną do góry i otwórz go, zaczynając od końca ogonowego, wsuwając jedną końcówkę nożyczek do kanału kręgowego w pozycji godziny 12 i przecinając kość. Postępując, aż cały kręgosłup zostanie przecięty, powtarzaj tę procedurę w pozycji godziny szóstej, aż kręgosłup zostanie przecięty na pół. Oddziel dwie połówki kręgosłupa, a następnie umieść próbkę pod mikroskopem preparacyjnym

Usuń rdzeń kręgowy, aby odsłonić nerwy rdzeniowe, a następnie zlokalizuj i usuń gangliony korzenia grzbietowego odcinka lędźwiowego, delikatnie pociągając za korzeń grzbietowy, aby wciągnąć go do kanałów kręgowych. Następnie użyj nożyczek do tęczówki, aby przyciąć nerwy i tkankę łączną wokół zwoju korzenia grzbietowego. Za pomocą kleszczy przenieś gangliony korzenia grzbietowego do 1,5 mililitrowej rurki i przechowuj je na lodzie.

Zlokalizowanie ganglionów korzenia grzbietowego, wydobycie ich bez uszkodzenia i uwolnienie z nerwu rdzeniowego wymaga ćwiczeń i umiejętności. Przygotować pożywkę wytrawiającą, uzupełnić ją o sto mikrogramów na mililitr dezoksyrybonukleazy i przechowywać na lodzie. Następnie dodaj 500 mikrolitrów pożywki wytrawiającej do każdej z probówek z nerwami kulszowymi i zwojami korzenia grzbietowego.

W przypadku nerwów kulszowych posiekaj materiał 15 do 20 razy za pomocą nożyczek sprężynowych, a następnie inkubuj zawiesiny tkanek w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut z delikatnym mieszaniem. Po inkubacji należy kilkakrotnie rozcierać zawiesinę komórek przez końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów, aby mechanicznie zdysocjować niecałkowicie strawioną tkankę. Powtórzyć rozcieranie przez końcówkę pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów.

Następnie inkubować próbkę przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Przygotuj lodowaty bufor FACS i użyj go do przepłukania i namoczenia sitka ze stali nierdzewnej o rozmiarze oczek 140 mikronów na 60-milimetrowej szalce Petriego na lodzie. Następnie użyj kleszczy, aby przytrzymać filtr sitowy 140 mikronów nad szalką Petriego i wielokrotnie przepuszczaj zawiesiny tkanek przez filtr.

Zbierz zawiesinę komórek z szalki Petriego i przenieś ją do tej samej 1,5 mililitrowej probówki przechowywanej na lodzie. Przepchnąć niecałkowicie strawioną tkankę, która pozostała na filtrze, przez wielokrotne rozcieranie końcówką pipety o pojemności 1 000 mikrolitrów. Następnie dwukrotnie przepłucz filtr sitowy 500 mikrolitrami buforu FACS i połącz go z zawiesiną komórek w 1,5 mililitrowej probówce.

Jeśli zbyt duża część próbki nie zostanie całkowicie strawiona i przepuszczona przez metalową siatkę, może dojść do utraty komórek, a analiza metodą cytometrii przepływowej może być niemożliwa. Odwirować zawiesiny komórek i odrzucić supernatant. Następnie ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym mililitrze bufora FACS.

Powtórz ten etap mycia raz, ponownie zawieszając ostatnią osadkę komórkową w 150 do 350 mikrolitrach buforu FACS. Komórki są teraz gotowe do barwienia. W komputerze należy wybrać odpowiednie kanały do wykrywania interesujących nas fluoroforów, odpowiednie natężenie przepływu próbek oraz całkowitą liczbę zdarzeń, które mają być zebrane na próbkę.

Minimalna liczba wydarzeń powinna wynosić jeden milion. Następnie utwórz wykresy punktowe w globalnym arkuszu rozrzutu bocznego A w porównaniu z rozproszeniem do przodu A, a także dla każdego interesującego fluoroforu w porównaniu z rozproszeniem do przodu A.Utwórz również widok statystyczny, który wyświetli liczbę zdarzeń i średnią intensywność fluorescencji dla wybranych fluoroforów. Określ bramkę nadrzędną, P1, na podstawie wykresu punktowego z kontrolek barwienia DAPI.

Dołącz próbkę do cytometrii przepływowej i kliknij pobierz. Obserwuj wykres DAPI w stosunku do FSC i zmniejsz napięcie pacyficznego kanału niebieskiego DNA, aż populacja DAPI+ stanie się widoczna. Korzystając z narzędzia do bramkowania prostokąta, narysuj ramkę wokół populacji DAPI+.

Reprezentuje to bramkę P1. Wybierz wykresy punktowe dla każdego z fluoroforów i wyświetl tylko zdarzenia DAPI+. Reprezentuje to fluorescencję tła dla każdego z fluoroforów.

Korzystając również z bramkowania prostokąta, narysuj ramkę na wykresach punktowych dla każdego z fluoroforów, zaczynając od 103 na osi y. Ta bramka reprezentuje region, w którym powinny znajdować się pozytywne zdarzenia dla każdego z podanych znaczników. Dostosuj napięcie dla każdego z fluoroforów za pomocą regulatorów barwienia tylko DAPI.

Dołącz próbkę do cytometrii przepływowej i kliknij pobierz. Obserwuj położenie populacji DAPI+ dla każdego z fluoroforów i dostosuj odpowiednie napięcia tak, aby populacje wypadały poza bramę prostokąta. Po skonfigurowaniu cytometru przepływowego uruchom próbki i wyeksportuj pliki Forward Scatter do dalszej analizy.

Wypłukanie plamy DAPI przed analizą za pomocą cytometrii przepływowej zmniejszyło intensywność fluorescencji niejądrowych szczątków. Pozwoliło to na wykluczenie materiału znajdującego się na górnym końcu osi rozproszenia do przodu, który zawiera nie w pełni strawioną tkankę, w selekcji populacji singletów. Ogólnie rzecz biorąc, ponad 30 000 singletów można regularnie uzyskać z dwóch pełnych nerwów kulszowych i ponad 200 000 singletów można uzyskać ze zwojów korzenia grzbietowego.

Z nerwów kulszowych około 5% podkoszulków wyrażało CD45 na swojej powierzchni, podczas gdy około 5% do 10% stwierdzono ekspresję w zwojach korzenia grzbietowego, definiując w ten sposób te komórki jako leukocyty pochodzenia krwiotwórczego. Większość singletów CD45 dodatnich również wyrażała MHC klasy II w sposób stopniowy. W zwojach korzenia grzbietowego CD11b może być jednak używany do wykrywania komórek podobnych do mikrogleju; Ta populacja mikrogleju jest nieobecna w nerwach kulszowych.

W nerwie kulszowym i zwoju korzenia grzbietowego od 2% do 5% podkoszulki ulega ekspresji CD68. W nerwach kulszowych około 60%80% makrofagów CD68 dodatnich ulega ekspresji CD206. Podczas gdy mniejsza część CD68 dodatniego koekspresja CD206 w zwoju korzenia grzbietowego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby utrzymywać stałą temperaturę, aby zapewnić stały wynik. Po jej opracowaniu technika ta pozwoliła naukowcom zajmującym się cukrzycą na zbadanie toksycznego działania streptozotocyny stosowanej do wywoływania cukrzycy u myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać cytometrię przepływową na obwodowej tkance neuronalnej.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów ochronnych.