Jednoczesne mapowanie i oznaczanie ilościowe rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA

Ogólnym celem tego eksperymentu jest mapowanie lokalizacji włączonych rybonukleotydów na poziomie rozdzielczości pojedynczego nukleotydu oraz ilościowe określenie liczby rybonukleotydów obecnych w ludzkim mitochondrialnym DNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące integralności DNA, mechanizmów replikacji DNA, mechanizmów naprawy DNA oraz tego, w jaki sposób defekty w którymkolwiek z tych mechanizmów powodują chorobę. Główną zaletą tej metody jest to, że w jednym eksperymencie można określić zarówno lokalizację, jak i liczbę wbudowanych rybonukleotydów w mitochondrialnym DNA.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zawartość rybonukleotydów w ludzkim mitochondrialnym DNA, może być również stosowana do badania jądrowego DNA i zawartości rybonukleotydów w sekwencyjnych genomach innych organizmów modelowych. W tym eksperymencie wykorzystano genomowe DNA wcześniej wyizolowane z komórek HeLa i opisane w sekcjach drugiej i trzeciej protokołu tekstowego. Aby strawić DNA, ostrożnie wymieszaj następujące składniki w probówce do mikrofuge.

Jeden mikrogram DNA, pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu 3,1, jeden mikrolitr HincII i woda wolna od nukleaz do końcowej objętości 50 mikrolitrów. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po zakończeniu trawienia dodać 1,8 objętości kulek paramagnetycznych do każdej próbki, ostrożnie wymieszać przez pipetowanie i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Umieść probówki na stojaku magnetycznym na pięć minut, aby ogranulować kulki, a następnie wyjmij i wyrzuć supernatant. Przemyć osad 150 mikrolitrami 70% etanolu przez około 30 sekund, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant. Powtórz pranie z 200 mikrolitrami 70% etanolu przez kolejne 30 sekund.

Suszyć próbki w temperaturze pokojowej przez około 15 do 20 minut. Następnie wyjmij rurki ze stojaka magnetycznego. Eluować każdą osadkę w 45 mikrolitrach buforu elucyjnego, wymieszać ostrożnie pipetując i inkubować przez pięć minut.

Umieść kulki na stojaku magnetycznym i przenieś 45 mikrolitrów każdej próbki DNA do nowej probówki. Do każdych 45 mikrolitrów wyizolowanego lub oczyszczonego DNA dodaj pięć mikrolitrów trzech molowych wodorotlenków potasu lub pięć mikrolitrów trzech molowych chlorków potasu, tworząc całkowitą objętość 50 mikrolitrów. Osiem reakcji podsumowano w poniższej tabeli.

Inkubować w piecu do hybrydyzacji w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dwie godziny, a następnie inkubować próbki na lodzie przez pięć minut. Wytrącić DNA, dodając 10 mikrolitrów trzymolowego octanu sodu o pH 5,2 i 125 mikrolitrów zimnego, 100% etanolu i inkubować na lodzie przez pięć minut. Osadzaj DNA przez odwirowanie w temperaturze 21 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Odrzucić supernatant i umyć każdą osadkę DNA 250 mikrolitrami zimnego, 70% etanolu, ponownie odwirować i odrzucić supernatant. Pozostaw granulkę do wyschnięcia w otwartej probówce przez około pięć do 10 minut, aż jakikolwiek widoczny płyn wyparuje. Na koniec dodaj 20 mikrolitrów buforu elucyjnego i pozwól osadkowi DNA rozpuścić się w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania mieszaniny reakcyjnej dla każdej próbki jako mieszanki wzorcowej. Do każdej próbki dodaj 2,5 mikrolitra 10x buforu reakcyjnego kinazy polinukleotydowej T4, 2,5 mikrolitra ATP i jeden mikrolitr trzech głównych kinaz polinukleotydowych fosfatazy minus T4. Przenieś 19 mikrolitrów każdej próbki DNA do nowej probówki o pojemności 200 mikrolitrów i denaturuj w temperaturze 85 stopni Celsjusza w termocyklerze przez trzy minuty.

Następnie schłodzić próbki DNA na lodzie i dodać sześć mikrolitrów przygotowanej mieszaniny reakcyjnej do każdej próbki. Inkubować mieszaniny reakcyjne w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, a następnie w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut, aby zatrzymać reakcję. Oczyść DNA za pomocą kulek paramagnetycznych, jak pokazano wcześniej, ale eluuj za pomocą 14 mikrolitrów buforu elucyjnego.

Przygotować wcześniej mieszaninę reakcyjną jako mieszankę wzorcową, zawierającą następujące składniki dla każdej próbki. Pięć mikrolitrów 10x bufora reakcyjnego ligazy RNA T4, pięć mikrolitrów chlorku heksamaminokobaltu(III), 0,5 mikrolitra oligonukleotydu ARC140, 0,5 mikrolitra ATP i 25 mikrolitrów 50% PEG 8000. Dobrze wymieszać przez pipetowanie.

Przenieś 13 mikrolitrów każdego oczyszczonego DNA do nowej probówki o pojemności 200 mikrolitrów i denaturuj w temperaturze 85 stopni Celsjusza w termocyklerze przez trzy minuty. Schłodzić DNA na lodzie, a następnie dodać 36 mikrolitrów mieszanki reakcyjnej do każdej próbki, wymieszać pipetując i krótko odwirować. Dodaj jeden mikrolitr ligazy RNA T4 do każdej reakcji, wymieszaj pipetując i krótko odwiruj.

Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez noc. Po zakończeniu ligacji pojedynczej nici DNA oczyść DNA, jak pokazano wcześniej, ale użyj 0,8 objętości kulek paramagnetycznych i osadzaj kulki przez 10 minut. Eluować w 20 mikrolitrach buforu elucyjnego i przenieść 20 mikrolitrów każdej próbki DNA do nowej probówki o pojemności 200 mikrolitrów.

Powtórzyć oczyszczanie z 0,8 objętości kulek paramagnetycznych i wymyć w 14 mikrolitrach buforu elucyjnego. Dla każdej próbki należy przygotować mieszaninę reakcyjną jako mieszankę wzorcową składającą się z dwóch mikrolitrów 10x buforu reakcyjnego polimerazy DNA T7, dwóch mikrolitrów ARC76/77, dwóch mikrolitrów dNTP i 0,8 mikrolitrów BSA. Przenieś 12,8 mikrolitrów oczyszczonego DNA do nowej probówki o pojemności 200 mikrolitrów i denaturuj w temperaturze 85 stopni Celsjusza w termocyklerze przez trzy minuty.

Schłodzić DNA na lodzie, a następnie dodać 6,8 mikrolitra mieszanki reakcyjnej do każdej próbki, wymieszać pipetując, krótko odwirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Dodaj 0,4 mikrolitra polimerazy DNA T7 do każdej reakcji i inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po oczyszczeniu DNA za pomocą kulek paramagnetycznych wymyć w 11 mikrolitrach buforu elucyjnego.

Aby rozpocząć amplifikację PCR, przygotuj mieszaninę reakcyjną osobno dla każdej próbki w nowej probówce o pojemności 200 mikrolitrów składającej się z 7,5 mikrolitra ARC49, 7,5 mikrolitra unikalnego startera indeksowego i 25 mikrolitrów 2X gotowej mieszanki gorącego startu. Dodaj 10 mikrolitrów próbki DNA do każdej reakcji. Wzmocnij bibliotekę, korzystając z następujących warunków.

Denaturacja w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 45 sekund, a następnie 18 cykli w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez 15 sekund, 65 stopni Celsjusza przez 30 sekund, 72 stopnie Celsjusza przez 30 sekund, a kończąc na końcowym wydłużeniu w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Utrzymać próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza po amplifikacji. Oczyść biblioteki zgodnie z opisem w protokole tekstowym i wymyj w 20 mikrolitrach buforu TE.

Określ jakość i średni rozmiar fragmentu każdej biblioteki za pomocą systemu elektroforezy cyfrowej. Przedstawiono reprezentatywne wyniki odpowiednich profili bibliotecznych po zastosowaniu wodorotlenku potasu lub chlorku potasu. Po obliczeniu stężenia każdej biblioteki, należy pobrać równe ilości molowe do 24 bibliotek amplifikowanych różnymi starterami indeksowymi do sekwencjonowania, jak opisano w sekcjach dziewiątej i 10 protokołu tekstowego.

Dodać bufor TE do końcowej objętości 25 mikrolitrów i stężeniu 10 nanomolowych. Po sekwencjonowaniu należy przeprowadzić analizę danych bioinformatycznych zgodnie z sekcją 11 protokołu tekstowego. Wykresy te pokazują podsumowane odczyty we wszystkich miejscach HincII w lekkim i ciężkim mitochondrialnym DNA człowieka po leczeniu chlorkiem potasu.

Około 70% wszystkich wykrytych pięciu głównych końców zlokalizowanych jest w miejscach cięcia, co świadczy o wysokiej skuteczności trawienia HincII. Traktowanie bibliotek wodorotlenkiem potasu w celu hydrolizy DNA w osadzonych rybonukleotydach zmniejsza liczbę odczytów w HincII do około 40%Względna liczba odczytów w mitochondrialnym i jądrowym DNA ujawnia różnice w pokryciu i ilustruje znaczenie odpowiedniej normalizacji w celu usunięcia odchylenia nici. Normalizacja liczby odczytów do HincII daje ilościową miarę liczby rybonukleotydów w genomie mitochondrialnym na ciężkiej lub lekkiej nici.

Odczyty po traktowaniu wodorotlenkiem potasu dla każdego rybonukleotydu, znormalizowane do składu sekwencji każdej nici, wykazują stosunek inny niż jeden, co wskazuje na nielosowy rozkład odczytów i sugeruje wyraźny wzór rybonukleotydowy i wysoką jakość biblioteki. Normalizacja odczytów w miejscach osadzonych rybonukleotydów do tych w miejscach HincII, a także do zawartości nukleotydów genomu, generuje ilościową miarę liczby każdego rybonukleotydu włączonego na 1 000 uzupełniających zasad. Po opanowaniu tego protokołu można go wykonać w ciągu dwóch dni, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.

Próbując tej procedury, należy pamiętać o utrzymywaniu DNA w wysokim stopniu i unikaniu wprowadzania jakichkolwiek pęknięć podwójnej nici podczas przygotowywania biblioteki. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak w celu potwierdzenia danych ilościowych rybonukleotydów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować biblioteki do mapowania i kwantyfikacji rybonukleotydów i DNA przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.

Nie zapominaj, że praca z chemikaliami, takimi jak wodorotlenek potasu, może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie okularów ochronnych i rękawiczek.