Name: Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Poznaj metodę obserwacji rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych szczura. Technika umożliwia jednoczesne badanie dynamiki wzrostu aksonów oraz formowania połączeń synaptycznych w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez MEXT KAKENHI na temat innowacyjnych obszarów, mezoskopowych obwodów neurologicznych 23115102 i dynamicznej regulacji funkcji mózgu przez Scrap and Build System 16H06460 do N.Y. Dziękujemy również Gabrielowi Handowi za krytyczną lekturę.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez komitety ds. dobrostanu zwierząt Uniwersytetu w Osace i Japońskiego Towarzystwa Neurologicznego.
1. Organotypowe kokultury wzgórza i kory mózgowej
Uwaga: Szczegółową procedurę można znaleźć w oryginalnych publikacjach7,8,13. Wszystkie zabiegi powinny być wykonywane w sterylnych warunkach. Szczury Sprague-Dawley (SD) są wykorzystywane do hodowli neuronów.
<ol>
	<li>Preparaty odczynników 
	nuta: Objętości poniższych odczynników dotyczą jednego mózgu szczura.
	<ol>
		<li>Przygotuj 10x zmodyfikowany suplement N213: Insulina (50 μg/mL), progesteron (200 nM), hydrokortyzon (200 nM), selenin sodu (300 nM), transferyna (1 mg/ml), putrescyna (1 mM), glukoza (60 mg/mL)</li>
		<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną zawierającą surowicę (10 ml): 85% DMEM/F12, 10% 10x zmodyfikowany suplement N2, 5% płodowa surowica bydlęca (FBS)</li>
		<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną bez surowicy (20 ml): 90% DMEM/F12, 10% 10x modyfikowany suplement N2</li>
		<li>Przygotuj roztwór kolagenu z ogona szczura (0,5 ml). Krótko mówiąc, weź delikatne włókna z ogona szczura w sterylnych warunkach i inkubuj przez noc w roztworze kwasu octowego. Po odwirowaniu zebrać supernatant (kilka mg/ml) i przechowywać w lodówce13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie potraw kulturowych
	<ol>
		<li>Umieścić wkład membranowy na szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Dodaj 40 - 50 μl roztworu kolagenu z ogona szczura do błony i rozprowadź roztwór kolagenu wokół środka.</li>
		<li>Całkowicie wysuszyć membranę na powietrzu w czystej ławce.</li>
		<li>Umieść 1,5 - 2 ml pożywki hodowlanej zawierającej surowicę do naczynia, tak aby membrana była nasączona pożywką.</li>
		<li>Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze (37 °C, nawilżone 95% powietrza i 5% CO2 ) przed posiewem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie plastrów kory mózgowej
	<ol>
		<li>Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 10 minut lub dłużej.</li>
		<li>Szybko wypreparuj cały mózg od dnia poporodowego (P) 2 szczura w lodowatej narkozy (zanurzonego w wiórach lodowych na kilka minut).</li>
		<li>Umieść mózg na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 100 ml zimnego zbilansowanego roztworu soli Hanksa.</li>
		<li>Usuń materię pia z mózgu za pomocą cienkich kleszczy i odetnij plasterki kory mózgowej (o grubości 300 - 400 μm) z kory wzrokowej i somatosensorycznej za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych (szczegóły patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
		nuta: Grubość wycinków korowych jest z grubsza szacowana przez skalę siatek pod mikroskopem lornetkowym. 
		nuta: Alternatywnie, plastry korowe można wykonać za pomocą wibratomu w sterylnych warunkach.</li>
		<li>Przenieś kilka plasterków kory mózgowej na wkładkę membranową za pomocą jednorazowej plastikowej pipety.</li>
		<li>Dostosuj położenie plastrów w pobliżu środka wkładki hodowlanej za pomocą wypolerowanej ogniowo pipety Pasteura (szczegółowe informacje można znaleźć w 8,13) i usuń nadmiar pożywki z wkładki. 
		nuta: Dostosuj poziom pożywki nieco poniżej powierzchni plastrów, tak aby plastry mogły otrzymać wystarczający dopływ zarówno gazu, jak i pożywki. Ma to kluczowe znaczenie dla żywotności komórek.</li>
		<li>Utrzymywać plastry w pożywce hodowlanej zawierającej surowicę w temperaturze 37 °C w środowisku nawilżonym 95% powietrzem i 5% CO2 oraz hodować same warstwy przez jeden dzień przed pobraniem bloku wzgórza i umieszczeniem go obok niego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie bloków wzgórzowych
	<ol>
		<li>Sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 10 minut lub dłużej.</li>
		<li>Znieczulić ciężarną szczurkę (15. dzień zarodka) przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu (50 mg/kg) zawierającego środek znieczulający.</li>
		<li>Wypreparuj każdy zarodek z rogów macicy i umieść zarodki na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 100 ml zimnego roztworu soli Hanksa.</li>
		<li>Pod mikroskopem dwuokularowym usuń mózg z każdego zarodka i przetnij bloki wzgórza, które zawierają głównie kompleks brzuszny i jądro kolankowate boczne (około 0,5 mm x 3)7 za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych (patrz <silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla i utrzymanie współkultur organotypowych
	<ol>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura umieść blok wzgórzowy obok powierzchni komory wycinka korowego, który został umieszczony na filtrze membranowym.</li>
		<li>Utrzymywać kokultury w pożywce zawierającej surowicę w temperaturze 37 °C w środowisku nawilżonego 95% powietrza i 5%CO2.</li>
		<li>Po dwóch dniach w hodowli wymień połowę pożywki na pożywkę hodowlaną bez surowicy. Następnie wymieniaj pożywkę co 2 - 3 dni. 
		nuta: Poziom pożywki należy sprawdzić po wymianie pożywki, ponieważ jest to ważne dla przeżycia komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Elektroporacja
Wszystkie procedury powinny być wykonywane w sterylnych warunkach.
Uwaga: Wykonaj elektroporację dzień po przygotowaniu bloków wzgórza, aby zapobiec ich oderwaniu.
<ol>
	<li>plazmidy
	<ol>
		<li>Wykonać mieszaninę plazmidów w następujący sposób: pCAGGS-DsRed 2 μg/μL; pCAG-SYP-EGFP 3,5 μg/μL. 
		nuta: Oczyść oba plazmidy za pomocą zestawu Maxiprep bez endotoksyn i rozpuść w zrównoważonym roztworze soli Hanksa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konfiguracja sprzętu do elektroporacji 
	Przyrządy elektryczne, takie jak stymulator i izolator, powinny być podłączone, jak pokazano na rysunku Rysunek 2.
	<ol>
		<li>Podłącz stymulator do izolatora dwufazowego.</li>
		<li>Podłącz elektrodę (srebrny drut o średnicy 0,2 mm) do ujemnego zacisku izolatora.</li>
		<li>Podłącz elektrodę (srebrny drut o średnicy 1 mm) szeregowo do rezystora 100 Ω i dodatniego zacisku izolatora.</li>
		<li>Podłącz amplifier do oscyloskopu, aby monitorować, czy prąd elektryczny przepływa przez rezystor, mierząc napięcie za pomocą wzmacniacza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie pipet szklanych 
	Uwaga: Do wyrzucania roztworu plazmidu i stosowania impulsów elektrycznych stosuje się dwa rodzaje pipet szklanych.
	<ol>
		<li>Wykonaj pipety ze szklanych kapilar za pomocą ściągacza do elektrod.</li>
		<li>Złamać końcówkę pipety wyrzutowej (średnica końcówki powinna wynosić 20 - 50 μm).</li>
		<li>Zmielić i wypolerować końcówkę pipety elektrody papierem ściernym, a następnie wypolerować ogniowo (średnica wewnętrzna powinna wynosić 50 - 200 μm). 
		nuta: Końcówka elektrody powinna być płaska i gładka, ponieważ bezpośrednio dotyka tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura elektroporacji
	<ol>
		<li>Podłącz pipety wyrzutowe i elektrodowe do manipulatorów.</li>
		<li>Włóż srebrny drut (o średnicy 0,2 mm) do pipety elektrody.</li>
		<li>Podłączyć pipetę wyrzutową do strzykawki o pojemności 1 ml z plastikową rurką.</li>
		<li>Pobrać >5 μl roztworu plazmidu do pipety eżekcyjnej przez odsysanie strzykawki.</li>
		<li>Umieścić kokulturę na stoliku do elektroporacji i włożyć elektrodę o średnicy 1 mm do pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Umieść pipetę wyrzutową na eksplantacie wzgórzowym.</li>
		<li>Wcisnąć strzykawkę ręcznie po tym, jak końcówka dotknie powierzchni bloku wzgórzowego. 
		nuta: Zwykle stosuje się około 0,5 μl roztworu plazmidu na jeden blok wzgórza.</li>
		<li>Umieścić pipetę elektrodową na bloku wzgórza natychmiast po wycofaniu pipety wyrzutowej.</li>
		<li>Dostarczanie impulsów elektrycznych (50 - 400 μA, 3 do 5 ciągów po 200 impulsów kwadratowych o czasie trwania 1 ms przy 200 Hz). Monitoruj amplitudę i liczbę pociągów na oscyloskopie. 
		nuta: Amplituda prądów elektrycznych zależy od wewnętrznej średnicy pipety elektrodowej13.</li>
		<li>Wycofaj pipetę elektrodową i włóż naczynie z powrotem do inkubatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja mikroskopowa
	<ol>
		<li>Umieść szalkę hodowlaną na mikroskopowym stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w dwa zestawy filtrów dla EGFP (wzbudzenie, 488 nm; emisja, 515 nm) i DsRed (wzbudzenie, 514 nm; emisja, 565 nm).</li>
		<li>Rób zdjęcia 10 - 25 sekcji optycznych w rozmiarach co 1 - 7 μm za pomocą soczewki obiektywowej o 20-krotnej odległości roboczej. Wybierz indywidualnie rozróżnialne znakowane aksony, które wyrażają zarówno DsRed, jak i SYP-EGFP. 
		nuta: Obserwowany obszar wynosi około 0,7 x 0,7 mm (co odpowiada 1024 x 1024 pikselom, czyli 0,68 μm/piksel).</li>
		<li>Rób zdjęcia co 24 godziny w celu codziennego obrazowania. Zakończyć w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej i wrzucić kultury z powrotem do inkubatora. W przypadku obrazowania poklatkowego w krótkich odstępach czasu należy przechowywać kulturę w komorze hodowlanej, która utrzymuje środowisko nawilżonego 95% powietrza i 5%CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Kageyama, G. H., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+geniculocortical+projections+to+visual+cortex+in+rat%3A+evidence+early+ingrowth+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of geniculocortical projections to visual cortex in rat: evidence early ingrowth and synaptogenesis.</a> J. Comp. Neurol. 335 (1), 123-148 (1993).</li>
<li>Lopez-Bendito, G., Molnar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+development%3A+how+are+we+going+to+get+there%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical development: how are we going to get there.</a> Nat. Rev. Neurosci. 4 (4), 276-289 (2003).</li>
<li>Espinosa, J. S., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of the primary visual cortex.</a> Neuron. 75 (2), 230-249 (2012).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biol. 3 (8), 272(2005).</li>
<li>Holtmaat, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+structural+synaptic+plasticity+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent structural synaptic plasticity in the mammalian brain.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10 (9), 647-658 (2009).</li>
<li>Bhatt, D. H., Zhang, S., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine dynamics.</a> Annu Rev Physiol. 71, 261-282 (2009).</li>
<li>Yamamoto, N., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+connections+between+the+lateral+geniculate+nucleus+and+visual+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural connections between the lateral geniculate nucleus and visual cortex in vitro.</a> Science. 245 (4914), 192-194 (1989).</li>
<li>Yamamoto, N., Yamada, K., Kurotani, T., Toyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+specificity+of+extrinsic+cortical+connections+studied+in+coculture+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Laminar specificity of extrinsic cortical connections studied in coculture preparations.</a> Neuron. 9 (2), 217-228 (1992).</li>
<li>Uesaka, N., Hirai, S., Maruyama, T., Ruthazer, E. S., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+dependence+of+cortical+axon+branch+formation%3A+a+morphological+and+electrophysiological+study+using+organotypic+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activity dependence of cortical axon branch formation: a morphological and electrophysiological study using organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. 25 (1), 1-9 (2005).</li>
<li>Uesaka, N., Hayano, Y., Yamada, A., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+laminar+specificity+and+activity-dependent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Interplay between laminar specificity and activity-dependent mechanisms of thalamocortical axon branching.</a> J. Neurosci. 27 (19), 5215-5223 (2007).</li>
<li>Uesaka, N., Nishiwaki, M., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+electroporation+method+for+axon+tracing+in+cultured+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Single cell electroporation method for axon tracing in cultured slices.</a> Dev. Growth Differ. 50 (6), 475-477 (2008).</li>
<li>Matsumoto, N., Hoshiko, M., Sugo, N., Fukazawa, Y., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synapse-dependent+and+independent+mechanisms+of+thalamocortical+axon+branching+are+regulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synapse-dependent and independent mechanisms of thalamocortical axon branching are regulated by neuronal activity.</a> Dev Neurobiol. 76 (3), 323-336 (2016).</li>
<li>Matsumoto, N., Sasaki, K., Yamamoto, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/282233732_Electroporation_Method_for_Mammalian_CNS_Neurons_in_Organotypic_Slice_Cultures">Electroporation Method for Mammalian CNS Neurons in Organotypic Slice Cultures.</a> Electroporation Methods in Neuroscience. , 159-168 (2015).</li>
<li>Molnar, Z., Blakemore, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+regional+specificity+for+connections+formed+between+thalamus+and+cortex+in+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Lack of regional specificity for connections formed between thalamus and cortex in coculture.</a> Nature. 351 (6326), 475-477 (1991).</li>
<li>Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+specific+afferent+connections+in+organotypic+slice+cultures+from+rat+visual+cortex+cocultured+with+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus.</a> J. Neurosci. 12 (8), 3054-3070 (1992).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+mechanism+by+polysialic+acid+for+lamina-specific+branch+formation+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory mechanism by polysialic acid for lamina-specific branch formation of thalamocortical axons.</a> J. Neurosci. 20 (24), 9145-9151 (2000).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+factors+regulating+lamina-specific+growth+of+thalamocortical+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of factors regulating lamina-specific growth of thalamocortical axons.</a> J Neurobiol. 42 (1), 56-68 (2000).</li>
<li>Ohnami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RhoA+in+activity-dependent+cortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Role of RhoA in activity-dependent cortical axon branching.</a> J. Neurosci. 28 (37), 9117-9121 (2008).</li>
<li>Yamada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pre-+and+postsynaptic+activity+in+thalamocortical+axon+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of pre- and postsynaptic activity in thalamocortical axon branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (16), 7562-7567 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecny protokół jest również potężnym narzędziem do badania rozwojowych aspektów wzrostu aksonów innych niż projekcja TC11. Na przykład połączenie hodowli warstw korowych i techniki elektroporacji pozwala na wizualizację indywidualnej morfologii aksonalnej neuronów korowych i długoterminową obserwację 9,18.
Korzystając z obecnego protokołu, role interesujących genów w rozgałęzianiu aksonów i tworzeniu synaps mog...

Projekcja korowo-wzgórzowa (TC) w mózgu ssaków jest odpowiednim systemem do badania mechanizmów naprowadzania aksonów i celowania. Podczas rozwoju aksony czuciowe TC rosną w płytce korowej i tworzą gałęzie i synapsy preferencyjnie w warstwie IV podstawowych obszarów czuciowych w korze mózgowej1,2. Nawet po ustanowieniu podstawowych połączeń, altanki aksonalne i zakończenia synaptyczne są przebudowywane w zależności od zmian środowiskowych3,4. Jednak sposób, w jaki morfologia aksonów TC jest dynamicznie zmieniana, jest słabo poznany. Jednym z głównych powodów jest brak odpowiedniej techniki obserwacji zmian strukturalnych na poziomie pojedynczej komórki. Chociaż ostatnie osiągnięcia w mikroskopii, takie jak mikroskopia dwufotonowa, umożliwiły bezpośrednią obserwację żywych neuronów korowych in vivo, nadal istnieją ograniczenia techniczne w rejestrowaniu ogólnych trajektorii TC5,6. W związku z tym metody in vitro do obrazowania na żywo aksonów TC dostarczyłyby potężnych narzędzi do analiz strukturalnych rozgałęziania się aksonów i tworzenia synaps.
Nasza grupa po raz pierwszy ustaliła metodę statycznej hodowli plastrów z przepuszczalną membraną7. Korzystając z tej metody, wycinek kory mózgowej szczura został poinstruowany z sensorycznym blokiem wzgórza, a połączenia TC specyficzne dla blaszek zostały zrekapitulowane w tych organotypowych kokulturach7,8. Rzadkie znakowanie białkiem fluorescencyjnym pozwoliło nam dodatkowo zaobserwować wzrost aksonów TC i tworzenie się gałęzi9,10,11. Niedawno opracowaliśmy nowatorską metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień i tworzenia synaps poszczególnych aksonów TC w organotypowych kokulturach12. Aby jednocześnie uwidocznić aksony TC i miejsca presynaptyczne, DsRed i synaptofizyna znakowana EGFP (SYP-EGFP) zostały połączone z transfekcją do niewielkiej liczby neuronów wzgórzowych przez elektroporację kokultury organotypowej. Obecna metoda ułatwia analizę morfologiczną aksonów TC i pozwala na długotrwałą obserwację, która może być wykorzystana do wykazania związku przyczynowego między rozgałęzianiem się aksonów a powstawaniem synaps.

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Nissui</td><td>5905</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396-03</td><td></td></tr><tr><td>Hyklon</td><td>Insulina Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma& nbsp;</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>192-10843</td><td></td></tr><tr><td>Transferyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>16806-25</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Millicell-CM</td><td>Wkładka Millipore</td><td>PICMORG50</td><td></td></tr><tr><td>100 mm</td><td>szalki Petriego BIO-BIK</td><td>I-90-20</td><td>szalka Petriego sterylna</td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K210006</tr><tr><td>Jednorazowe sterylne pipety plastikowe Pipety</td><td></td> transferowe <td>202-IS</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>Kapilara szklana: OD 1,2 mm</td><td>Narishige</td><td>&nbsp; G-1,2</td><td>średnica wewnętrzna, 1,2 mm</td></tr><tr><td>Drut srebrny: 0,2 i 1 mm&nbsp;</td><td>Nilaco</td><td>AG-401265 (średnica, 0,2 mm), AG-401485 (średnica, 1,0 mm)</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td> Stymulator <td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Izolator dwufazowy <td>A.M.P.I</td><td>Master 8</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Wzmacniacz <td>BSI-2</td><td></td> <td>firmy BAK ELECTRONICS</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Systemy AM</td><td>Model 1800</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Hitachi</td><td>VC-6723</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MO-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>SZ40</td><td></td></tr><tr><td>Stojak uniwersalny&nbsp;</td>System oświetlenia świetlnego <td>Olympus</td><td>SZ-STU2</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ściągacz elektrod Olympus</td><td>LG-PS2, LG-DI, HLL301</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Mikroskop konfokalny <td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Digital eclipse C1 laser</td><td></td></tr><tr><td>x20 obiektyw</td><td>Nikon</td><td>ELWD 20x/0.45</td><td></td></tr><tr><td>Komora</td><td>hodowlana Tokai Hit</td><td>UK A16-U</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) szczur</td><td>Japonia SLC i Nihon-Dobutsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki mikrochirurgiczne</td><td>Natsume&nbsp;</td><td>MB-54-1</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Visualization of Thalamocortical Axon Branching and Synapse Formation in Organotypic Cocultures

Rozgałęzianie aksonów i tworzenie synaps są kluczowymi procesami dla tworzenia precyzyjnych obwodów neuronalnych. Podczas rozwoju aksony czuciowe wzgórzowo-korowe (TC) tworzą gałęzie i synapsy w określonych warstwach kory mózgowej. Pomimo oczywistej korelacji przestrzennej między rozgałęzianiem się aksonów a tworzeniem synaps, związek przyczynowy między nimi jest słabo poznany. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy niedawno metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień i tworzenia synaps poszczególnych aksonów TC w kokulturach organotypowych.
Ten protokół opisuje metodę, która składa się z połączenia kokultury organotypowej i elektroporacji. Organotypowe kokultury wzgórza i kory mózgowej ułatwiają manipulację genami i obserwację procesów aksonalnych, zachowując charakterystyczne struktury, takie jak konfiguracja laminarna. Dwa odrębne plazmidy kodujące DsRed i synaptofizynę znakowaną EGFP (SYP-EGFP) zostały połączone z transfekcją do niewielkiej liczby neuronów wzgórzowych za pomocą techniki elektroporacji. Metoda ta pozwoliła na jednoczesną wizualizację poszczególnych morfologii aksonalnych neuronów TC i ich miejsc presynaptycznych. Metoda umożliwiła również długoterminową obserwację, która ujawniła związek przyczynowo-skutkowy między rozgałęzianiem się aksonów a powstawaniem synaps.

Opisany tutaj eksperyment ma na celu ujawnienie zależności między rozgałęzianiem aksonów komórek TC a tworzeniem się synaps. Aby jednocześnie zwizualizować trajektorie aksonalne i lokalizację miejsc presynaptycznych, pojedyncze lub kilka komórek wzgórza w organotypowych kokulturach przetransfekowano za pomocą elektroporacji dwoma plazmidami kodującymi SYP-EGFP oraz DsRed. W drugim tygodniu hodowli poszczególne, rozróżnialne aksony TC zostały wyraźnie oznakowane białkiem DsRed (<strong cla...

Ten protokół opisuje metodę jednoczesnego obrazowania rozgałęzień aksonów wzgórza i tworzenia synaps w organotypowych kokulturach wzgórza i kory mózgowej. Poszczególne aksony wzgórzowo-korowe i ich zakończenia presynaptyczne są wizualizowane za pomocą techniki elektroporacji pojedynczej komórki z synaptofizyną znakowaną DsRed i GFP.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Axon branching and synapse formation are crucial processes for establishing precise neuronal circuits. During development, sensory thalamocortical (TC) ...

Ogólnym celem tej metody jest zbadanie dynamicznych zmian morfologicznych rozgałęziania aksonów i tworzenia synaps w projekcji wzgórzowo-korowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny neurobiologii, takie jak tworzenie nowych obwodów neuronowych. Główną zaletą tej techniki jest jednoczesna obserwacja wzrostu aksonów i powstawania synaps w poszczególnych żywych komórkach.Metoda ta może dostarczyć informacji na temat związku między rozgałęzianiem się aksonów a tworzeniem synaps w projekcjach wzgórzowo-korowych. Może być również stosowany do innych obwodów neuronalnych, takich jak wewnętrzne połączenie w korze mózgowej. Aby rozpocząć tę procedurę, sterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem przez 10 minut lub dłużej.Następnie szybko przeprowadź sekcję całego mózgu szczura po urodzeniu w drugim dniu pod lodowatą narkozą. Następnie umieść mózg na 100-milimetrowej szalce Petriego zawierającej 40 mililitrów zimnego roztworu soli Hanka. Pod mikroskopem dwuokularowym ostrożnie usuń materię pia za pomocą cienkich kleszczy i pokrój pierwotną korę wzrokową i somatosensoryczną na plastry o grubości od 300 do 400 mikronów za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych.Następnie przenieś plastry korowe na filtr membranowy wkładki hodowlanej za pomocą jednorazowej plastikowej pipety. Wyreguluj położenie plastrów w pobliżu środka wkładki hodowlanej za pomocą jednorazowej plastikowej pipety i usuń nadmiar pożywki z wkładki. Utrzymuj plastry w pożywce hodowlanej zawierającej surowicę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i hoduj je samodzielnie przez jeden dzień przed umieszczeniem obok niego bloku wzgórzowego z zarodka E15.Wyreguluj poziom pożywki nieco poniżej powierzchni plastru, tak aby plastry mogły otrzymać wystarczający dopływ zarówno gazu, jak i pożywki. Ma to kluczowe znaczenie dla żywotności plastrów. Na tym etapie wykonaj szklane kapilary za pomocą ściągacza elektrod.Następnie rozbij końcówki szklanych naczyń włosowatych w celu wstrzyknięcia plazmidu. W przypadku pipet elektrodowych zmielić i wypolerować końcówki szklanych kapilar papierem ściernym. A następnie wypoleruj je na gorąco, aby uzyskać średnicę wewnętrzną od 50 do 200 mikronów.Następnie przymocuj pipetę elektrodową i pipetę wyrzutową do manipulatorów. Przenieś pięć mikrolitrów roztworu plazmidu na szalkę Petriego. Następnie wciągnąć roztwór do pipety elektrody o działaniu kapilarnym.Włóż elektrodę o średnicy 0,2 milimetra do pipety elektrody. Po podłączeniu pipety wyrzutowej do jednomililitrowej strzykawki z plastikową rurką, ponownie przenieś pięć mikrolitrów roztworu plazmidu na szalkę Petriego. Następnie powoli wciągnąć roztwór do pipety wyrzutowej za pomocą strzykawki.Następnie przenieś kokulturę na etap elektroporacji i włóż elektrodę o średnicy jednego milimetra do pożywki hodowlanej. Następnie umieść pipetę wyrzutową na hodowanym bloku wzgórza. Wcisnąć strzykawkę ręcznie po tym, jak końcówka dotknie powierzchni bloku wzgórza.Umieścić pipetę elektrodową na bloku wzgórza natychmiast po wycofaniu pipety wyrzutowej. Teraz dostarcz impulsy elektryczne. Monitoruj amplitudę i liczbę pociągów na oscyloskopie.Następnie wycofaj pipetę elektrody i włóż naczynie z powrotem do inkubatora. Aby obserwować próbkę, należy umieścić naczynie hodowlane na stoliku pionowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w dwa zestawy filtrów dla EGFP i DsRed. Następnie wykonaj zdjęcia od 10 do 25 sekcji optycznych, w krokach co jeden do siedmiu mikronów, za pomocą soczewki obiektywowej o dużej odległości roboczej 20x.Wybierz indywidualnie rozróżnialne znakowane aksony, które wyrażają zarówno DsRed, jak i Syp-EGFP. Pokazana tutaj jest organotypowa kokultura plastrów wzgórza i kory mózgowej po 12 DIV. Oto powiększony obraz obszaru pudełkowego.A oto komórka wzgórza znakowana DsRed, która rozciąga akson do warstwy korowej i tworzy gałęzie w górnych warstwach. Obrazy te pokazują akson wzgórzowo-korowy oznaczony DsRed i punkt Syp-EGFP. Dyskretną akumulację Syp-EGFP obserwowano wzdłuż pojedynczego aksonu wzgórzowo-korowego.Plazmidy DsRed plus Syp-EGFP wprowadzono do hodowanych komórek wzgórza w jednym DIV za pomocą elektroporacji. Akson ten był fotografowany codziennie przez cztery dni. Rozgałęzianie aksonów i tworzenie synaps było dynamiczne, z dodawaniem i eliminacją.Po tych procedurach można przeprowadzić elektroporację interesujących genów wraz z Syp-EGFP i DsRed w celu zbadania roli genu w rozgałęzianiu aksonów i tworzeniu synaps. Technika ta toruje drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do badania mechanizmów dynamicznych zmian obwodów neuronalnych.

visualization-thalamocortical-axon-branching-synapse-formation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia technikę obrazowania na żywo z wykorzystaniem mikroskopii różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC) do obserwacji rozgałęzień aksonalnych w czasie rzeczywistym w neuronach korowych. Filmy poklatkowe ukazują efekty leczenia netryną-1, cząsteczką sygnałową, która indukuje...

Obrazowanie in vitro w czasie rzeczywistym rozgałęzień aksonalnych w neuronach korowych myszy

Organotypowa kokultura wycinków mózgu z komórkami rakowymi umożliwia wizualizację zmian morfologicznych za pomocą fluorescencji, jak również mikroskopii w jasnym polu (wideo) podczas procesu inwazji komórek rakowych w tkance mózgowej. Ten modelowy system pozwala również na podejście oparte na wymianie i uzupełnianiu komórek oraz oferuje szeroką gamę manipulacji i analiz.

System kokultury z organotypowym wycinkiem mózgu i sferoidą 3D komórek rakowych

Używając wielu kątów do cięcia mózgu szczeniaka myszy, ulepszamy poprzednio opisany ostry wycinek mózgu, który rejestruje połączenia między większością głównych struktur słuchowych śródmózgowia i przodomózgowia.

Modyfikacja kolikulo-wzgórzowo-korowego wycinka mózgu myszy, obejmująca drukowanie 3D elementów komory i wieloskalowe obrazowanie optyczne

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię uzyskiwania spłaszczonych przekrojów stycznych z kory mózgowej ssaków i wizualizacji modułów korowych za pomocą metod histochemicznych i immunohistochemicznych.

Wizualizacja modułów korowych w spłaszczonych korach ssaków

W tym protokole staramy się opisać powtarzalną metodę łączenia zdysocjowanych ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w kokultury sfer 3D, utrzymywania tych sfer w warunkach swobodnego pływania, a następnie mierzenia aktywności obwodów synaptycznych kul za pomocą immunoanalizy i zapisów z matrycy wieloelektrodowej.

Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

Poznaj metodę obserwacji rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych szczura. Technika umożliwia jednoczesne badanie dynamiki wzrostu aksonów oraz formowania połączeń synaptycznych w żywych komórkach.

Wizualizacja rozgałęzień aksonów wzgórzowo-korowych i tworzenia synaps w kokulturach organotypowych

Przeglądaj więcej filmów