In vitro Pomiar enzymów w celu zbadania farmakologicznej reakcji białka opiekuńczego w chorobie Fabry'ego i Pompego

Istnieje zapotrzebowanie, aby testy przedkliniczne nowej klasy leków "sierocych" zwanych farmakologicznymi białkami opiekuńczymi były powtarzalne, szybkie i skuteczne. Opracowaliśmy prosty, wysoce ustandaryzowany i wszechstronny test oparty na hodowli komórkowych do badań przesiewowych dla kwalifikujących się pacjentów, a także nowatorskie farmakologiczne leki opiekuńcze.

Ogólnym celem tego zmienionego protokołu hodowli komórkowej jest zapewnienie szybkiej oceny fenotypowej wariancji alleli w chorobie Fabry'ego i Pompego. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie lizosomalnych chorób spichrzeniowych, takie jak wyniki prognostyczne i decyzje terapeutyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest wysoce powtarzalna i może pomóc w opracowywaniu nowych leków, takich jak farmako-białka opiekuńcze.

Aby przeprowadzić mutagenezę ukierunkowaną, należy rozpocząć od użycia sekwencji referencyjnych NM 00169.2 i NM 00152.4 jako matryc do mutagenezy genów GLA i GAA, odpowiednio. Skorzystaj z bezpłatnego narzędzia do projektowania podkładu, aby wesprzeć projektowanie podkładu. Następnie należy zsyntetyzować zestaw starterów o wysokiej czystości, wolnych od soli, z starterami sense i antysensownymi przenoszącymi jedną z odpowiednich modyfikacji sekwencji, kluczowych dla ich długości, aby indywidualnie wprowadzić mutację.

Przygotować mieszaninę reakcyjną w objętości 50 mikrolitrów i uruchomić program PCR w standardowych warunkach dostarczonych przez producenta i wymienionych w protokole tekstowym. Po PCR dodaj jeden mikrolitr enzymu restrykcyjnego Dpn1 i kontynuuj inkubację fiolek reakcyjnych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po przekształceniu DNA osocza w kompetentne komórki E. coli i przygotowaniu plazmidów o pożądanej transformacji zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć odpowiedniego narzędzia biologii molekularnej do analizy sekwencji.

Gdy zostanie wykryta pożądana mutacja i nie zostanie zaobserwowana dalsza nieprawidłowość sekwencji w porównaniu z NM 000169.2 dla alfa-galaktozydazy A lub NM 000152.4 dla kwaśnej alfa-galaktozydazy, wybierz klon do oczyszczenia plazmidu o stopniu transfekcji. Określić czystość DNA, mierząc absorbancję w spektrofotometrze. Po wyhodowaniu komórek HEK293H w kolbie hodowlanej T75 zgodnie z protokołem tekstowym, na 24 godziny przed transfekcją należy użyć PBS bez wapnia i magnezu do jednokrotnego przemycia komórek.

Z 0,05% trypsyną-EDTA, zbierz komórki iw jamach 24-dołkowej płytki hodowlanej użyj 500 mikrolitrów DMEM uzupełnionego 10% FBS, aby wysadzić 1,5 razy 10 do pięciu komórek. Przeprowadź transfekcję komórek zgodnie z instrukcją producenta. Używając mieszaniny jednego mikrograma plazmidowego DNA rozpuszczonego w 100 mikrolitrach DMEM bez surowicy i 2,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji.

Inkubuj roztwór przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj go do komórek kroplami. Po okresie czterech godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 usuń pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji i dodaj 500 mikrolitrów świeżego DMEM z 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną. Opcjonalnie na tym etapie dodaj DGJ lub DNJ do pożywki hodowlanej zgodnie z przeznaczeniem.

W dniu zbiorów wyjmij komórki z inkubatora. Następnie odessać pożywkę i użyć PBS z wapniem i magnezem, aby dokładnie umyć komórki dwa razy. Ten krok ma kluczowe znaczenie, ponieważ DGJ i DNJ są inhibitorami obu enzymów, a zatem wszelkie pozostałości unieważniłyby test.

Po umyciu dodaj 200 mikrolitrów wody dejonizowanej bezpośrednio na komórki. Następnie opłucz komórki z płytki i przenieś je do 1,5 mililitrowej probówki reakcyjnej. Umieść próbki w odpowiednim stojaku piankowym i wiruj je przez pięć sekund, aby liza była bardziej wydajna.

Następnie naprzemiennie próbki należy stosować między ciekłym azotem przez 10 sekund a łaźnią wodną o temperaturze pokojowej, aż do zakończenia rozmrażania. Po pięciokrotnym powtórzeniu procedury homogenizacji należy wirować próbki przez pięć minut w temperaturze 10 000 g. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki reakcyjnej.

Aby przeprowadzić test BCA, należy przygotować świeżą probówkę dla każdej próbki zawierającą 40 mikrolitrów dejonizowanego H20 i dodać 10 mikrolitrów próbki. Wymieszaj każdy roztwór, krótko wirując i przenieś 10 mikrolitrów każdej próbki w trzech egzemplarzach do wnęk 96-dołkowej płytki. Aby przygotować krzywą wzorcową, rozcieńczyć 2 miligramy na mililitr roztworu podstawowego BSA i zdejonizować H2O zgodnie z protokołem tekstowym.

Po połączeniu odczynnika A i odczynnika B należy rozpocząć reakcję od dodania 200 mikrolitrów roztworu odczynnika BCA i inkubować próbki w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez godzinę. Następnie zmierz absorbancję przy 560 nanometrach w czytniku płytek. Próbki zazwyczaj zawierają od jednego do 1,5 mikrograma białka na mikrolitr.

Rozcieńczyć obliczoną ilość każdej próbki i pipetować ją do świeżych 1,5 mililitrowych probówek reakcyjnych, aby otrzymać 0,05 mikrograma alfa-galaktozydazy A lub 0,5 mikrograma kwasowej alfa-glukozydazy na mikrolitr roztworu. Ponownie wirować próbki przez pięć sekund i ponownie odpipetować 10 mikrolitrów tego rozcieńczenia na 96-dołkową płytkę. Rozpocznij reakcje, dodając 20 mikrolitrów odpowiedniego roztworu substratu.

W przypadku alfa-galaktozydazy A dodać dwa milimolowe 4-metylolumbelliferylowe alfa-D galaktopyranozydy lub 4-MU-gal w 0,06 molowym buforze fosforanowo-cytrynianowym, pH 4,7. W przypadku kwaśnej alfa-glukozydazy dodać 2 milimolowe glukopiranozyd alfa-D 4-metylulumbelliferylu lub 4-MU-glu w 0,025 molowym octanie sodu, pH 4,0. Inkubuj reakcje enzymatyczne przez godzinę w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 300 obr./min na wytrząsarce orbitalnej.

Następnie zakończ reakcję, dodając 200 mikrolitrów buforu wodorotlenku sodu glicyny o pH 1,0 molowym i 10,5. Przygotować wzorcową krzywą 4-MU z 0,01 miligrama na mililitr zgodnie z protokołem tekstowym i odpipetować 10 mikrolitrów roztworów w dwóch egzemplarzach na płytkę 96-dołkową. Dodać 200 mikrolitrów 1,0-molowego buforu wodorotlenku sodu glicyny do każdej studzienki w celu dostosowania objętości i pH.

Na koniec należy zmierzyć aktywność enzymu w czytniku fluorescencyjnym wyposażonym w odpowiedni zestaw filtrów. I przeanalizuj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania dla czytnika fluorescencji. Aby ocenić skuteczność mutagenezy genu GLA, mutacje podzielono na trzy kategorie i ujawniono, że około 66,5% uzyskano w pierwszej próbie.

Kolejne 25% można było uzyskać po nieznacznie zmodyfikowanym drugim PCR. W kategorii trzeciej trzeba było podjąć więcej wysiłku, takiego jak przeprojektowanie podkładu, aby uzyskać pożądany klon. Poniższa tabela odnosi się do wyników pomiarów aktywności enzymatycznej dla trzech mutacji alfa-galaktozydazy A i trzech mutacji alfa-glukozydazy kwasowej, które nie były leczone lub były leczone DGJ i DNJ.

Dane są wyświetlane jako wartości bezwzględne obrotu substratu i mają wartości względne znormalizowane do enzymu typu dzikiego. Dane dotyczące bezwzględnej aktywności enzymatycznej skorygowano o endogenną aktywność enzymatyczną komórek HEK293H przy użyciu komórek transfekowanych pustym wektorem pcDNA 3.1. Wartości aktywności enzymu zostały znormalizowane do enzymu typu dzikiego z odpowiednich eksperymentów, co wyjaśnia odchylenie wartości względnych między różnymi mutantami.

Po opanowaniu, frakcja po hodowli komórkowej tego eksperymentu, która stanowi większość czasu praktycznego, może być wykonana w ciągu czterech godzin. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się lizosomalnymi chorobami spichrzeniowymi do zbadania korelacji genotyp-fenotyp w chorobie Fabry'ego i Pompego. Protokół ten może pomóc w opracowaniu nowych leków w lizosomalnych chorobach spichrzeniowych.