Name: Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów AGM do badania rozwoju komórek macierzystych krwi. Technika ta umożliwia analizę ekspresji DNA i ocenę zdolności tworzenia kolonii HSC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Suwei Gao za pomoc w przygotowaniu figury. Prace te były wspierane przez granty Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (81530004, 31425016) oraz Ministerstwa Nauki i Technologii Chin (2016YFA0100500). J.L. przeprowadził eksperymenty i sporządził szkic rękopisu; F.L. zredagował rękopis. Obaj autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję rękopisu.

Wszystkie procedury, w tym tematy zwierzęce, zostały zatwierdzone przez Komisję Oceny Etyki w Instytucie Zoologii Chińskiej Akademii Nauk, Pekin, Chiny.
1. Przygotowanie materiału
<ol>
	<li>Sterylizuj filtry 0,65 μm promieniami ultrafioletowymi wytwarzanymi pod lampą ultrafioletową na czystej ławie przez 4 godziny i odwróć filtry po upływie 2 godzin. 
	UWAGA: Podczas pracy ze światłem UV należy nosić odpowiednią ochronę.</li>
	<li>Sterylizuj siatki ze stali nierdzewnej za pomocą sterylizatora autoklawu w temperaturze 121 °C przez 30 minut. 
	UWAGA: Do podparcia filtrów na granicy faz powietrze-ciecz potrzebna jest pewna wysokość siatki ze stali nierdzewnej i można to zrealizować za pomocą drutu na stalowej siatce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A).</li>
	<li>Rozcieńczyć fluoksetynę do końcowego stężenia 10 μM w pożywce do hodowli długoterminowej M5300 i równomiernie wymieszać. 
	UWAGA: W przypadku płytki sześciodołkowej dla każdej studzienki odpowiednie są 2 ml pożywki do hodowli długoterminowej M5300. Hydrokortyzon w 10-6 M można selektywnie rozcieńczać w pożywce.</li>
	<li>Przenieść pożywkę uzupełnioną fluoksetyną w stężeniu 10 μM do sześciodołkowych płytek lub szalek i umieścić wysterylizowane siatki ze stali nierdzewnej w pożywce.</li>
	<li>Umyj filtry 0,65 μm wrzącą wodą dwa razy przez 3 minuty za każdym razem w naczyniu do hodowli komórek szklanych w celu sterylizacji. Po każdym myciu umieść filtry w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na 2 minuty i umieść mokre filtry na siatkach ze stali nierdzewnej stojących na granicy faz powietrze-ciecz, jak pokazano na <silna klasa="xfig">Rysunek 1A [schemat w środku]. 
	UWAGA: Za pomocą sterylizatora autoklawu można wytworzyć wrzącą wodę, aby osiągnąć aseptykę, a sprzęt należy wyjąć ze sterylizatora autoklawu w odpowiednim czasie, aby uniknąć spadku temperatury.</li>
</ol>
2. AGM Hodowla eksplantatów
<ol>
	<li>Ostrożnie oddziel obszary AGM od zarodków w E10.5 lub E11 za pomocą kleszczy.
	<ol>
		<li>Usuń macice z ciężarnych myszy nożyczkami preparacyjnymi i oddziel zarodki od macic</li>.
		<li>Zetrzyj woreczek żółtkowy, pępowinę i wnętrzności z ciała zarodka.</li>
		<li>Ostrożnie usuń grzbietowe tkanki nerwowe i otaczające tkanki mięśniowe.</li>
		<li>Odetnij tkanki kleszczami w miejscu kończyn przednich i tylnych i oddziel obszar AGM od ciała zarodka. <silna klasa="xfig">Rysunki 1B-C pokazują schematyczną reprezentację i morfologię wypreparowanego AGM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypreparowane AGM należy oddzielnie umieścić na filtrach na granicy faz powietrze-ciecz (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1A) i hodować w 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 2 - 3 dni. 
	UWAGA: Nie umieszczaj rozciętego AGM na drucie stalowej siatki i upewnij się, że filtry znajdują się na granicy faz powietrze-ciecz podczas hodowli. Oprócz AGM, woreczek żółtkowy i wątroba płodu mogą być również hodowane za pomocą tego systemu7.</li>
</ol>
3. Analizy wyrażeń
<ol>
	<li>Poziom mRNA
	<ol>
		<li>Zebrać wyhodowane AGM do 1 ml PBS i odwirować w temperaturze 4 °C, 310 x g przez 6 minut.</li>
		<li>Po usunięciu supernatantu całkowity RNA jest ekstrahowany z zebranych AGM za pomocą jednofazowego roztworu fenolu, zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Całkowite RNA (2 μg) jest następnie poddawane odwrotnej transkrypcji przy użyciu odwrotnej transkryptazy M-MLV w celu uzyskania cDNA jako matrycy. Ilościowe testy PCR w czasie rzeczywistym są wykonywane za pomocą SYBR Green, a Gapdh jest używany jako kontrola wewnętrzna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poziom białka
	<ol>
		<li>Zebrać wyhodowany AGM zgodnie z powyższym opisem w kroku 3.1.1.</li>
		<li>Przygotuj białko z hodowanego AGM z buforem do lizy komórek (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl i 0,5% NP-40) zawierającym inhibitor proteazy i użyj do western blotting w celu wykrycia poziomu białka, jak opisano wcześniej13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Jednostki tworzące kolonie w teście kulturowym (CFU-C)
<ol>
	<li>Po hodowli przez 2 - 3 dni, zebrać regiony AGM do 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirować w temperaturze 4 °C, 310 x g przez 6 minut i dysocjować za pomocą 200 μl kolagenazy (0,1% w PBS) w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Czas potrzebny kolagenazie do wytworzenia zawiesin jednokomórkowych wynosi około 20 minut. Potrząsanie probówką zawierającą AGM co 5 minut może przyspieszyć proces trawienia. Do każdego AGM stosuje się 200 μl 0,1% kolagenazy, a 200 μl 10% surowicy stosuje się do zatrzymania reakcji.</li>
	<li>Zawiesiny jednokomórkowe do hodowli w pożywce M3434 na 24-dołkowych płytkach o bardzo niskim mocowaniu. 
	UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia, roztwór penicyliny i streptomycyny można selektywnie dodawać do pożywki. Ponieważ podłoże M3434 jest lepkie, do mieszania komórek i podłoża używa się strzykawki o pojemności 1,0 ml bez igły.</li>
	<li>Po 7 - 10 dniach hodowli w temperaturze 37 °C w 5% CO2 rozróżnia się liczbę dla każdego typu kolonii, w tym jednostkę tworzącą Burst - erytroidalną (BFU-E), CFU-granulo-monocyty (CFU-GM) i CFU-granulocyty, erytrocyty, makrofagi, megakariocyty (CFU-GEMM) na podstawie morfologii i oceniane za pomocą odwróconego mikroskopu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>
5. Test transplantacyjny in vivo 
<ol>
	<li>Test jednostek tworzących kolonie – śledziona (CFU-S)
	<ol>
		<li>Po 2 - 3 dniach hodowli eksplantacyjnej, zebrać AGM i przygotować zawiesiny pojedynczych komórek, inkubując z 200 μl kolagenazy (0,1% w PBS) przez 20 minut.</li>
		<li>Wykonaj śmiertelne napromienianie (9 Gy promieni rentgenowskich) 8- do 10-tygodniowego samca myszy C57BL / 6 4 - 5 godzin przed wstrzyknięciem komórek.</li>
		<li>Umieść napromieniowaną mysz w ograniczniku, aby ograniczyć jej aktywność.</li>
		<li>Przetrzyj ogon bawełnianym wacikiem nasączonym 75% alkoholem, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły.</li>
		<li>Wstrzyknąć dożylnie 0,5 ekwiwalentu zarodka (ee) lub 1 ee zawiesiny jednokomórkowej AGM do żyły ogonowej napromienianej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 cm3. 
		UWAGA: Komórki są zawieszone za pomocą PBS, a 0,5 ml PBS na odbiorcę to odpowiednia objętość. Igła o rozmiarze 25 lub 26 G jest używana do wstrzykiwania za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 cm3. Do strzykawki nie można wprowadzić powietrza. Uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem antyseptycznym, aby zatrzymać krwawienie.</li>
		<li>Jedenaście dni po przeszczepie zbierz i utrwal śledziony myszy biorcy w roztworze Bouina (15 ml 1,22% nasyconego kwasu pikrynowego roztworu wodnego, 2 ml 40% metanolu i 1 ml kwasu octowego) przez 1-2 dni i myj 80% alkoholem przez kolejne 1-2 dni. Policz makroskopowo widoczne kolonie w śledzionie i określ liczbę kolonii na ee. 
		UWAGA: Utrwalacz Bouina, nosić odpowiednią ochronę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Długoterminowy test transplantacyjny
	<ol>
		<li>Po 2 - 3 dniach hodowli eksplantacyjnej, zebrać AGM i przygotować zawiesiny jednokomórkowe poprzez inkubację z 200 μl kolagenazy (0,1% w PBS) przez 20 minut.</li>
		<li>Wykonaj śmiertelne napromienianie (9 Gy promieniowania rentgenowskiego) 8- do 10-tygodniowego samca myszy C57BL / 6 4 - 5 godzin przed wstrzyknięciem komórek.</li>
		<li>Umieść napromieniowaną mysz w ograniczniku, aby ograniczyć jej aktywność.</li>
		<li>Przetrzyj ogon bawełnianym wacikiem nasączonym 75% alkoholem, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych żyły.</li>
		<li>Wstrzyknąć dożylnie 0,5 ekwiwalentu zarodka (ee) lub 1 ee zawiesiny jednokomórkowej AGM do żyły ogonowej napromienianej myszy za pomocą strzykawki o pojemności 1,0 cm3. AGM wstrzykuje się w dawce 1 ee na biorcę z 2×105 komórek szpiku kostnego (tło CD45.1). 
		UWAGA: Do strzykawki nie można wprowadzić powietrza. Uciskać miejsce wstrzyknięcia wacikiem antyseptycznym, aby zatrzymać krwawienie.</li>
		<li>Cztery miesiące po przeszczepie należy pobrać szpik kostny biorcy i użyć go do testu rekonstytucji za pomocą FACS. Tylko biorcy z ≥10% chimeryzmem pochodzącym od dawcy są uważani za wykazujących udaną rekonstytucję.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bertrand, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cells+derive+directly+from+aortic+endothelium+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development.</a> Nature. 464, 108-111 (2010).</li>
<li>Boisset, J. C., Robin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+founder+of+adult+hematopoiesis+in+the+mouse+embryo+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+cycle%22%5BJournal%5D)">Imaging the founder of adult hematopoiesis in the mouse embryo aorta.</a> Cell cycle. 9, 2489-2490 (2010).</li>
<li>Kissa, K., Herbomel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+stem+cells+emerge+from+aortic+endothelium+by+a+novel+type+of+cell+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition.</a> Nature. 464, 112-115 (2010).</li>
<li>Zovein, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+reveals+the+endothelial+origin+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Fate tracing reveals the endothelial origin of hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 3, 625-636 (2008).</li>
<li>Kumaravelu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+developmental+anatomy+of+definitive+haematopoietic+stem+cells+long-term+repopulating+units+%28HSC%2FRUs%29%3A+role+of+the+aorta-gonad-mesonephros+%28AGM%29+region+and+the+yolk+sac+in+colonisation+of+the+mouse+embryonic+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative developmental anatomy of definitive haematopoietic stem cells long-term repopulating units (HSC/RUs): role of the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region and the yolk sac in colonisation of the mouse embryonic liver.</a> Development. 129, 4891-4899 (2002).</li>
<li>Orkin, S. H., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoiesis%3A+an+evolving+paradigm+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hematopoiesis: an evolving paradigm for stem cell biology.</a> Cell. 132, 631-644 (2008).</li>
<li>Medvinsky, A., Dzierzak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitive+hematopoiesis+is+autonomously+initiated+by+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region.</a> Cell. 86, 897-906 (1996).</li>
<li>Peeters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+embryonic+tissues+and+Hedgehog+proteins+induce+early+AGM+hematopoietic+stem+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ventral embryonic tissues and Hedgehog proteins induce early AGM hematopoietic stem cell development.</a> Development. 136, 2613-2621 (2009).</li>
<li>Taoudi, S., Medvinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+identification+of+the+hematopoietic+stem+cell+niche+in+the+ventral+domain+of+the+embryonic+dorsal+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Functional identification of the hematopoietic stem cell niche in the ventral domain of the embryonic dorsal aorta.</a> PNAS. 104, 9399-9403 (2007).</li>
<li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+Hedgehog+Regulate+Distinct+AGM+Hematopoietic+Stem+Cells+Ex+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">BMP and Hedgehog Regulate Distinct AGM Hematopoietic Stem Cells Ex Vivo.</a> Stem Cell Reports. 6, 383-395 (2016).</li>
<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stromal+clones+reveal+developmental+regulators+of+definitive+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Embryonic stromal clones reveal developmental regulators of definitive hematopoietic stem cells.</a> PNAS. 104, 20838-20843 (2007).</li>
<li>Fleury, M., Petit-Cocault, L., Clay, D., Souyri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mpl+receptor+defect+leads+to+earlier+appearance+of+hematopoietic+cells%2Fhematopoietic+stem+cells+in+the+Aorta-Gonad-Mesonephros+region%2C+with+increased+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Mpl receptor defect leads to earlier appearance of hematopoietic cells/hematopoietic stem cells in the Aorta-Gonad-Mesonephros region, with increased apoptosis.</a> Int J Dev Biol. 54, 1067-1074 (2010).</li>
<li>Lv, J., Wang, L., Gao, Y., Ding, Y. Q., Liu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hydroxytryptamine+synthesized+in+the+aorta-gonad-mesonephros+regulates+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">5-hydroxytryptamine synthesized in the aorta-gonad-mesonephros regulates hematopoietic stem and progenitor cell survival.</a> J Exp Med. 214, 529-545 (2017).</li>
<li>Souilhol, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inductive+interactions+mediated+by+interplay+of+asymmetric+signalling+underlie+development+of+adult+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Inductive interactions mediated by interplay of asymmetric signalling underlie development of adult haematopoietic stem cells.</a> Nature communications. 7, 10784(2016).</li>
<li>Fitch, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+the+sympathetic+nervous+system+regulates+hematopoietic+stem+cell+emergence+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis.</a> Cell Stem Cell. 11, 554-566 (2012).</li>
<li>Bianchi, M., Moser, C., Lazzarini, C., Vecchiato, E., Crespi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+swimming+test+and+fluoxetine+treatment%3A+in+vivo+evidence+that+peripheral+5-HT+in+rat+platelet-rich+plasma+mirrors+cerebral+extracellular+5-HT+levels%2C+whilst+5-HT+in+isolated+platelets+mirrors+neuronal+5-HT+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Forced swimming test and fluoxetine treatment: in vivo evidence that peripheral 5-HT in rat platelet-rich plasma mirrors cerebral extracellular 5-HT levels, whilst 5-HT in isolated platelets mirrors neuronal 5-HT changes.</a> Exp Brain Res. 143, 191-197 (2002).</li>
<li>Ortiz, J., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+monoamine+uptake+inhibitors+on+extracellular+and+platelet+5-hydroxytryptamine+in+rat+blood%3A+different+effects+of+clomipramine+and+fluoxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effects of monoamine uptake inhibitors on extracellular and platelet 5-hydroxytryptamine in rat blood: different effects of clomipramine and fluoxetine.</a> Br J Pharmacol. 105, 941-946 (1992).</li>
<li>Wong, D. T., Horng, J. S., Bymaster, F. P., Hauser, K. L., Molloy, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+inhibitor+of+serotonin+uptake%3A+Lilly+110140%2C+3-%28p-trifluoromethylphenoxy%29-N-methyl-3-phenylpropylamine%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">A selective inhibitor of serotonin uptake: Lilly 110140, 3-(p-trifluoromethylphenoxy)-N-methyl-3-phenylpropylamine.</a> Life sciences. 15, 471-479 (1974).</li>
<li>Chen, M. J., Yokomizo, T., Zeigler, B. M., Dzierzak, E., Speck, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Runx1+is+required+for+the+endothelial+to+haematopoietic+cell+transition+but+not+thereafter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Runx1 is required for the endothelial to haematopoietic cell transition but not thereafter.</a> Nature. 457, 887-891 (2009).</li>
<li>Rybtsov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hierarchical+organization+and+early+hematopoietic+specification+of+the+developing+HSC+lineage+in+the+AGM+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Hierarchical organization and early hematopoietic specification of the developing HSC lineage in the AGM region.</a> J Exp Med. 208, 1305-1315 (2011).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bringing+together+the+organoid+field%3A+from+early+beginnings+to+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bringing together the organoid field: from early beginnings to the road ahead.</a> Development. 144, 963-967 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów finansowych.

Powszechnie wiadomo, że dojrzałe HSC w szpiku kostnym mogą ponownie zasiedlać układ krwionośny napromieniowanych biorców. W przeciwieństwie do tych funkcjonalnych HSC, pojawiające się HSC w AGM zarodków myszy są niedojrzałe. Wyniki bezpośredniego przeszczepu wykazały, że pre-HSC typu I (VE-cad+ CD45-CD41+) i typu II (VE-cad+ CD45+) nie mają zdolności do rekonstytucji20. Korzystając z systemu hodowli eksplantatów AGM, powstające HSC w regionie ...

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) to specyficzne tkankowo dorosłe komórki macierzyste, które posiadają potencjał wieloliniowy, w tym komórki erytroidalne, szpikowe i limfoidalne, a także zdolność do samoodnawiania się. Ostatnie badania wykazały, że najwcześniejsze HSC powstały z wyspecjalizowanej populacji śródbłonka, znanej jako śródbłonek hemogenny (HE), poprzez przejście śródbłonka do układu krwiotwórczego (EHT) na brzusznej ścianie aorty grzbietowej1,2,3,4. Po utworzeniu w regionie aorta-gonad-mesonefrost (AGM) od embrionalnego (E) 10,5 do E12,5 w zarodku myszy, HSC będą migrować do wątroby płodu w celu ekspansji i ostatecznie skolonizują szpik kostny, aby utrzymać dorosłą hematopoezę przez całe życie danej osoby5,6. Chociaż jest to badane od wielu lat, mechanizmy leżące u podstaw powstawania i rozwoju HSC pozostają nie w pełni poznane.
W przeciwieństwie do zapłodnienia in vitro i rozwoju zarodków danio pręgowanego, wewnątrzmaciczny rozwój zarodków myszy sprawia, że badanie ostatecznej hematopoezy podczas embriogenezy jest znacznie bardziej niewygodne. Chociaż eksperymenty genetyczne z użyciem myszy z nokautem (KO) są powszechnie stosowane, brak niektórych myszy KO również ogranicza ich zastosowanie w dziedzinie badań krwiotwórczych. Ponadto eksperymenty ratunkowe in vivo nie są łatwe do przeprowadzenia na myszach KO. Od 1996 roku hodowla eksplantatów AGM jest opracowywana do badań krwiotwórczych przez pionierów w tej dziedzinie7. Za pomocą tego systemu hodowli zidentyfikowano, że tkanki brzuszne regionu AGM promują aktywność HSC, podczas gdy tkanki grzbietowe wywierają odwrotny efekt8,9. System hodowli eksplantatów AGM został również zastosowany do określenia ról sygnalizacji serotoniny, Mpl, SCF, BMP i Hedgehog w rozwoju HSC10,11,12,13,14. Co ważne, jest to również popularna metoda stosowana do ratowania wad krwiotwórczych u zmutowanych zarodków13,15.

<table><tbody><tr><td>durapore 0,65 &mikro; m filtry</td><td>Millipore</td><td>R5BA63787</td><td>AGM hodowla eksplantatów</td></tr><tr><td>M5300 pożywka do hodowli długoterminowej</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5300</td><td>AGM hodowla eksplantatów</td></tr><tr><td>Trizol&nbsp;</td><td>Tiangen</td><td>5829</td><td>Ekstracja RNA</td></tr><tr><td>Odwrotna transkryptaza M-MLV</td><td>Promega</td><td>90694</td><td>odwrotna transkrypcja</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>A6002</td><td>ilościowy</td></tr><tr><td>inhibitor proteazy</td> PCR w czasie rzeczywistym <td>Roche</td><td>55622</td><td>Ekstracja białek</td></tr><tr><td>kolagenaza</td><td>Sigma</td><td>C2674</td><td>trawienie tkanek AGM</td></tr><tr><td>MethoCult GF M3434 średni</td><td>Test komórek macierzystych</td><td>3434</td><td>CFU-C</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki o bardzo niskim przyczepie</td><td>Costar</td><td>3473</td><td>Test CFU-C</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.2 myszy</td> Pekin <td>HFK Bioscience Co., Ltd</td><td></td><td>Test CFU-S</td></tr><tr><td>C57BL/6 CD45.1 myszy</td> Pekin <td>HFK Bioscience Co. Ltd</td><td></td><td>Długoterminowa transplantacja</td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Life Technologines</td><td>8115284</td><td>Kolekcja AGM</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny i streptomycyny</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>AGM hodowla eksplantatów</td></tr><tr><td>anty-CD45.2-PE-CY7</td><td>eBioscience</td><td>25-0454-80</td><td>Długoterminowy przeszczep</td></tr><tr><td>anty-CD45-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td></td></tr><tr><td>Długotrwała lampa UV</td> do przeszczepu <td>Pekin jiangmorning yuan bio-technology co., LTD</td><td>039-14402</td><td>moc: 30W</td></tr><tr><td>siatka ze stali nierdzewnej</td><td>AS ONE SHANGHAI Corporation</td><td>2-9817-10&nbsp;</td><td>średnica otworu: 2,5 mm</td></tr><tr><td>hydrokortyzon</td><td>Sigma</td><td>H0396</td><td>selektywnie rozcieńczony do podłoża M5300</td></tr></tbody></table>

zastosowanie systemu hodowli eksplantatów aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

Ograniczeniem używania embrionów myszy do badań hematopoezy jest dodatkowa niedogodność w operacjach, która jest w dużej mierze spowodowana wewnątrzmacicznym rozwojem zarodka. Chociaż dane genetyczne od myszy z nokautem (KO) są przekonujące, nie jest realistyczne generowanie myszy KO dla wszystkich genów w razie potrzeby. Ponadto przeprowadzanie eksperymentów ratowniczych in vivo w celu konsolidacji danych uzyskanych od myszy KO nie jest wygodne. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, opracowano hodowlę eksplantatów Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) jako odpowiedni system do badania rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Szczególnie w przypadku eksperymentów ratunkowych może być stosowany do odzyskiwania upośledzonej hematopoezy u myszy KO. Dodając odpowiednie substancje chemiczne do pożywki, można reaktywować upośledzoną sygnalizację lub zahamować szlaki regulowane w górę. Za pomocą tej metody można przeprowadzić wiele eksperymentów w celu zidentyfikowania krytycznych regulatorów rozwoju HSC, w tym ekspresji genów związanych z HSC na poziomie mRNA i białka, zdolności do tworzenia kolonii i zdolności do rekonstytucji. Ta seria eksperymentów byłaby pomocna w zdefiniowaniu mechanizmów leżących u podstaw rozwoju HSC u ssaków.

W niedawnej publikacji wykazano, że serotonina pochodząca z komórek śródbłonka wspomaga przeżywalność HSC poprzez hamowanie szlaku proapoptotycznego w obszarze AGM.13Aby potwierdzić promujący wpływ serotoniny na rozwój HSC, zastosowano fluoksetynę. Jako selektywny inhibitor zwrotnego wychwytu serotoniny (SSRI), fluoksetyna wykazuje zdolność do hamowania reabsorpcji serotoniny w tkankach obwodowych.16,17<sup...

Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.

Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykorzystanie hodowli eksplantatów aorta-gonad-mesonephros w celu zbadania krytycznych regulatorów rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii i dziedzinach funkcjonalnych HSC dotyczące sposobu identyfikacji czynników zaangażowanych w regulację rozwoju HSC u ssaków. Główną zaletą tej techniki jest to, że regulatory te można zweryfikować poprzez analizę ekspresji DNA oraz zdolność tworzenia kolonii i zdolność rekonstytucji HSC.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ precyzyjne oddzielenie AGM od otaczających tkanek w okolicy tułowia wymaga praktyki. Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić siatki ze stali nierdzewnej w indywidualnych dołkach sześciodołkowej płytki zawierającej dwa mililitry świeżo przygotowanej pożywki uzupełnionej fluoksetyną na studzienkę. Umieść jeden wysterylizowany promieniami UV filtr o pojemności 0,65 mikrolitra na studzienkę doświadczalną w naczyniu do hodowli komórek szklanych zawierających świeżą wrzącą wodę na dwa trzyminutowe płukania, zanurzając filtry w pojemniku PBS o temperaturze pokojowej na dwie minuty po każdym myciu.Następnie umieść jeden filtr na każdej stalowej siatce na granicy powietrzno-cieczowej każdej studzienki. Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć macicę z embrionalnej myszy w ciąży w 11 dniu i zebrać zarodki z macicy. Za pomocą nożyczek preparacyjnych usuń woreczek żółtkowy, pępowinę i wnętrzności z ciała zarodka.I ostrożnie usuń grzbietowe tkanki nerwowe i otaczające tkanki mięśniowe. Za pomocą kleszczy usuń tkanki z kończyn przednich i tylnych. I oddziel region AGM od ciała zarodka.Następnie umieść każdy AGM na pojedynczym filtrze na granicy faz powietrze-ciecz każdej studzienki. Umieść kultury w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po dwóch do trzech dniach przenieś próbki AGM do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 200 mikrolitrów kolagenazy w celu ich dysocjacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 20 minut z wstrząsaniem co pięć minut.Pod koniec trawienia zatrzymaj reakcje za pomocą 200 mikrolilterów surowicy na eksplant. Przenieść całą zawartość każdej probówki do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim stopniu zawartości, zawierającej od 500 do 600 mikrolitrów pożywki M3434 na studzienkę. Wymieszaj komórki w każdym dołku za pomocą jednomililitrowej strzykawki bez igły.Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Liczba jednostek tworzących kolonie w każdej studzience może być następnie oceniona po siedmiu do 10 dniach hodowli. W przypadku przeszczepu eksplantatu in vivo AGM po dwóch do trzech dniach hodowli AGM, jak właśnie wykazano, należy śmiertelnie napromieniować osiem do 10 tygodniowych samców czarnych myszy C57 z dziewięcioma szarymi promieniami.Cztery do pięciu godzin później zdysocjuj zebrane eksplantaty w 200 mikrolitrach kolagenazy na próbkę, jak pokazano. Obciążenie 0,5 do jednego zarodka równoważnego otrzymanym zawiesinom jednokomórkowym w jednej strzykawce o pojemności jednego mililitra na zwierzę biorcy. Umieść pierwszą napromieniowaną mysz w ograniczniku i przetrzyj ogon bawełnianym wacikiem nasączonym 75% etanolem, aby wspomóc rozszerzenie naczyń krwionośnych żył ogonowych.Wstrzyknąć dożylnie całą zawartość jednej strzykawki do poszerzonej żyły ogonowej. Użyj wacika antyseptycznego, aby zatrzymać krwawienie po wyjęciu igły. Następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce i wstrzyknij następnemu zwierzęciu.11 dni po przeniesieniu adopcyjnym śledziony można utrwalić w roztworze Bouina w celu makroskopowego zliczenia widocznych kolonii śledziony. Kultury AGM uzupełnione fluoksetyną wykazują zwiększoną ekspresję Runx1, genu kluczowego dla rozwoju HSC na poziomie ekspresji mRNA i białka. Fluoksetyna może również znacznie zwiększyć zdolność tworzenia kolonii HSC w AGM, w tym erytroidów tworzących pęknięcia, ziarnistych monocytów tworzących kolonie i granulocytów tworzących kolonie, erytrocytów, makrofagów i megakariocytów.Dalsze przeszczepienie in vivo HSC leczonego fluoksetyną wyizolowanego z eksplantatów AGM powoduje zwiększenie liczby kolonii w śledzionach napromieniowanych dorosłych biorców. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować AGM i przeprowadzić hodowlę eksplantatu AGM w celu identyfikacji krytycznych regulatorów rozwoju HSC w AGM.

application-aorta-gonad-mesonephros-explant-culture-system

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Komórki OP9 mStrawberry umożliwiają pełną ocenę wszystkich potomnych pochodzących z ES z kokultury.

Zmodyfikowany protokół kokultury ES / OP9 zapewnia lepszą charakterystykę potomstwa hematopoetycznego

Opisano trójwymiarowy (3D) system hodowli dla hematopoezy z wykorzystaniem ludzkiej krwi pępowinowej oraz komórek szpiku kostnego z białaczką. Metoda opiera się na zastosowaniu porowatego syntetycznego rusztowania z poliuretanu pokrytego białkami macierzy pozakomórkowej. Rusztowanie to można dostosować do hodowli szerokiego zakresu komórek.

Ex vivo naśladowanie prawidłowej i nieprawidłowej hematopoezy u ludzi

Ten protokół opisuje sekcję zarodkowego anlagenu tarczycy myszy i hodowlę eksplantatów na półporowatych filtrach lub na plastikowych szkiełkach mikroskopowych. System ten idealnie nadaje się do badania zdarzeń morfogenetycznych lub różnicowania zachodzących podczas rozwoju tarczycy zarodków typu dzikiego lub zarodków z nokautem i jest podatny na eksperymenty dotyczące przyrostu i utraty funkcji.

System hodowli ex vivo do badania rozwoju tarczycy

Hodowla pionowych kropelek ex vivo jest alternatywą dla obecnych technik eksperymentalnych in vitro i in vivo. Protokół ten jest łatwy do wykonania i wymaga mniejszych ilości odczynnika, a jednocześnie umożliwia manipulowanie i badanie unaczynienia, morfogenezy i organogenezy płodu.

Wykorzystanie ex vivo pionowych kultur kropelkowych całych narządów płodu do badania procesów rozwojowych podczas organogenezy myszy

Ten protokół opisuje metodę izolowania i hodowli podstaw metanefrycznych z embrionów myszy.

Sekcja i hodowla embrionalnej nerki myszy

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Tutaj prezentujemy metodologię analizy klonalnej prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych podczas rozwoju embrionalnego u myszy. Łączymy sortowanie indeksowe pojedynczych komórek z zarodkowego regionu aorta-gonad-śródnercze z kohodowlą i przeszczepem komórek śródbłonka, aby scharakteryzować właściwości fenotypowe i potencjał wszczepienia pojedynczych prekursorów krwiotwórczych.

Analiza klonalna embrionalnych prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych przy użyciu sortowania indeksu pojedynczej komórki w połączeniu z kohodowlą niszy komórek śródbłonka

Ten artykuł przedstawia zaktualizowane podejście do klasycznego systemu chimery kury przepiórczej do badania formowania się narządów, poprzez połączenie nowatorskich procedur eksperymentalnych in vitro i in ovo.

Dwuetapowe podejście do badania wczesnych i późnych etapów powstawania narządów w modelu ptasim: paradygmat organogenezy grasicy i przytarczyc

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Tutaj opisane są cztery metody generowania organoidów jąder z pierwotnych komórek jąder myszy noworodków, tj. macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) oraz środowiska hodowli 2D i 3D wolne od ECM. Techniki te mają wiele zastosowań badawczych i są szczególnie przydatne do badania rozwoju jąder i fizjologii in vitro.

Pozakomórkowe i pozakomórkowe wolne od macierzy komórkowej wytwarzanie mysich organoidów jąder

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

Poznaj metodę hodowli eksplantatów AGM do badania rozwoju komórek macierzystych krwi. Technika ta umożliwia analizę ekspresji DNA i ocenę zdolności tworzenia kolonii HSC.

Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej

Przeglądaj więcej filmów