Zastosowanie systemu hodowli eksplantatów Aorta-gonad-mesonephros w hematopoezie rozwojowej
3 listopada 2017
Ten protokół opisuje użycie hodowanych Aorta-Gonad-Mesonephros do analiz ekspresji, jednostek tworzących kolonie w hodowli i śledzionie oraz długoterminowej rekonstytucji w celu określenia wpływu czynników regulacyjnych i szlaków sygnałowych na rozwój hematopoetycznych komórek macierzystych. Wykazano, że jest to skuteczny system do badania biologii i funkcji krwiotwórczych komórek macierzystych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykorzystanie hodowli eksplantatów aorta-gonad-mesonephros w celu zbadania krytycznych regulatorów rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii i dziedzinach funkcjonalnych HSC dotyczące sposobu identyfikacji czynników zaangażowanych w regulację rozwoju HSC u ssaków. Główną zaletą tej techniki jest to, że regulatory te można zweryfikować poprzez analizę ekspresji DNA oraz zdolność tworzenia kolonii i zdolność rekonstytucji HSC.
Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ precyzyjne oddzielenie AGM od otaczających tkanek w okolicy tułowia wymaga praktyki. Przed rozpoczęciem procedury należy umieścić siatki ze stali nierdzewnej w indywidualnych dołkach sześciodołkowej płytki zawierającej dwa mililitry świeżo przygotowanej pożywki uzupełnionej fluoksetyną na studzienkę. Umieść jeden wysterylizowany promieniami UV filtr o pojemności 0,65 mikrolitra na studzienkę doświadczalną w naczyniu do hodowli komórek szklanych zawierających świeżą wrzącą wodę na dwa trzyminutowe płukania, zanurzając filtry w pojemniku PBS o temperaturze pokojowej na dwie minuty po każdym myciu.
Następnie umieść jeden filtr na każdej stalowej siatce na granicy powietrzno-cieczowej każdej studzienki. Następnie użyj nożyczek preparacyjnych, aby usunąć macicę z embrionalnej myszy w ciąży w 11 dniu i zebrać zarodki z macicy. Za pomocą nożyczek preparacyjnych usuń woreczek żółtkowy, pępowinę i wnętrzności z ciała zarodka.
I ostrożnie usuń grzbietowe tkanki nerwowe i otaczające tkanki mięśniowe. Za pomocą kleszczy usuń tkanki z kończyn przednich i tylnych. I oddziel region AGM od ciała zarodka.
Następnie umieść każdy AGM na pojedynczym filtrze na granicy faz powietrze-ciecz każdej studzienki. Umieść kultury w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Po dwóch do trzech dniach przenieś próbki AGM do pojedynczych 1,5-mililitrowych probówek wirówkowych zawierających 200 mikrolitrów kolagenazy w celu ich dysocjacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 20 minut z wstrząsaniem co pięć minut.
Pod koniec trawienia zatrzymaj reakcje za pomocą 200 mikrolilterów surowicy na eksplant. Przenieść całą zawartość każdej probówki do indywidualnych dołków 24-dołkowej płytki mocującej o bardzo niskim stopniu zawartości, zawierającej od 500 do 600 mikrolitrów pożywki M3434 na studzienkę. Wymieszaj komórki w każdym dołku za pomocą jednomililitrowej strzykawki bez igły.
Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Liczba jednostek tworzących kolonie w każdej studzience może być następnie oceniona po siedmiu do 10 dniach hodowli. W przypadku przeszczepu eksplantatu in vivo AGM po dwóch do trzech dniach hodowli AGM, jak właśnie wykazano, należy śmiertelnie napromieniować osiem do 10 tygodniowych samców czarnych myszy C57 z dziewięcioma szarymi promieniami.
Cztery do pięciu godzin później zdysocjuj zebrane eksplantaty w 200 mikrolitrach kolagenazy na próbkę, jak pokazano. Obciążenie 0,5 do jednego zarodka równoważnego otrzymanym zawiesinom jednokomórkowym w jednej strzykawce o pojemności jednego mililitra na zwierzę biorcy. Umieść pierwszą napromieniowaną mysz w ograniczniku i przetrzyj ogon bawełnianym wacikiem nasączonym 75% etanolem, aby wspomóc rozszerzenie naczyń krwionośnych żył ogonowych.
Wstrzyknąć dożylnie całą zawartość jednej strzykawki do poszerzonej żyły ogonowej. Użyj wacika antyseptycznego, aby zatrzymać krwawienie po wyjęciu igły. Następnie umieść zwierzę z powrotem w klatce i wstrzyknij następnemu zwierzęciu.
11 dni po przeniesieniu adopcyjnym śledziony można utrwalić w roztworze Bouina w celu makroskopowego zliczenia widocznych kolonii śledziony. Kultury AGM uzupełnione fluoksetyną wykazują zwiększoną ekspresję Runx1, genu kluczowego dla rozwoju HSC na poziomie ekspresji mRNA i białka. Fluoksetyna może również znacznie zwiększyć zdolność tworzenia kolonii HSC w AGM, w tym erytroidów tworzących pęknięcia, ziarnistych monocytów tworzących kolonie i granulocytów tworzących kolonie, erytrocytów, makrofagów i megakariocytów.
Dalsze przeszczepienie in vivo HSC leczonego fluoksetyną wyizolowanego z eksplantatów AGM powoduje zwiększenie liczby kolonii w śledzionach napromieniowanych dorosłych biorców. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować AGM i przeprowadzić hodowlę eksplantatu AGM w celu identyfikacji krytycznych regulatorów rozwoju HSC w AGM.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wykorzystanie hodowlanych komórek obszaru aorty, gonad i metanefronu (AGM) do analiz ekspresji oraz oznaczania jednostek tworzących kolonie w celu badania rozwoju hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC). Jest to skuteczny system do badania czynników regulacyjnych i szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w biologię HSC.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia hematopoetycznych komórek macierzystych
- Techniki hodowli komórkowych
- Czynniki regulacyjne w rozwoju
Wstęp
- Region AGM jest kluczowy dla rozwoju HSC u ssaków.
- Zrozumienie regulacji HSC może prowadzić do postępów w medycynie regeneracyjnej.
- Testy tworzenia kolonii są niezbędne do oceny funkcjonalności HSC.
- Oddzielenie AGM od otaczających tkanek wymaga umiejętności i praktyki.
Cel badania
- Zbadanie kluczowych regulatorów rozwoju HSC.
- Identyfikacja czynników zaangażowanych w regulację HSC.
- Pogłębienie zrozumienia biologii i funkcji HSC.
Zastosowane metody
- Techniki hodowli eksplantów AGM.
- Analiza ekspresji DNA w celu weryfikacji czynników regulacyjnych.
- Testy tworzenia kolonii w celu oceny potencjału HSC.
- Badania długoterminowej rekonstytucji.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych czynników regulacyjnych wpływających na rozwój HSC.
- Weryfikacja czynników poprzez analizę ekspresji DNA.
- Skuteczna demonstracja zdolności do tworzenia kolonii w hodowlanych HSC.
- Wnioski dotyczące szlaków sygnałowych zaangażowanych w biologię HSC.
Wnioski
- System hodowli AGM jest skuteczny w badaniu rozwoju HSC.
- Zrozumienie czynników regulacyjnych może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
- Metoda ta stanowi platformę dla przyszłych badań nad hemopoezą.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
System hodowli eksplantów AGM rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad hematopoietic stem cells (HSC), umożliwiając analizy mechanistyczne bez konieczności stosowania modeli z nokautem linii zarodkowej. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych oraz ograniczanie ryzyka w początkowej fazie odkrywania leków, pozwalając na przeprowadzenie eksperymentów z ratowaniem farmakologicznym lub genetycznym w fizjologicznie istotnej niszy embrionalnej. Zwiększa ono pewność predykcyjną w identyfikacji krytycznych regulatorów rozwoju HSC, co dostarcza istotnych informacji przy podejmowaniu decyzji dotyczących portfolio w obszarach terapeutycznych skoncentrowanych na hematopoezie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez badanie udziału czynników w regulacji HSC za pomocą eksperymentów ratunkowych w liniach KO.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system do weryfikacji zmian w ekspresji DNA oraz wyników funkcjonalnych, takich jak tworzenie kolonii, co zmniejsza zależność od kosztownych modeli in vivo.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie perturbacji molekularnych z funkcjonalnymi wynikami HSC, takimi jak zdolność do rekonstytucji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych wyników wielokomórkowych, w tym kolonii CFU-E, CFU-GM i megakariocytów, w celu oceny wpływu związków na różnicowanie HSC.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje funkcjonalną ocenę HSC poprzez punktację jednostek tworzących kolonie po 7–10 dniach, co umożliwia skalowalność testu dla bibliotek związków.
- Wartość translacyjna: Przygotowuje zwalidowane populacje HSC do dalszych badań nad transplantacją, stanowiąc pomost między etapem odkryć a walidacją przedkliniczną.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność chorobową poprzez utrzymanie zarodkowej niszy krwiotwórczej, co umożliwia badanie mechanizmów rozwoju ssaczych HSC.
- Wartość operacyjna: Wspiera ciągłość procesu od fazy odkryć do prac przedklinicznych poprzez generowanie przeszczepialnych HSC o wykazanym potencjale do rekonstytucji u napromienionych biorców.
- Minimalizacja ryzyka: Umożliwia funkcjonalną walidację celów przed kosztownymi badaniami in vivo, co zwiększa pewność decyzji o kontynuacji lub przerwaniu projektu (go/no-go).
Integracja potoku i przepływu pracy
Kultura eksplantów AGM wpisuje się w kontinuum odkryć, od identyfikacji celu, poprzez optymalizację związku wiodącego, aż po walidację przedkliniczną, w szczególności w programach dotyczących hematopoezy i medycyny regeneracyjnej.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków sygnalizacyjnych i regulatorów transkrypcyjnych wpływających na powstawanie i ekspansję HSC.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników w postaci kolonii opartych na fluorescencji lub mikroskopii, co wspiera analizę zależności dawka-odpowiedź i potwierdzenie trafień.
- Analityka: Umożliwia wieloparametryczną ocenę poprzez ekspresję mRNA/białek (np. Runx1), morfologię kolonii oraz jednostki repopulacji in vivo.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z ciągłością przedkliniczną poprzez wykazaną długoterminową rekonstytucję w konkurencyjnych modelach transplantacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako platforma do iteracyjnej walidacji celów w wielu projektach w obszarach terapeutycznych dotyczących komórek macierzystych i schorzeń krwi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez powiązanie interwencji molekularnych z funkcjonalnymi fenotypami HSC w systemie odwzorowującym prawidłowy rozwój.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom izolacji eksplantów, hodowli i dysocjacji, co redukuje zmienność w testach funkcjonalnych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne ograniczanie ryzyka związanego z celami HSC, co minimalizuje niepowodzenia na późnych etapach wynikające z braku wglądu w mechanizmy działania.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko, dostarczając danych funkcjonalnych na temat zdolności HSC do samoodnawiania i różnicowania w celu rankingowania celów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w dyssekcji embrionów i technikach mikrochirurgicznych w celu wyizolowania regionu AGM bez zanieczyszczenia przyległymi tkankami.
- Zależność od sterylnej infrastruktury do hodowli komórkowych, w tym inkubatorów CO2, płytek o niskim stopniu przylegania oraz sterylnej filtracji mediów i odczynników.
- Konieczność standaryzacji między zespołami w zakresie rozmieszczania eksplantatów, czasu trawienia kolagenazą oraz kryteriów oceny kolonii w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Adaptacja do modeli niemyszowych może być ograniczona przez gatunkowo specyficzny czas rozwoju embrionów i dostępność tkanek, co wymaga walidacji w każdym systemie.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wąskie okno embrionalne (E10.5–E11.5 u myszy) dla izolacji AGM, co wpływa na wydajność i harmonogram prac w kampaniach badawczych.
