Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych
28 marca 2018
Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.
Ogólnym celem tej metody jest zbadanie dynamicznych zmian morfologicznych rozgałęziania aksonów i tworzenia synaps w projekcji wzgórzowo-korowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii, takie jak tworzenie nowych obwodów neuronowych. Główną zaletą tej techniki jest jednoczesna obserwacja wzrostu aksonów i powstawania synaps w poszczególnych żywych komórkach.
Metoda ta może dostarczyć informacji na temat związku między rozgałęzianiem się aksonów a tworzeniem synaps w projekcjach wzgórzowo-korowych. Może być również stosowany do innych obwodów neuronalnych, takich jak wewnętrzne połączenie w korze mózgowej. Aby rozpocząć tę procedurę, sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 10 minut lub dłużej.
Następnie szybko przeprowadź sekcję całego mózgu szczura po urodzeniu w drugim dniu pod lodowatą narkozą. Następnie umieść mózg na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 40 mililitrów zimnego roztworu soli Hanka. Pod mikroskopem dwuokularowym ostrożnie usuń materię pia za pomocą cienkich kleszczy i pokrój pierwotną korę wzrokową i somatosensoryczną na plastry o grubości od 300 do 400 mikronów za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych.
Następnie przenieś plastry korowe na filtr membranowy wkładki hodowlanej za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Wyreguluj położenie plastrów w pobliżu środka wkładki hodowlanej za pomocą jednorazowej plastikowej pipety i usuń nadmiar pożywki z wkładki. Utrzymuj plastry w pożywce hodowlanej zawierającej surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i hoduj je samodzielnie przez jeden dzień przed umieszczeniem obok niego bloku wzgórzowego z zarodka E15.
Wyreguluj poziom pożywki nieco poniżej powierzchni plastru, tak aby plastry mogły otrzymać wystarczający dopływ zarówno gazu, jak i pożywki. Ma to kluczowe znaczenie dla żywotności plastrów. Na tym etapie wykonaj szklane kapilary za pomocą ściągacza elektrod.
Następnie rozbij końcówki szklanych naczyń włosowatych w celu wstrzyknięcia plazmidu. W przypadku pipet elektrodowych zmielić i wypolerować końcówki szklanych kapilar papierem ściernym. A następnie wypoleruj je na gorąco, aby uzyskać średnicę wewnętrzną od 50 do 200 mikronów.
Następnie przymocuj pipetę elektrodową i pipetę wyrzutową do manipulatorów. Przenieś pięć mikrolitrów roztworu plazmidu na szalkę Petriego. Następnie wciągnąć roztwór do pipety elektrody o działaniu kapilarnym.
Włóż elektrodę o średnicy 0,2 milimetra do pipety elektrody. Po podłączeniu pipety wyrzutowej do jednomililitrowej strzykawki z plastikową rurką, ponownie przenieś pięć mikrolitrów roztworu plazmidu na szalkę Petriego. Następnie powoli wciągnąć roztwór do pipety wyrzutowej za pomocą strzykawki.
Następnie przenieś kokulturę na etap elektroporacji i włóż elektrodę o średnicy jednego milimetra do pożywki hodowlanej. Następnie umieść pipetę wyrzutową na hodowanym bloku wzgórza. Wcisnąć strzykawkę ręcznie po tym, jak końcówka dotknie powierzchni bloku wzgórza.
Umieścić pipetę elektrodową na bloku wzgórza natychmiast po wycofaniu pipety wyrzutowej. Teraz dostarcz impulsy elektryczne. Monitoruj amplitudę i liczbę pociągów na oscyloskopie.
Następnie wycofaj pipetę elektrody i włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Aby obserwować próbkę, należy umieścić naczynie hodowlane na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w dwa zestawy filtrów dla EGFP i DsRed. Następnie wykonaj zdjęcia od 10 do 25 sekcji optycznych, w krokach co jeden do siedmiu mikronów, za pomocą soczewki obiektywowej o dużej odległości roboczej 20x.
Wybierz indywidualnie rozróżnialne znakowane aksony, które wyrażają zarówno DsRed, jak i Syp-EGFP. Pokazana tutaj jest organotypowa kokultura plastrów wzgórza i kory mózgowej po 12 DIV. Oto powiększony obraz obszaru pudełkowego.
A oto komórka wzgórza znakowana DsRed, która rozciąga akson do warstwy korowej i tworzy gałęzie w górnych warstwach. Obrazy te pokazują akson wzgórzowo-korowy oznaczony DsRed i punkt Syp-EGFP. Dyskretną akumulację Syp-EGFP obserwowano wzdłuż pojedynczego aksonu wzgórzowo-korowego.
Plazmidy DsRed plus Syp-EGFP wprowadzono do hodowanych komórek wzgórza w jednym DIV za pomocą elektroporacji. Akson ten był fotografowany codziennie przez cztery dni. Rozgałęzianie aksonów i tworzenie synaps było dynamiczne, z dodawaniem i eliminacją.
Po tych procedurach można przeprowadzić elektroporację interesujących genów wraz z Syp-EGFP i DsRed w celu zbadania roli genu w rozgałęzianiu aksonów i tworzeniu synaps. Technika ta toruje drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do badania mechanizmów dynamicznych zmian obwodów neuronalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych oraz formowania się synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Koncentruje się ono na dynamicznych zmianach morfologicznych w projekcji wzgórzowo-korowej, dostarczając informacji na temat tworzenia nowych obwodów neuronalnych oraz zależności między wzrostem aksonów a rozwojem synaps.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- neurobiologia
- biologia komórki
Wstęp
- Projekcje wzgórzowo-korowe odgrywają kluczową rolę w przetwarzaniu sensorycznym.
- Zrozumienie rozgałęziania aksonów i tworzenia synaps jest niezbędne do uzyskania wiedzy na temat formowania się obwodów neuronalnych.
- Obecne metody mają ograniczenia w jednoczesnej obserwacji tych zmian na poziomie komórkowym.
- Badanie to rozwija techniki obrazowania w kontekście żywych komórek.
Cel badania
- Badanie dynamicznych zmian morfologicznych podczas rozgałęziania aksonów i tworzenia synaps.
- Przedstawienie metody umożliwiającej obserwację pojedynczych żywych komórek w kokulturze.
- Ocena zależności między wzrostem aksonów a rozwojem synaptycznym w neuronach wzgórzowo-korowych.
Zastosowane metody
- Wykorzystano organotypowe kokultury skrawków wzgórza i kory mózgowej.
- Do stworzenia modelu biologicznego użyto tkanki szczura w drugim dniu po urodzeniu.
- Przeprowadzono elektroporację w celu wprowadzenia markerów fluorescencyjnych do obrazowania.
- Kultury utrzymywano w temperaturze 37 °C i obserwowano w określonych punktach czasowych rozwoju.
- Obrazowanie wykonano przy użyciu mikroskopu konfokalnego w celu zarejestrowania dynamiki aksonalnej.
Główne wyniki
- Zaobserwowano dynamiczne zmiany w rozgałęzianiu aksonów i tworzeniu synaps, co podkreśla plastyczność projekcji wzgórzowo-korowych.
- Odnotowano dyskretną akumulację markerów synaptycznych wzdłuż aksonów, co wskazuje na trwający rozwój synaptyczny.
- Technika ta umożliwiła obserwację zmian morfologicznych w pojedynczych komórkach w czasie rzeczywistym.
- Wyniki podkreślają potencjał do badania roli genów w dynamice aksonów i synaps.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje nowatorską metodę badania dynamiki i plastyczności obwodów neuronalnych.
- Dostarcza ono wiedzy na temat sprzężenia wzrostu aksonów z formowaniem się synaps.
- Wyniki mają znaczenie dla zrozumienia mechanizmów łączności neuronalnej oraz plastyczności w stanie zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia jednoczesną wizualizację rozgałęziania aksonów i tworzenia się synaps w żywych obwodach neuronalnych, wypełniając kluczową lukę mechanistyczną w walidacji celów neurorozwojowych. Dzięki dostarczaniu dynamicznych danych o plastyczności strukturalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki, zwiększa ona pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków, w których krytyczne jest ograniczenie ryzyka mechanistycznego w odniesieniu do celów synaptycznych. Podejście to zapewnia ciągłość translacyjną od wglądu w mechanizmy po przedkliniczną ocenę fenotypów na poziomie obwodów w modelach chorób neuropsychiatrycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych łączących morfologię aksonów z łącznością synaptyczną w drogach wzgórzowo-korowych.
- Wartość operacyjna: Zachowuje architekturę warstwową i żywotność neuronów, co pozwala na podłużną obserwację dynamicznych zmian strukturalnych.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wyjaśnianie związków przyczynowo-skutkowych między wzrostem strukturalnym a funkcjonalną synaptogenezą.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych, multipleksowych odczytów rozgałęzień aksonalnych oraz akumulacji markerów presynaptycznych w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszego screeningu związków w szlakach neurorozwojowych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia skalowalne i powtarzalne procesy obrazowania, kompatybilne z multipleksowymi odczytami fluorescencyjnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Jest zgodne z systemami istotnymi dla chorób, w których dyskonektywność wzgórzowo-korowa przyczynia się do fenotypów sensorycznych i poznawczych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od fazy odkrywania w badaniach przesiewowych mechanizmów do przedklinicznej walidacji przywrócenia funkcji na poziomie obwodów.
- Wartość naukowa: Wspiera decyzje o postępach skorygowane o ryzyko poprzez powiązanie dynamiki strukturalnej z funkcjonalnymi efektami synaptycznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania, umożliwiając bezpośrednią obserwację plastyczności strukturalnej poprzedzającej odczyty z testów funkcjonalnych w modelach obwodów neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących genów regulujących dynamikę rozgałęzień aksonów i tworzenie miejsc synaptycznych w żywych obwodach.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych danych morfologicznych oraz danych dotyczących fluorescencyjnych punktów do profilowania efektów związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie częstotliwości rozgałęzień i gęstości synaps w różnych warunkach eksperymentalnych w czasie.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z modelami przedklinicznymi zaburzeń neurorozwojowych charakteryzujących się zmianami w szlaku wzgórzowo-korowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę obrazowania do multiparametrycznej oceny neuritogenezy i synaptogenezy w różnych modelach neuronalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności w relacjach struktura-funkcja podczas montażu obwodów neuronalnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dwukanałowe przepływy pracy w obrazowaniu w celu spójnego, podłużnego śledzenia dynamiki aksonalnej i synaptycznej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go, dostarczając dowodów mechanistycznych na zaangażowanie celu w ścieżki plastyczności strukturalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane efekty w zakresie sprzężenia aksonowo-synaptycznego w obwodach istotnych dla człowieka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu utrzymania organotypowych kokultur, elektroporacji oraz mikroskopii konfokalnej.
- Efektywność transfekcji zależy od sterylności instrumentarium chirurgicznego, przygotowania mikropipet oraz jakości plazmidowego DNA.
- Konieczna jest kontrola warunków środowiskowych w temperaturze 37°C oraz stosowanie pożywki z dodatkiem surowicy w celu zachowania żywotności skrawków przez wiele dni.
- Adaptacja do alternatywnych obwodów neuronalnych wymaga walidacji kompatybilności tkankowej i wydajności elektroporacji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność wydajności transfekcji oraz konieczność przeprowadzenia analizy obrazu post-hoc w celu kwantyfikacji rozgałęzień i dynamiki punktów (puncta).
