4.12: Wykrywanie reaktywnych form tlenu

Reaktywne formy tlenu wytwarzane w komórkach są zaangażowane w homeostazę tkanek, starzenie się komórek i stany chorobowe, takie jak rak. Jak sama nazwa wskazuje, cząsteczki te powstają z tlenu, który naturalnie występuje jako stabilna cząsteczka dwutlenu, ponieważ wszystkie jego elektrony są sparowane. Dodanie jednego niesparowanego elektronu sprawia, że jest on niestabilny i prowadzi do powstania anionu ponadtlenkowego - formy reaktywnej formy tlenu lub ROS. Oprócz anionu ponadtlenkowego istnieje kilka rodzajów reaktywnych związków z niesparowanymi elektronami, których poziomy komórka stara się ściśle kontrolować.

W tym filmie dowiemy się, w jaki sposób reaktywne formy tlenu są powiązane z metabolizmem komórkowym i chorobami, poznamy zasady stojące za testem do jego wykrywania za pomocą sondy fluorescencyjnej i omówimy uogólniony protokół tego testu. Na koniec przyjrzymy się, w jaki sposób naukowcy wdrażają tę metodę w dzisiejszych eksperymentach.

Najpierw omówmy, w jaki sposób wytwarzane są reaktywne formy tlenu i rozważmy ich wpływ na metabolizm komórkowy i choroby.

Znaczącym źródłem reaktywnych komórkowych form tlenu są mitochondria. Normalnie podczas metabolizmu komórkowego elektrony są transportowane przez łańcuch kompleksów białkowych, czego kulminacją jest redukcja tlenu cząsteczkowego do wody i jednoczesne wytwarzanie ATP. Pomimo nadzwyczajnej regulacji tego procesu, elektrony wyciekają, co powoduje powstanie anionu ponadtlenkowego.

Obecność anionu ponadtlenkowego szybko powoduje powstawanie innych form reaktywnych form tlenu, takich jak nadtlenek wodoru i rodnik hydroksylowy. Te rodniki, z których wszystkie posiadają wysoce reaktywny niesparowany elektron, mogą oksydacyjnie uszkadzać błony, DNA i białka. Aby temu przeciwdziałać, komórka utrzymuje własne zapasy przeciwutleniaczy enzymów, takich jak dysmutaza ponadtlenkowa lub cząsteczki, takie jak witamina C, które redukują wolne rodniki. Każda nierównowaga w tym systemie obronnym może skutkować potencjalnie śmiertelną pętlą dodatniego sprzężenia zwrotnego, powodującą stan nadmiernej reaktywności form tlenu, znany jako stres oksydacyjny.

Reaktywne formy tlenu są zaangażowane w inicjację i progresję raka. Innym szkodliwym działaniem tych cząsteczek jest indukcja starzenia się komórek, znana również jako starzenie się. "Wolnorodnikowa teoria starzenia się" sugeruje, że reaktywne formy tlenu wytwarzane w komórkach podczas normalnego metabolizmu wywołują starzenie się i śmierć komórek.

Do tej pory omawialiśmy negatywne aspekty tych wysoce reaktywnych cząsteczek, ale odgrywają one również pozytywną rolę w fizjologii komórki. Podczas odpowiedzi immunologicznej, gdy fagocyty pochłaniają patogeny, komórki wywołują "wybuch oddechowy", podczas którego generowane są nadmierne ilości reaktywnych form tlenu w celu oksydacyjnej degradacji patogenów. Ponadto są niezbędnymi półproduktami i regulatorami różnych szlaków sygnalizacji komórkowej, a nawet mogą sygnalizować śmierć komórek, które przekształciły się w rakowe.

Aby określić ilościowo te wpływowe utleniacze komórkowe, naukowcy wykorzystują cząsteczki, które po utlenieniu zmieniają kolor na fluorescencyjny. Powszechnie stosowaną sondą do wykrywania reaktywnych form tlenu jest H₂DCFDA lub dichloro-dihydrofluoresceina dioctan lub dichloro-dihydrofluoresceina, niefluorescencyjny analog fluoresceiny. Po dodaniu do komórek, jego przepuszczalna natura komórkowa pozwala mu pasywnie dyfundować.

Następnie esterazy wewnątrzkomórkowe katalizują reakcję hydrolizy, w wyniku której dochodzi do rozszczepienia grup octanowych. To sprawia, że związek jest bardziej polarny, dzięki czemu jest zatrzymywany w komórce. Po utlenieniu, które polega na usunięciu atomów wodoru przez szeroką gamę reaktywnych form tlenu, H2DCFDA niefluorescencyjny jest przekształcany w wysoce fluorescencyjną dichlorofluoresceinę lub DCF. Można to odczytać i określić ilościowo za pomocą czytnika płytek, cytometru przepływowego lub mikroskopii fluorescencyjnej.

Teraz, gdy już wiesz, jak działa ten test, zobaczmy, jak jest on wykonywany w warunkach laboratoryjnych.

Zacznij od przeniesienia komórek wyhodowanych w pożywce hodowlanej do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, a następnie odwirowania w celu ich umycia. Usuń supernatant i dodaj sondę fluorescencyjną H₂DCFDA. Inkubuj komórki obciążone barwnikiem w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. Po inkubacji umyj komórki, aby usunąć niezaładowany barwnik i przenieś komórki na płytkę. W tym momencie można dodać eksperymentalne induktory stresu oksydacyjnego.

Gdy komórki są gotowe do analizy, można je włożyć do czytnika płytek. Długości fal wzbudzenia i emisji są ustawione dla fluoresceiny. Po odczytaniu tabliczek można analizować wartości. Wyniki ujawniają względną ilość reaktywnych form tlenu między próbkami w określonych punktach czasowych.

Teraz, gdy przeanalizowaliśmy rzeczywisty protokół, przyjrzyjmy się, jak jest on stosowany w dzisiejszych eksperymentach.

Naukowcy często używają tej metody do badania mechaniki fagocytozy. Ta grupa naukowców chciała zbadać zdolność danio pręgowanego do uzyskania odpowiedzi immunologicznej na różnych etapach rozwoju. Jak wspomniano wcześniej, fagocytoza powoduje wytwarzanie wysoce reaktywnych form tlenu lub "wybuchu oddechowego", który jest używany do zabijania patogenów. Ponieważ enzym oksydaza NADPH jest znaczącym producentem ROS w komórkach fagocytarnych, naukowcy ci wywołali reakcję burst, traktując danio pręgowanego induktorem NADPH. Wyniki wykazały, że wśród zarodków danio pręgowanego, u których sprowokowana została reakcja "wybuchowa", te po 72 godzinach od zapłodnienia wykazywały wyższy rozwój reaktywnych form tlenu niż te po 48 godzinach od zapłodnienia.

Dysfunkcja mitochondriów spowodowana zwiększoną liczbą reaktywnych form tlenu jest patologiczną cechą wielu chorób. Dlatego naukowcy mogą zidentyfikować dysfunkcję mitochondriów, mierząc poziom stresu oksydacyjnego. W tym przypadku naukowcy załadowali H2DCFDA do neuronów, a następnie zamontowali próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po dodaniu stresora oksydacyjnego, takiego jak nadtlenek wodoru, ciała komórkowe wykazywały nagły wzrost fluorescencji, co może wskazywać na dysfunkcję mitochondriów.

Sugeruje się, że astrocyty chronią neurony ośrodkowego układu nerwowego przed stresem oksydacyjnym. Ze względu na to znaczenie naukowcy postawili sobie za cel opracowanie testu do wykrywania stresu oksydacyjnego w astrocytach w obecności zewnętrznego induktora. Dokonali tego poprzez inkubację astrocytów z nadtlenkiem wodoru i sondą fluorescencyjną do wykrywania reaktywnych form tlenu. Następnie wytworzona fluorescencja była analizowana za pomocą cytometru przepływowego. Zaobserwowano, że astrocyty aktywowane do stresu oksydacyjnego mieszczą się w obszarze o zwiększonej intensywności fluorescencji, widocznym przesuniętym w prawo.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat wykrywania reaktywnych form tlenu lub ROS. Podsumowując, w tym filmie omówiliśmy związek między reaktywnymi formami tlenu, metabolizmem komórkowym i chorobą. Następnie zbadaliśmy zasadę i procedurę testu do wykrywania reaktywnych form tlenu. Na koniec zbadaliśmy, w jaki sposób naukowcy stosują tę metodę w swoich badaniach. Analiza wciąż enigmatycznych ról reaktywnych form tlenu cieszy się dużym zainteresowaniem biologów komórkowych, a wiarygodne pomiary za pomocą sond fluorescencyjnych okazują się nieocenione. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!