Name: Zastosowanie synaptycznej histochemii w celu ujawnienia różnych regionów i blaszek w rozwijającym się i dorosłym mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Odkryj metodę histochemiczną barwienia cynkiem w mózgu fretki, która pozwala wizualizować wzorce warstwowe i regionalne w rozwijającym się i dorosłym mózgu. Technika ta umożliwia niezawodne identyfikowanie różnych obszarów mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z National Center for Research Resources (2G12RR03060-26A1); Narodowy Instytut Zdrowia Mniejszości i Dysproporcji Zdrowotnych (8G12MD007603-27) z Narodowych Instytutów Zdrowia; Kongres Kadry Zawodowej – Uniwersytet Miejski w Nowym Jorku (PSC-CUNY); oraz Grant Badawczy Wydziału (FRG II) Amerykański Uniwersytet w Szardży. Dziękujemy Vidyasagar Sriramoju za zapoznanie nas z tymi metodami.

<ol><li>Nakashima, A., Dyck, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026685">Zinc and cortical plasticity.</a> Brain Res. Rev. 59, 347-373 (2009).</li>
<li>Frederickson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+zinc+and+zinc-containing+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of zinc and zinc-containing neurons.</a> Int Rev Neurobiol. 31, 145-238 (1989).</li>
<li>Beaulieu, C., Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+glutamate+in+zinc-containing+terminals+of+the+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroReport%22%5BJournal%5D)">Enrichment of glutamate in zinc-containing terminals of the cat visual cortex.</a> NeuroReport. 3 (10), 861-864 (1992).</li>
<li>Martinez-Guijarro, F. J., Soriano, E., Del Rio, J. A., Lopez-Garcia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-positive+boutons+in+the+cerebral+cortex+of+lizards+show+glutamate+immunoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Zinc-positive boutons in the cerebral cortex of lizards show glutamate immunoreactivity.</a> J Neurocytol. 20 (10), 834-843 (1991).</li>
<li>Dyck, R., Beaulieu, C., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histochemical+localization+of+synaptic+zinc+in+the+developing+cat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histochemical localization of synaptic zinc in the developing cat visual cortex.</a> J Comp Neurol. 329 (1), 53-67 (1993).</li>
<li>Garrett, B., Geneser, F. A., Slomianka, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Distribution of acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the mouse.</a> Anat Embryol. (Berl). 184 (5), 461-468 (1991).</li>
<li>Garrett, B., Osterballe, R., Slomianka, L., Geneser, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoarchitecture+and+staining+for+acetylcholinesterase+and+zinc+in+the+visual+cortex+of+the+Parma+wallaby+%28Macropus+parma%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">Cytoarchitecture and staining for acetylcholinesterase and zinc in the visual cortex of the Parma wallaby (Macropus parma).</a> Brain Behav Evol. 43 (3), 162-172 (1994).</li>
<li>Dyck, R., Cynader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+interdigitated+columnar+mosaic+of+cytochrome+oxidase%2C+zinc%2C+and+neurotransmitter-related+molecules+in+cat+and+monkey+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">An interdigitated columnar mosaic of cytochrome oxidase, zinc, and neurotransmitter-related molecules in cat and monkey visual cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. (90), 9066-9069 (1993).</li>
<li>Land, P. W., Akhtar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+alteration+of+synaptic+zinc+in+rat+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Somatosens+Mot+Res%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent alteration of synaptic zinc in rat somatosensory barrel cortex.</a> Somatosens Mot Res. 16 (2), 139-150 (1999).</li>
<li>Danscher, G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00543951">Exogenous selenium in the brain: a histochemical technique for light and electron microscopic localization of catalytic selenium bonds.</a> Histochemistry. 76, 281-293 (1982).</li>
<li>Danscher, G., Howell, G., Perez-Clausell, J., Hertel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dithizone%2C+Timm%27s+sulphide+silver+and+the+selenium+methods+demonstrate+a+chelatable+pool+of+zinc+in+CNS%3A+a+proton+activation+%28PIXE%29+analysis+of+carbon+tetrachloride+extracts+from+rat+brains+and+spinal+cords+intravitall+treated+with+dithizone%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The dithizone, Timm's sulphide silver and the selenium methods demonstrate a chelatable pool of zinc in CNS: a proton activation (PIXE) analysis of carbon tetrachloride extracts from rat brains and spinal cords intravitall treated with dithizone.</a> Histochemistry. 83, 419-422 (1985).</li>
<li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol+Res%22%5BJournal%5D)">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurol Res. 1 (2), 203-209 (1979).</li>
<li>Wong-Riley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+visual+system+of+monocularly+sutured+or+enucleated+cats+demonstrable+with+cytochrome+oxidase+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry.</a> Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).</li>
<li>Miró-Bernié, N., Ichinohe, N., Perez-Clausell, J., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-rich+transient+vertical+modules+in+the+rat+retrosplenial+cortex+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Zinc-rich transient vertical modules in the rat retrosplenial cortex during postnatal development.</a> J Neurosci. 138 (2), 523-535 (2006).</li>
<li>Ichinohe, N., Rockland, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+macaque+monkey+amygdala%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the macaque monkey amygdala.</a> J Comp Neurol. 489 (2), 135-147 (2005).</li>
<li>Innocenti, G. M., Manger, P. R., Masiello, I., Colin, I., Tettoni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+and+callosal+connections+of+visual+areas+17%2C+18%2C+19+and+21+in+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Architecture and callosal connections of visual areas 17, 18, 19 and 21 in the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12 (4), 411-422 (2002).</li>
<li>Khalil, R., Levitt, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+histochemistry+reveals+circuit+refinement+and+distinguishes+visual+areas+in+the+developing+ferret+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Zinc histochemistry reveals circuit refinement and distinguishes visual areas in the developing ferret cerebral cortex.</a> Brain Struct Funct. 218, 1293-1306 (2013).</li>
<li>Manger, P. R., Masiello, I., Innocenti, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Areal+organization+of+the+posterior+parietal+cortex+of+the+ferret+%28Mustela+putorius%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Areal organization of the posterior parietal cortex of the ferret (Mustela putorius).</a> Cereb Cortex. 12, 1280-1297 (2002).</li>
<li>Wong, P., Kaas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectonic+subdivisions+of+neocortex+in+the+gray+squirrel+%28Sciurus+carolinensis.%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+anatomical+record%22%5BJournal%5D)">Architectonic subdivisions of neocortex in the gray squirrel (Sciurus carolinensis.).</a> The anatomical record. 291, 1301-1333 (2008).</li>
<li>Land, P. W., Shamalla-Hannah, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+zinc-containing+cortical+circuits+during+a+critical+period+of+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of zinc-containing cortical circuits during a critical period of postnatal development.</a> J Comp Neurol. 447 (1), 43-56 (2002).</li>
<li>Czupryn, A., Skangiel-Kramska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+synaptic+zinc+in+the+developing+mouse+somatosensory+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Distribution of synaptic zinc in the developing mouse somatosensory barrel cortex.</a> J Comp Neurol. 386, 652-660 (1997).</li>
<li>Timm, F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00665092">Zur Histochemie der Schwermetalle. Das Sulfid-Silber-Verfahren.</a> Dtsch Z ges gerichtl Med. 46, 706-711 (1958).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W obecnym badaniu zastosowano technikę histochemiczną opartą na zmodyfikowanej wersji metody Danschera (1982)10, za pomocą której synaptyczna lokalizacja może być wykryta i uwidoczniona w mózgu. Metoda ta zasadniczo polega na wstrzyknięciu zwierzęciu chelatora seleninu sodu (Na2SeO3) (15 mg/kg). Po wstrzyknięciu selenit przemieszcza się do mózgu i wiąże się z wolnym, który jest zlokalizowany w pęcherzykach presynaptycznych neuronów zawierających. Jony związane z cząsteczkami ...

Plamy histologiczne były tradycyjnie używane do pomocy w identyfikacji obszarów korowych u różnych gatunków poprzez ujawnianie różnic w cechach architektonicznych. Połączone zastosowanie technik histochemicznych, takich jak substancja Nissl, reaktywność oksydazy cytochromowej (CO) lub mielina, może okazać się owocne, ponieważ ujawniają podobne granice powierzchniowe w dorosłym mózgu. Jednak te plamy histochemiczne nie zawsze odpowiednio ujawniają wyraźne granice między obszarami i warstwami kory mózgowej w niedojrzałym mózgu.
W ośrodkowym układzie nerwowym pełni kilka kluczowych funkcji, takich jak stabilizacja struktury DNA, działanie jako kofaktor enzymu, udział w licznych funkcjach regulacyjnych oraz działanie jako neuromodulator poprzez swoją obecność w pęcherzykach synaptycznych1. synaptyczny jest wyjątkowy, ponieważ można go uwidocznić za pomocą metod histologicznych, podczas gdy związany z białkiem nie może być wizualizowany2. Ta cecha została wykorzystana do ujawnienia synaptycznego wzorca w różnych regionach kory mózgowej, a synaptyczna histochemia została wykorzystana w wielu badaniach. Podzbiór neuronów glutaminergiczny w korze mózgowej zawiera w pęcherzykach presynaptycznych w ich końcach aksonów3,4. Badania histochemiczne wykazały niejednorodny rozkład synaptycznego w korze mózgowej5,6,7. Wydaje się, że istnieje różny powierzchniowy i laminarny rozkład histochemicznie reaktywnego w różnych obszarach kory mózgowej (np. kora wzrokowa kontra kora somatosensoryczna) lub warstwach (np. poziomy w warstwach nadziarnistych i podziarnistych pierwszorzędowej kory wzrokowej są znacznie wyższe niż w warstwie wejściowej IV wzgórza przy stosunkowo niskich poziomach synaptycznego)5,8,9. Niejednorodność synaptycznego barwienia obserwowana w korze jest szczególnie korzystna, ponieważ ułatwia identyfikację powierzchniową i laminarną.
Tutaj prezentujemy szczegółowy opis synaptycznej procedury histochemicznej, która jest zmodyfikowaną wersją metody Danschera z 1982 roku10. Metoda ta wykorzystuje selenit wstrzykiwany dootrzewnowo (IP) zwierzętom jako czynnik chelatujący. selenit przemieszcza się do mózgu, aby reagować z pulami wolnego znajdującymi się w pęcherzykach podzbioru synaps glutaminergicznego w mózgu. W wyniku tej reakcji powstaje osad, który może być następnie wzmocniony przez rozwój srebra2,10,11.
Ta procedura ujawnia laminarne i powierzchniowe wzorce synaptycznego barwienia; analiza densytometryczna może być wykorzystana do oceny tych wzorców zarówno jakościowo, jak i ilościowo w dorosłym i niedojrzałym mózgu, do badania efektów innych interwencji, takich jak manipulacje sensoryczne, środowiskowe, farmakologiczne lub genetyczne. Co więcej, można również chcieć ocenić potencjalne zmiany rozwojowe w dystrybucji synaptycznego w innych strukturach korowych lub podkorowych w innych systemach modelowych. Informacje ilościowe, które analiza densytometryczna dostarcza w tej metodzie, mogą być korzystne dla śledzenia rozwoju mózgu w czasie. Protokół ten stanowi uzupełnienie innych markerów immunologicznych i histochemicznych w celu ujawnienia granic laminarnych i powierzchniowych.

<table><tbody><tr><td>Euthasol (roztwór do eutanazji)</td><td>Henry Schein</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214485</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina (Ketaved)</td><td>Henry Schein</td><td>48858</td><td>100 mg / ml do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Ksylazyna (znieczulona)</td><td>Henry Schein</td><td>33198</td><td>100 mg / ml do wstrzykiwań</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Rozcieńczony do 4%</td></tr><tr><td>Guma arabska</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9752-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W302600</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochinon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9003</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan srebra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85210</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna rybna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2506</td> <td>(Typ III, z serca konia)</td></tr> <tr><td>Catalse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C10</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Domino</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksylen Fisher</td><td>Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Permount Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A406-20</td><td>Służy do odwadniania przed montażem szkiełek</td></tr><tr><td>nakrywkowych</td><td>Laboratoria Badań Mózgu</td><td>#3660-1</td><td></td></tr><tr><td>Matowe szkiełka bez podkładu</td><td>Laboratoria Badań Mózgu</td><td>#3875-FR</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>American Optical Company</td><td>860</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX-60</td><td></td></tr><tr><td>Adope Photoshop</td><td>Adobe Systems, San Jose, CA</td><td></td><td>Aby złożyć obrazy</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Bezpłatne oprogramowanie można pobrać ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/</td><td></td> <td>Do pomiarów densometrycznych</td></tr><tr><td>Plastikowa taca</td> Do <td>zanurzenia szkiełek w roztworze deweloperskim</td>można <td>użyć</td><td></td> dowolnej standardowej plastikowej tacki</tr><tr><td>Płyta grzejna</td><td>Można użyć</td><td></td><td></td> dowolnej standardowej płyty grzejnej</tr></tbody></table>

zastosowanie synaptycznej histochemii w celu ujawnienia różnych regionów i blaszek w rozwijającym się i dorosłym mózgu

Use of Synaptic Zinc Histochemistry to Reveal Different Regions and Laminae in the Developing and Adult Brain

Charakterystyka anatomicznej i funkcjonalnej organizacji i rozwoju mózgu wymaga dokładnej identyfikacji odrębnych obwodów i regionów neuronalnych w niedojrzałym i dorosłym mózgu. Tutaj opisujemy procedurę barwienia histochemicznego, która ujawnia różnice we wzorach barwienia między różnymi warstwami i regionami mózgu. Inni wykorzystali tę procedurę nie tylko do ujawnienia rozmieszczenia neuronów i obwodów zawierających w mózgu, ale także do pomyślnego wyznaczenia granic powierzchniowych i laminarnych w rozwijającym się i dorosłym mózgu u kilku gatunków. Tutaj ilustrujemy tę procedurę barwienia obrazami z rozwijających się i dorosłych mózgów fretek. Ujawniamy wzór barwienia, który służy jako anatomiczny marker obszarów i warstw i może być niezawodnie używany do rozróżniania obszarów kory wzrokowej w rozwijającej się i dorosłej korze wzrokowej. Głównym celem tego protokołu jest przedstawienie metody histochemicznej, która pozwala na dokładną identyfikację warstw i regionów w rozwijającym się i dorosłym mózgu, gdzie inne metody tego nie robią. Po drugie, w połączeniu z densytometryczną analizą obrazu, metoda ta pozwala ocenić rozkład synaptycznego, aby ujawnić potencjalne zmiany w trakcie rozwoju. Protokół ten szczegółowo opisuje odczynniki, narzędzia i kroki niezbędne do sukcesywnego barwienia zamrożonych fragmentów mózgu. Chociaż protokół ten jest opisany przy użyciu tkanki mózgowej fretki, można go łatwo dostosować do stosowania u gryzoni, kotów lub małp, a także w innych obszarach mózgu.

Główne kroki związane z tym protokołem barwienia sekcji mózgu pod kątem synaptycznego są przedstawione na schemacie blokowym w Rysunek 1. Protokół można podzielić na trzy fazy: 1) Perfuzja i pobranie tkanek, 2) Przygotowanie i barwienie tkanek oraz 3) Histochemia. Krótko mówiąc, w pierwszej fazie protokołu zwierzę jest znieczulane i wstrzykuje się mu IP odpowiednią dawkę seleninu sodu. Po upływie odpowiedniego czasu (najlepiej 60 - 90 minut) zwierzę jest nast...

Opisujemy procedurę histochemiczną, która ujawnia charakterystyczne wzorce barwienia laminarnego i powierzchniowego w różnych obszarach mózgu. Wzór barwienia może być używany w połączeniu z innymi markerami anatomicznymi, aby niezawodnie rozróżniać warstwy i regiony w rozwijającym się i dorosłym mózgu.

Zastosowanie synaptycznej histochemii w celu ujawnienia różnych regionów i blaszek w rozwijającym się i dorosłym mózgu

Characterization of anatomical and functional brain organization and development requires accurate identification of distinct neural circuits and regions ...

Ogólnym celem tej metody jest przeprowadzenie barwienia histochemicznego na zamrożonych skrawkach mózgu fretki w celu zilustrowania wykorzystania wzorców barwienia synaptycznego w rozróżnianiu różnych regionów i warstw w rozwijającym się i dorosłym mózgu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak jakościowe i ilościowe różnice we wzorze barwienia synaptycznego między różnymi regionami i warstwami mózgu. Główną zaletą jest to, że technika ta jest prosta i niezawodna, co pozwala zidentyfikować różne regiony i warstwy w rozwijającym się i dorosłym mózgu na podstawie unikalnych wzorów barwienia.Chociaż metoda ta została wykorzystana do zapewnienia wglądu w wyznaczanie obszarów i warstw w dzikiej korze wzrokowej, może być również używana do różnicowania warstw w różnych regionach mózgu gryzoni, kotów lub naczelnych. Aby przygotować 200 mililitrów roztworu wywoływacza, powoli dodawaj 40 gramów gumy arabskiej do 120 mililitrów gorącej wody i mieszaj szklaną pałeczką, aby całkowicie się rozpuściła. Następnie pozwól mu ostygnąć przez kilka minut, a następnie przefiltruj go przez sześć do ośmiu warstw gazy w lejku.Następnie dodaj 5,04 grama kwasu cytrynowego i 4,7 grama cytrynianu sodu w 20 mililitrach wody destylowanej i rozpuść, aby uzyskać bufor cytrynianu. Następnie dodaj 1,7 grama hydrochinonu do 30 mililitrów podgrzanej wody destylowanej. Dodaj 0,22 grama mleczanu srebra do 30 mililitrów wody, aby uzyskać roztwór mleczanu srebra.W następującej kolejności wymieszaj roztwory gumy arabskiej, buforu cytrynianowego, hydrochinonu, a na końcu mleczanu srebra, aby przygotować roztwór wywoływacza i trzymać go w ciemności. Aby rozpocząć tę procedurę, wstrzyknąć dawkę 15 miligramów na kilogram masy ciała roztworu seleninu sodu, chelatora, dootrzewnowo do znieczulonej fretki. Następnie odczekaj od 60 do 90 minut, aż roztwór seleninu sodu dotrze do mózgu.Następnie wstrzyknąć dootrzewnowo przedawkowanie 100 miligramów na kilogram fenobarbitalu w celu eutanazji zwierzęcia i odczekać kilka minut, aż euthasol zacznie działać. Wykonaj perfuzję przezsercową na uśpionej fretce najpierw zwykłym roztworem soli fizjologicznej przez jedną minutę, a następnie 4% paraformaldehydem przez 20 minut. Następnie użyj utrwalacza z sacharozą, aby zakończyć całą procedurę utrwalania w ciągu jednej godziny.Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie w linii środkowej, zaczynając od nosa do szyi, aby odsłonić czaszkę. Delikatnie usuń mózg, a następnie użyj ostrza skalpela, aby oddzielić półkule. Następnie wytnij i oddziel tylną część od reszty mózgu i post-fix przez dwie do czterech godzin.Pozwól mózgowi zatonąć, utrzymując tkankę w 30% roztworze sacharozy w 0,1-molowym buforze fosforanowym. Po tym, jak mózg opadnie, użyj zamrażającego przesuwanego mikrotomu, aby wykonać półstyczne odcinki o grubości 40 mikrometrów przez korę wzrokową. Użyj pędzla, aby zebrać wszystkie sekcje mózgu i umieść je w pudełku wypełnionym solą fizjologiczną buforowaną fosforanami.Następnie szybko zamontuj jedną lub dwie serie sekcji mózgu na szkiełkach pokrytych białkiem jaja. Przechowuj szkiełka w temperaturze pokojowej przez noc do wyschnięcia. Po wyschnięciu szkiełek zanurz je w bezalkoholowym alkoholu na 15 minut.Następnie odczekaj godzinę, aby szkiełka całkowicie wyschły w temperaturze pokojowej. Szybko zanurz sekcje w 1% roztworze żelatyny na 10 sekund, a następnie ostrożnie odcedź. Trzymaj sekcje w temperaturze pokojowej do wyschnięcia przez noc.Użyj plastikowej tacy, aby ułożyć szkiełka obok siebie. Następnie zalej roztwór do wywoływania i upewnij się, że szkiełka są w nim całkowicie zanurzone. Pamiętaj, aby co 30 minut sprawdzać skrawki pod kątem rozwoju reakcji.Jeśli szkiełka zostały odpowiednio zabarwione, wyjmij sekcje zamontowane na prowadnicach z tacy i trzymaj szkiełka na stojaku na slajdy. Użyj dużego naczynia do barwienia szkła, aby umyć szkiełka wewnątrz stojaka na szkiełka pod ciepłą bieżącą wodą przez 10 minut, aby umyć powłokę żelatynową i zewnętrzny osad srebra. Po wysuszeniu szkiełek w temperaturze pokojowej odwadniaj je przez pięć minut w 100% etanolu i klaruj przez pięć minut w ksylenie.Na koniec umieść na szkiełku szkiełko nakrywkowe z nośnikiem montażowym. Użyj mikroskopu jasnego pola, aby zbadać przekroje i zrobić zdjęcia obszarów zainteresowania. Wybierz sekcje barwione ze zdjęć mikrofotografii interesujących regionów, aby losowo wybrać kolumny korowe o szerokości około 450 mikrometrów.W każdym obszarze zainteresowania wybierz odpowiednią liczbę kolumn próbki z kilku różnych sekcji mózgu. Następnie przenieś obrazy kolumn do oprogramowania do przetwarzania obrazu. W oprogramowaniu użyj narzędzia do przekroju prostokątnego, aby objąć całą kolumnę korową.Następnie użyj narzędzia do odwracania, aby odwrócić kontrast obrazu. Następnie użyj narzędzia do kreślenia profilu, aby utworzyć dwuwymiarowy wykres intensywności pikseli wzdłuż linii, aby utworzyć profile gęstości optycznej na podstawie obrazów. Na koniec użyj opcji profilu działki, aby przekonwertować wykres profilu wydruku na profil pionowy.Następnie kliknij jeszcze raz na profil działki. Mikrofotografie półstycznych wycinków mózgu młodocianych fretek barwionych pokazują charakterystykę nadmiernie i niedostatecznie podbarwionych tkanek. Nadmiernie wybarwiona tkanka ma bardzo ciemnobrązowy kolor z niewystarczającą zmiennością laminarną i gęsto zabarwioną białą istotą.Natomiast niedobarwione tkanki rozwijają jasnobrązowy kolor z minimalnie zabarwioną białą masą . Mikrofotografie przekrojów półstycznych pokazują synaptyczny w barwieniu oksydazą cytochromową w obszarach kory wzrokowej dorosłej fretki. Intensywność barwienia synaptycznym jest wysoka w warstwach nadziarnistych i podziarnistych w obszarach 17 i 18, podczas gdy warstwa czwarta lekko się barwi.I odwrotnie, warstwa czwarta, o powierzchni 17 i 18, jest silnie wybarwiona po barwieniu pod kątem reaktywności oksydazy cytochromowej. Kolumnowe mikrofotografie pokazują laminarny rozkład synaptycznego we wszystkich warstwach korowych z ich komplementarnymi znormalizowanymi wartościami gęstości optycznej. Aby odzwierciedlić zmiany w synaptycznym barwieniu w zależności od głębokości kory mózgowej, w każdym obszarze kory wzrokowej wygenerowano znormalizowane wykresy wartości gęstości optycznej.Koryto obecne w profilach wykresów wykazuje niskie zabarwienie synaptycznego w warstwie czwartej obszarów 17 i 18. Ta procedura może pomóc wyjaśnić, czy z czasem zachodzą jakiekolwiek zmiany rozwojowe i intensywność barwienia w poszczególnych obszarach mózgu. Technika ta okazała się przydatna dla badaczy neuroanatomii w celu zbadania, w jaki sposób manipulacje sensoryczne, środowiskowe, farmakologiczne lub genetyczne mogą wpływać na rozkład synaptycznego barwienia w dorosłym i niedojrzałym mózgu u wielu gatunków.Dzięki za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.

use-synaptic-zinc-histochemistry-to-reveal-different-regions-laminae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

Źródło: McLeod, F., et al. Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia metodę wizualizacji markerów synaptycznych w wycinkach mózgu hipokampa za pomocą konfokalnej analizy immunofluorescencyjnej. Plastry są barwione immunologicznie przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko markerom presynaptycznym i postsynaptycznym, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem. Oznaczone markery są następnie...

Analiza mikroskopowa synaps w mysich wycinkach hipokampa przy użyciu immunofluorescencji

Opracowaliśmy nienaruszony preparat mózgowo-rdzeniowy do rejestrowania i monitorowania aktywności elektrycznej za pomocą zapisu za pomocą zacisku punktowego z neuronów Mauthnera i innych komórek siateczkowo-rdzeniowych w zarodkach danio pręgowanego. W ten sposób jesteśmy w stanie rejestrować pobudzające i hamujące prądy synaptyczne, aktywność kanałów bramkowanych napięciem oraz potencjały czynnościowe z kluczowych neuronów w rozwijającym się zarodku.

Nagrania patch clamp z embrionalnych komórek Mauthnera danio pręgowanego

Tutaj opisujemy technikę badania neurogenezy poporodowej hipokampa za pomocą techniki organotypowej hodowli plastrów. Metoda ta pozwala na manipulację neurogenezą dorosłych w warunkach in vitro i pozwala na bezpośrednie zastosowanie środków farmakologicznych do hodowanego hipokampa.

Organotypowe kultury warstwowe do badań neurogenezy poporodowej

Ten protokół przedstawia metodę morfologicznego odzyskiwania neuronów załatanych podczas zapisów elektrofizjologicznych za pomocą wypełnienia biocytyną i późniejszego immunohistochemicznego przetwarzania końcowego. Pokazujemy, że grube skrawki wypełnione biocytyną, które zostały wybarwione i przykryte, mogą być ponownie wybarwione drugim pierwotnym przeciwciałem kilka dni lub miesięcy później.

Barwienie immunologiczne skrawków wypełnionych i przetworzonych biocytyną pod kątem markerów neurochemicznych

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Opisany tutaj protokół opisuje analizę immunofluorescencyjną, odzyskiwanie biocytyny i wysokiej jakości rekonstrukcje interneuronów CA2 w hipokampie po wewnątrzkomórkowych zapisach elektrofizjologicznych in vitro, co pozwala na badanie charakterystyki neuronów i ostatecznie anatomii neuronalnej.

Odzyskiwanie biocytyny i rekonstrukcje 3D wypełnionych interneuronów CA2 w hipokampie

Połączenie transmisyjnej mikroskopii elektronowej i transdukcji in utero jest potężnym podejściem do badania zmian morfologicznych w ultrastrukturze układu nerwowego podczas rozwoju. Ta połączona metoda pozwala na dogłębny wgląd w zmiany w szczegółach strukturalnych leżących u podstaw neuroplastyczności w odniesieniu do ich reprezentacji topograficznej.

Ocena ultrastrukturalnych parametrów neuroplastyczności po transdukcji in utero rozwijającego się mózgu myszy i rdzenia kręgowego

Opisujemy procedury przetwarzania tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości mikrofotografii elektronowej do analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych. Mikrofotografie uzyskane tymi metodami mogą być również wykorzystane do badania morfologii wielu innych składników komórkowych i ich wymiarowych relacji strukturalnych.

Przygotowanie tkanki mózgowej nowonarodzonego szczura do ultrastrukturalnej analizy morfometrycznej rozmieszczenia pęcherzyków synaptycznych na zakończeniach nerwowych

Sekcja kriogeniczna pozwala na świeże, zamrożone przygotowanie największej niszy neurogennej w mysim mózgu do głębokiej ilościowej analizy proteomu. Metoda jest precyzyjna, skuteczna i powoduje minimalne zaburzenia tkanek. Dlatego idealnie nadaje się do badania mikrośrodowiska molekularnego tej niszy, a także innych narządów, regionów i gatunków.

Kriosekcja strefy podwyściółkowej dorosłego osobnika w celu dokładnej i głębokiej ilościowej analizy proteomu

Prezentowany protokół opisuje zastosowanie transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) do ilościowego określania zmian okołodobowych w korze myszy, koncentrując się głównie na liczbie synaps i morfologii kolców dendrytycznych.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa jako technika wizualizacji do analizy okołodobowej plastyczności synaptycznej w korze mięśniowej myszy

Odkryj metodę histochemiczną barwienia cynkiem w mózgu fretki, która pozwala wizualizować wzorce warstwowe i regionalne w rozwijającym się i dorosłym mózgu. Technika ta umożliwia niezawodne identyfikowanie różnych obszarów mózgu.

Zastosowanie synaptycznej histochemii w celu ujawnienia różnych regionów i blaszek w rozwijającym się i dorosłym mózgu

Przeglądaj więcej filmów