Name: Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Odkryj strukturę mitochondrialną w mięśniu lotu Drosophila za pomocą tomografii elektronowej o przekroju szeregowym. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę trójwymiarowej ultrastruktury komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania zostały przeprowadzone w rdzeniu EM w Instytucie Biologii Komórkowej i Organizmów oraz w rdzeniu cryo-EM Academia Sinica, Tajpej, Tajwan. Prace były wspierane przez Academia Sinica i MOST.

1. Sekcja tkanek Drosophila za pomocą mikrotomu z wibrującym ostrzem
<ol>
	<li> Znieczul Drosophila na lodzie i zanurz każdą pojedynczą muchę w 1 ml 4% niskotopliwej agarozy w buforze fosforanowym. Pozwól agarozie zastygnąć na lodzie. Zazwyczaj przetwarzano 4 - 6 much.</li>
	<li>Za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój żel agarozowy zatopiony w Drosophila na plastry o grubości 100 μm i zanurz w roztworze utrwalającym zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym. 
	UWAGA: Preferowane jest cięcie wibratomem, ponieważ architektura tkanek pozostaje bardziej nienaruszona w porównaniu z innymi metodami. Alternatywnie, pęseta preparcyjna może być użyta do rozwarstwienia IFM do roztworu utrwalającego zawierającego 2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze fosforanowym.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek EM metodą wysokociśnieniowego zamrażania i podstawiania przez zamrażanie (HPF/FS)
<ol>
	<li>Umyj skrawki tkanek w 3 kroplach (~150 μL) buforu fosforanowego, a następnie w 2 kroplach (~100 μL) buforu fosforanowego z 20% BSA. Następnie umieść skrawki w złotych nośnikach dla HPF wypełnionych buforem i 20% BSA.</li>
	<li>Załaduj próbkę zawierającą nośniki do zamrażarki wysokociśnieniowej zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Po zamrożeniu uwolnić nośniki z uchwytu pod ciekłym azotem i przenieść do urządzenia do zamrażania i substytucji schłodzonego do temperatury -140 °C.</li>
	<li>Wykonaj protokół zamrażania-substytucji, jak pokazano w Tabeli 1, z koktajlem FS zawierającym 2% aldehydu glutarowego, 2% tetratlenku osmu i 0,1% octanu uranylu w acetonie.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij próbki z nośników za pomocą igły i zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej. Polimeryzować żywicę w temperaturze 65 °C przez 16 godzin. 
	UWAGA: Protokoły FS powinny zostać zmodyfikowane w celu przygotowania innych rodzajów próbek. HPF/FS jest preferowany w celu zachowania ultrastruktury i zminimalizowania utraty zawartości komórkowej.
	<ol>
		<li>Alternatywnie zastosuj protokół utrwalania chemicznego. Utrwalić próbki 2,5% aldehydem glutarowym przez noc, przemyć, a następnie utrwalić 1% tetratlenkiem osmu przez 2 godziny. Przemyć i odwodnić rosnącym stężeniem etanolu, a następnie infiltrować i zatapiać próbki w żywicy Spurra przed polimeryzacją w temperaturze 65 °C przez 16 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przygotowanie seryjnych przekrojów próbek do tomografii elektronowej
<ol>
	<li>Przytnij bloki próbki, aby odsłonić żądaną powierzchnię bloku zawierającą tkankę.</li>
	<li>Cząstki złota (o średnicy 10 nm) należy wstępnie traktować 1% powierzchnią ciała przez 30 minut. Przemyć i zawiesić cząsteczki złota w buforze PBS. Nakładaj cząsteczki złota na miedziane siatki szczelinowe pokryte folią węglową, aby stworzyć znaczniki odniesienia.</li>
	<li>Sprawdź w TEM, czy w polu widzenia akwizycji tomografii znajduje się wystarczająca ilość markerów odniesienia (co najmniej 5 - 10 markerów).</li>
	<li>Cięcie odcinków szeregowych o grubości 200 - 250 nm za pomocą ultramikrotomu.</li>
	<li>Zbieraj sekcje szeregowe na siatkach szczelin za pomocą idealnej pętli dla cienkich sekcji.</li>
	<li>Zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut.</li>
	<li>Nałóż drugą warstwę fiducialnych cząstek złota na wierzch sekcji.</li>
</ol>
4. Zbierz tomografię elektronową z podwójnym pochyleniem
<ol>
	<li>Załadować siatkę na dwuosiowy uchwyt tomograficzny i włożyć do transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego pod napięciem 200 kV.</li>
	<li>Ustaw mikroskop w ogniskowej eucentrycznej.</li>
	<li>Skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego zbierania danych. Dostosuj i wyrównaj wiązkę elektronów przy ustawieniu obrazowania wieloskalowego. Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi10 (Rysunek 2).</li>
	<li>Uzyskuj ciemne i jasne referencje z kamery w pustym obszarze bez filmu węglowego przy ustawieniu kolekcji tomografii.</li>
	<li>Zbierz atlas siatki w małym powiększeniu. Wybierz mitochondria na odcinkach szeregowych jako cele do pobrania tomografii.</li>
	<li>Uzyskaj serię pochylenia od -60° do +60° z krokami co 2° na osi-A dla każdego celu. 
	UWAGA: Kąty nachylenia będą ograniczone mechanicznie przez konstrukcję uchwytu na próbki. Uchwyt zablokuje belkę pod dużymi kątami nachylenia.</li>
	<li>Aby zebrać drugą serię przechyłu, obróć uchwyt próbki o 90°. Zdobądź nowy atlas. Wybierz odpowiednie pozycje i uzyskaj serię pochylenia na osi-B dla każdego celu. 
	UWAGA: Inne pakiety oprogramowania, takie jak SerialEM i Xplore3D, są dostępne do automatycznego zbierania danych.</li>
</ol>
5. Rekonstrukcja tomogramów 3D i podobjętości segmentów za pomocą oprogramowania
<ol>
	<li>Rekonstrukcja tomogramów obrazów pochylenia dwuosiowego za pomocą oprogramowania IMOD11.
	<ol>
		<li>Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi.</li>
		<li>Wyrównaj poszczególne serie pochylenia według pozycji złotych znaczników odniesienia. Rekonstrukcja tomogramów za pomocą metody projekcji wstecznej lub metody techniki symultanicznej rekonstrukcji iteracyjnej (SIRT) odpowiednio dla osi A i osi B (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Połącz tomogramy osi-A i osi-B, aby wygenerować tomogram o podwójnym przechyleniu ze zmniejszonym brakującym artefaktem klina.</li>
		<li>Połącz ze sobą tomogramy o podwójnym pochyleniu odcinków szeregowych, aby uzyskać rekonstrukcje obejmujące całą objętość mitochondrium. Modelowanie przerw między sekcjami szeregowymi za pomocą programu IMOD.</li>
		<li>Przytnij połączone tomogramy i pojemnik do żądanego rozmiaru w celu segmentacji objętości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj połączone tomogramy seryjne za pomocą oprogramowania 3D.
	<ol>
		<li>Szczegółowe informacje na temat obsługi można znaleźć w instrukcji obsługi.</li>
		<li>Przefiltruj tomogramy za pomocą filtra Gaussa (lub innej pożądanej metody), aby poprawić kontrast cech i zmniejszyć gęstość tła.</li>
		<li>Segmentacja ultrastruktury mitochondriów ręcznie lub automatycznie.</li>
		<li>Wyświetlanie modeli segmentacji w celu umożliwienia inspekcji w 3D.</li>
		<li>Generuj filmy za pomocą narzędzi dostępnych w 3D.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dahl, R., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+the+preservation+of+biological+structure%3A+theory+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice.</a> J Electron Microsc Tech. 13 (3), 165-174 (1989).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Rigort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromachining+tools+and+correlative+approaches+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micromachining tools and correlative approaches for cellular cryo-electron tomography.</a> J Struct Biol. 172 (2), 169-179 (2010).</li>
<li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).</li>
<li>Lucic, V., Forster, F., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+studies+by+electron+tomography%3A+from+cells+to+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Structural studies by electron tomography: from cells to molecules.</a> Annu Rev Biochem. 74, 833-865 (2005).</li>
<li>Soto, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+section+electron+tomography%3A+a+method+for+three-dimensional+reconstruction+of+large+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Serial section electron tomography: a method for three-dimensional reconstruction of large structures.</a> Neuroimage. 1 (3), 230-243 (1994).</li>
<li>Jiang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+tomographic+analysis+reveals+ultrastructural+features+of+mitochondrial+cristae+architecture+which+reflect+energetic+state+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22SciRep%22%5BJournal%5D)">Electron tomographic analysis reveals ultrastructural features of mitochondrial cristae architecture which reflect energetic state and aging.</a> SciRep. 7, 45474(2017).</li>
<li>Cogliati, S., Enriquez, J. A., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Cristae%3A+Where+Beauty+Meets+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22TrendsBiochemSci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Cristae: Where Beauty Meets Functionality.</a> TrendsBiochemSci. 41 (3), 261-273 (2016).</li>
<li>Friedman, J. R., Nunnari, J. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/nature/journal/v505/n7483/full/nature12985.html">Mitochondrial form and function.</a> Nature. 505 (7483), 335-343 (2014).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+tilt-series+acquisition+with+Leginon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential tilt-series acquisition with Leginon.</a> J Struct Biol. 167 (1), 11-18 (2009).</li>
<li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> J Struct Biol. 197 (2), 102-113 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym protokole opisujemy zoptymalizowany przepływ pracy w celu zastosowania tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do badania ultrastruktury mitochondrialnej 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila . Zachowanie ultrastruktury w próbce jest podstawowym wyzwaniem technicznym dla tego typu analiz. Aby jak najlepiej zachować ultrastrukturę, uwzględniono dwa etapy metodologiczne. W pierwszej kolejności pobrano próbki tkanek poprzez sekcje za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami, aby w jak największym stopniu zachować architekturę tkanki. Po drugie, zoptymalizowano protokół HPF/FS w celu zachowania ultrastruktury organelli podczas przygotowywania osadzonych bloków próbek. Próbki zamrożono pod wysokim ciśnieniem, co obniża temperaturę zamarzania wody i ogranicza tworzenie się kryształków lodu, które uszkadzają ultrastrukturę1. Próbki o grubości zaledwie 0,1 mm mogą być natychmiast zeszklone, a następnie poddane podstawieniu przez zamrażanie w celu wygenerowania bloków próbek do analizy EM. Zauważono lepsze zachowanie ultrastruktury przez HPF/FS w porównaniu z metodami wiązania chemicznego. Korzystając z tej serii etapów przygotowania próbki, znacznie poprawiono zachowanie podwójnych błon mitochondrialnych i błon grzebienia.
Uzyskanie seryjnych przekrojów próbki jest najtrudniejszym etapem metody. Ponieważ wiązka elektronów ma ograniczoną zdolność penetracji, grubość przekroju jest ograniczona do 250 nm lub 500 nm przy użyciu TEM działającego odpowiednio przy napięciu 200 kV lub 300 kV. Ponieważ grubość mitochondrium może być większa niż 2 μm, do uzyskania pełnych rekonstrukcji objętościowych wymagane są sekcje szeregowe. Jednak odzyskanie wystarczającej liczby odcinków seryjnych, aby objąć całe organelle, jest wyzwaniem technicznym. Przycięcie powierzchni bloku tak, aby była jak najbardziej płaska między podstawami trapezu, może pozwolić siatce szczelinowej pomieścić więcej sekcji, a tym samym pokryć większe objętości. Dodatkowo, użycie idealnej pętli dla cienkich odcinków zwiększa wskaźnik sukcesu przenoszenia sekcji szeregowych do siatki.
Tomografia elektronowa o przekroju szeregowym może być wykonana za pomocą standardowego sprzętu rdzeniowego EM. Metoda ta ma jednak pewne nieuniknione ograniczenia, które wynikają z ograniczeń technicznych. Jednym z nich jest to, że materiał jest nieuchronnie tracony między sekcjami seryjnymi, pozostawiając luki w połączonej rekonstrukcji. Drugi to brakujący artefakt klina, który powstaje z powodu ograniczonych kątów nachylenia, które są osiągalne. To ograniczenie występuje, ponieważ uchwytu próbki nie można obrócić w pełnym obrocie bez zablokowania wiązki elektronów. Pomimo tych ograniczeń, tomografia elektronowa o przekroju szeregowym zapewnia wystarczającą rozdzielczość, aby ujawnić ultrastrukturę komórek i organelli w 3D.
W przypadku obrazowania na mniejszą skalę, krioelektronowa tomografia jest nową technologią, którą można wykorzystać do uzyskania struktury kompleksów i zespołów makromolekularnych in situ w rozdzielczości nm lub sub-angstrem w połączeniu z rekonstrukcją subtomograficzną3. W tym zastosowaniu komórki są rozrzedzane przez cięcie lub mielenie wiązką jonów w ciekłym azocie. Tomogramy są zbierane w warunkach kriogenicznych, w których struktury molekularne są zachowane blisko stanu rodzimego bez chemicznego utrwalania, odwadniania lub osadzania. Z drugiej strony, do analizy dużych objętości tkanek kosztem rozdzielczości, seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa z blokową powierzchnią jest atrakcyjną metodą, mimo że wymaga specjalnego instrumentu4.

Mikroskopia elektronowa jest cennym narzędziem do badania kontekstu strukturalnego zespołów subkomórkowych i organelli, które wykonują procesy komórkowe. Opracowano metody zachowania ultrastruktury tkanek lub komórek poprzez chemiczne wiązanie aldehydami lub zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF), a następnie podstawienie przez zamrożenie (FS)1,2. Osadzone bloki próbki można następnie podzielić, wybarwić i obserwować za pomocą transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM). Próbka HPF może być również przetwarzana w warunkach kriogenicznych, takich jak kriosekcja lub mielenie skupionej wiązki jonów (FIB), i obserwowana przez cryo-EM3,4.
Chociaż cienki przekrój EM dostarcza pouczających spostrzeżeń morfologicznych, wynikowe obrazy 2D mogą ujawnić tylko ultrastrukturę określonego przekroju. Sposób, w jaki ultrastruktura jest zorganizowana w objętości 3D, pozostaje niejasny. W celu wizualizacji ultrastruktury komórkowej w trzech wymiarach opracowano metodę tomografii elektronowej, w której uzyskano serię obrazów nachylenia i ponownie wyświetlono je w celu wygenerowania rekonstrukcji tomograficznej5 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Serię podwójnego przechyłu można zebrać, obracając próbkę o 90° i uzyskując drugą serię przechyłu. Zminimalizuje to artefakty brakującego klina, które wynikają z ograniczonych kątów próbkowania i poprawi rozdzielczość tomogramu.
Tutaj opisujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do badania ultrastruktury mitochondriów mięśni lotu pośredniego (IFM)6,7,8,9. W celu uzyskania rekonstrukcji 3D obejmujących całe mitochondria (o grubości około 2,5 μm) uzyskano seryjne odcinki z bloków tkankowych Drosophila IFM. Tomogramy każdej sekcji zostały zebrane indywidualnie za pomocą oprogramowania do automatycznego zbierania danych. Wykonano rekonstrukcje tomograficzne i połączono tomogramy seryjne z pakietem IMOD w celu uzyskania zrekonstruowanej objętości całego mitochondrium. Połączone tomogramy zostały przeanalizowane przez oprogramowanie 3D. Gęstości grzebień mitochondrialnych zostały podzielone na segmenty w celu wygenerowania modelu segmentacji, który ujawnił organizację w trzech wymiarach.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom z wibracyjnym ostrzem</td><td>Leica</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka wysokociśnieniowa</td> do cięcia tkanek <td>Leica</td><td>EM HPM100</td><td>Urządzenie do przygotowywania próbek</td></tr> i <tr><td>zamiany</td>, <td>Leica</td><td>EM AFS2</td><td>Przygotowanie próbek</td></tr><tr><td>ultramikrotom</td><td>Leica</td><td>EM UC7</td><td>Ultracienki</td></tr><tr><td>uchwyt do tomografii dwuosiowej</td><td>Fischione</td><td>Kolekcja tomografii</td> <td>model 2040</td></tr><tr><td>transmisyjny mikroskop elektronowy</td><td>FEI</td><td>Tecnai F20</td><td>kolekcja tomografii</td></tr><tr><td>CCD</td><td>Gatan</td><td>UltraScan 1000</td><td>kolekcja tomografii</td></tr><tr><td></td><td></td><td>Leginon</td><td>NRAMM/AMI</td></tr><tr>Laboratorium<td>IMOD</td> Boulder do rekonstrukcji tomografii <td>3D electron Microscan of Cells</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Analiza tomografii</td> <td>Avizo 3D</td><td>FEI</td><td></td></tr></tbody></table>

ultrastruktura mitochondrialna 3d mięśnia lotu pośredniego drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

3D Mitochondrial Ultrastructure of Drosophila Indirect Flight Muscle Revealed by Serial-section Electron Tomography

Mitochondria to komórkowe elektrownie, które produkują ATP, lipidy i metabolity, a także regulują homeostazę wapnia i śmierć komórki. Unikalna, bogata w grzebienia ultrastruktura podwójnej błony tej organelli jest elegancko ułożona, aby pełnić wiele funkcji poprzez partycjonowanie biomolekuł. Ultrastruktura mitochondriów jest ściśle związana z różnymi funkcjami; Jednak drobne szczegóły tych relacji struktura-funkcja dopiero zaczynają być opisywane. Tutaj pokazujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju seryjnym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila. Tomografia elektronowa o przekroju szeregowym może być przystosowana do badania dowolnej struktury komórkowej w trzech wymiarach.

Zastosowaliśmy seryjną tomografię elektronową w celu analizy cech strukturalnych grzebieni mitochondrialnych, które odzwierciedlają stan energetyczny i starzenie się organellum. Wykazaliśmy, że mitochondria mięśni nielotnych (Drosophila IFM) tworzą zintegrowaną trójwymiarową sieć grzebieni i macierzy (Rysunek 4)7. Ponadto u much mutantów z defektem replikacji mitochondrialnego DNA i przyspieszonym fenotypem starzenia nagromadziły się mitochondria zawierające fragmenty cebulowatego, wirującego rdzenia (Rysunek 5)7.
<img alt="Schemat rekonstrukcji tomograficznej; nachylenia wiązki, projekcje, proces projekcji wstecznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Ilustracja rekonstrukcji tomografii elektronowej z serii obrazów pod różnymi kątami nachylenia. W eksperymencie wiązka elektronów przechodzi przez obiekt 3D, podczas gdy obiekt jest pochylany pod różnymi kątami. Dla każdego stopnia pochylenia generowana jest projekcja 2D, która zostaje zarejestrowana przez kamerę. Następnie z projekcji 2D wykonuje się projekcję wsteczną w celu zrekonstruowania obiektu 3D w oparciu o twierdzenie o przekroju środkowym. Na ilustracji ten sam proces przedstawiono dla oryginalnego obrazu 2D, który jest projektowany na jeden wymiar pod różnymi kątami pochylenia. Projekcje 1D są następnie wykorzystywane do rekonstrukcji obrazu 2D. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Mikroskopia elektronowa, obrazy tomograficzne, analiza struktury preparatu, szczegóły powiększenia, dane o defokusie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2: Automatyczny zbieranie danych. Wyświetlacz przeglądarki obrazów prezentujący oprogramowanie z atlasem siatki slotów zawierającej sekcje seryjne, wieloskalowe celowanie w mitochondria oraz pozyskane obrazy przechylone. Pasek skali = 500 µm (lewy górny panel), 100 µm (lewy dolny panel), 1 µm (prawy panel). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Seria obrazów mikroskopowych tkanek mięśniowych ilustrująca zmiany strukturalne w czasie, schemat 8-panelowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Tomografia elektronowa seryjnych przekrojów pojedynczej mitochondrium w Muszka owocówka pośredni mięsień latający. (A) mikrografie 2D oraz (B) Tomogramy 3D z sekcji seryjnych obejmujące całą objętość mitochondrium. (CPołączone tomogramy z seryjnych przekrojów zostały rzutowane w celu utworzenia przekroju podłużnego, w którym oś z jest przedstawiona pionowo. Należy zauważyć, że sekcjonowanie tkanki doprowadziło do utraty materiału, co spowodowało powstanie przerw między połączonymi tomogramami. Pasek skali = 50 nm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig3large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Konfiguracje przełączników w strukturach spiralnych; analiza z wykorzystaniem mikroskopii i modelowania; zmiany kierunkowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Zintegrowana sieć grzebieni i macierzy wewnątrzmitochondrialnej przedstawiona w 3D. (APrzekroje tomograficznych rekonstrukcji elektronowych mitochondriów, pokazujące przejścia między błonami lamelarnymi wzdłuż osi z.B) Ilustracje zaobserwowanych wzorców przełączania grzebieni spiral prawoskrętnych i/lub lewoskrętnych. (C) Segmentacja tomograficzna ilustrująca spiralę lewoskrętną w 3D (DWzorce przełączania grzebieni zostały przeanalizowane i odwzorowane kolorystycznie na modelu segmentacji (E, F). Przekrój tomograficzny ukazujący lateralną konfluencję macierzy (ciemne zagęszczenia, zaznaczone na czerwono) w obrębie błon grzebieniastych (białe zagęszczenia). (G) Model segmentacji tomogramu w (E) przedstawiające konfluencję macierzy bocznej (na czerwono) oraz reprezentatywne grzebienie (na szaro). Pasek skali = 50 nm (A), 20 nm (C) oraz 300 nm (D, E, F, G). Rysunek jest przedrukiem z pracy Jiang i in.7 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wizualizacja struktury spiralnej; porównanie topografii i intensywności kolorów w analizie mikroskopowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56567/56567fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rycina 5: Mitochondria z cebulowymi, spiralnymi rdzeniami nagromadzone w muchach z defektami replikacji mitochondrialnego DNA podczas starzenia. Reprezentatywne przekroje tomograficzne i odpowiadająca im segmentacja (panele po prawej stronie), przedstawiające widok w przekroju poprzecznym (góra) i widok w przekroju podłużnym (dół) wirującego rdzenia. Segmentacja objętościowa została zaznaczona za pomocą dowolnego renderowania kolorów, aby wyróżnić wirujący rdzeń. Pasek skali: 20 nm. Rysunek jest przedrukiem z pracy Jiang i in.7 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56567/56567fig5large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Krok</td>
			<td colspan="2">Temp.</td>
			<td colspan="2">Czas</td>
			<td colspan="2">Roztwór</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td colspan="2">-140 °C do -9 0°C</td>
			<td colspan="2">30 min</td>
			<td colspan="2">Ciekły azot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td colspan="2">-90 °C</td>
			<td colspan="2">96 h</td>
			<td colspan="2">koktajl FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td colspan="2">-90 °C do -60 °C</td>
			<td colspan="2">6 godz. (5 °C/godz)</td>
			<td colspan="2">koktajl FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">-60 °C</td>
			<td colspan="2">12 godz.</td>
			<td colspan="2">koktajl FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td colspan="2">-60 °C do -25 °C</td>
			<td colspan="2">7 godz. (5 °C/godz)</td>
			<td colspan="2">koktajl FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td colspan="2">-25 °C</td>
			<td colspan="2">12 godz.</td>
			<td colspan="2">koktajl FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td colspan="2">-25 °C Nie podano tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o wprowadzenie treści, którą należy przetłumaczyć na język polski. 0 °C</td>
			<td colspan="2">5 godz. (5 °C/godz)</td>
			<td colspan="2">koktajl FS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td colspan="2">0 °C</td>
			<td colspan="2">1 godz. x 3 razy</td>
			<td colspan="2">Aceton</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td colspan="2">Temperatura pokojowa</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td colspan="2">Infiltracja żywicą</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Protokół substytucji mrożonej.

W tym protokole demonstrujemy zastosowanie tomografii elektronowej o przekroju szeregowym do wyjaśnienia struktury mitochondrialnej w mięśniu lotu pośredniego Drosophila.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Mitochondria are cellular powerhouses that produce ATP, lipids, and metabolites, as well as regulate calcium homeostasis and cell death. The unique ...

Ogólnym celem tego filmu jest określenie zastosowania tomografii elektronowej przekroju szeregowego do badania ultrastruktury mitochondrialnej mięśnia lotu pośredniego Drosophila. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii struktury komórki, takie jak struktura i funkcjonalny związek z mitochondriami. Główną zaletą tej techniki jest to, że ultrastruktura komórkowa ujawnia się w trzech wymiarach.Aby rozpocząć eksperyment, znieczul pięć próbek Drosophola na lodzie i zanurz każdą muchę w jednym mililitrze 4% niskotopliwej agarozy w buforze fosforanowym. Pozwól agarozie zestalić się na lodzie. Następnie za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój Drosopholę zatopioną w żelu agarozowym na plastry o grubości 100 mikrometrów.Zanurz plastry w roztworze utrwalającym zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego w jednomolowym buforze fosforanowym w punkcie zerowym. Umyj skrawki tkanek w trzech kroplach buforu fosforanowego, a następnie przemyj je dwiema kroplami buforu fosforanowego o zawartości 20% BSA. Umieść sekcje w złotych nośnikach do zamrażania pod wysokim ciśnieniem lub HPF, wypełnionych buforem i 20% BSA.Następnie załaduj próbkę zawierającą nośniki do zamrażarki wysokociśnieniowej zgodnie z instrukcją obsługi. Po zamrożeniu uwolnić nośniki z uchwytu pod ciekłym azotem i przenieść je do urządzenia do swobodnego podstawiania schłodzonego do minus 140 stopni Celsjusza. Wykonaj protokół bezpłatnego substytucji koktajlem FS zawierającym 2% aldehydu glutarowego, 2% tetratlenku osmu, 0,1% octanu uranylu w acetonie.Zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej. Następnie polimeryzuj żywicę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Przytnij bloki próbki, aby odsłonić żądaną powierzchnię bloku zawierającą tkankę.Następnie poddaj 10-nanometrowym cząstkom złota 1% BSA przez 30 minut. Umyj i zawiesij cząsteczki złota w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS. Nałóż cząsteczki złota na miedziane siatki ślizgowe pokryte folią węglową, aby utworzyć znaczniki odniesienia.Cięcie odcinków seryjnych o grubości od 200 do 250 nanometrów za pomocą ultramikrotomu. Następnie zbierz sekcje szeregowe na siatkach szczelinowych, używając idealnej pętli dla cienkich sekcji. Zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut.Nałóż drugą warstwę fiducialnych cząstek złota na wierzch sekcji. Załaduj siatkę na dwuosiowy uchwyt tomograficzny i włóż do transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego przy napięciu 200 kilowoltów. Ustaw mikroskop w ogniskowej eucentrycznej.Skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych, dostosuj i wyrównaj wiązkę elektronów przy ustawieniu obrazowania wieloskalowego, uzyskaj ciemne i jasne odniesienia kamery w pustym obszarze bez filmu węglowego przy ustawieniu zbierania tomografii. Następnie zbierz atlas siatki w małym powiększeniu. Wybierz mitochondria na odcinkach szeregowych jako cele do zbierania tomografii, uzyskaj serię nachylenia od ujemnych 60 stopni do dodatnich 60 stopni z przyrostami co dwa stopnie na osi A dla każdego celu.Na koniec zbierz drugą serię przechyłu. Obróć uchwyt próbki o 90 stopni. Zdobądź nowy atlas.Wybierz odpowiednie pozycje i uzyskaj serię pochylenia na osi B dla każdego celu. Za pomocą tej metody wygenerowano mikrofotografie 2D i tomografy 3D z odcinków seryjnych obejmujących całą objętość mitochondrium. Połączone tomogramy o przekroju szeregowym są rzutowane w celu utworzenia przekroju podłużnego z osią z pokazaną pionowo.Tomografia elektronowa o przekroju szeregowym została zastosowana do analizy cech strukturalnych grzebienia mitochondrialnego, które odzwierciedlają ich stan energetyczny i starzenie się. Wycinki mitochondrialnych rekonstrukcji tomograficznych elektronów ujawniają przejścia między błonami blaszkowymi w osi z. Segmentacja tomograficzna ilustrująca lewoskrętną spiralę w 3D.Przeanalizowano wzorce przełączania Cristae i odwzorowano kolory na modelu segmentacji. Wycinek tomograficzny pokazuje zbieg macierzy bocznej przez błony grzebieniowe. Wygenerowano model segmentacji tomogramu w celu pokazania zbiegu macierzy bocznej i reprezentatywnych cristae.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać tomografię elektronową o przekroju szeregowym, którą można dostosować do badania dowolnej struktury komórkowej w trzech wymiarach.

3d-mitochondrial-ultrastructure-drosophila-indirect-flight-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja mechanizmów leżących u podstaw uszkodzeń mięśni jest kluczowa. Przedstawiamy tutaj technikę histologiczną przygotowywania skrawków z laniny oraz skrawków mrożonych mięśni klatki piersiowej Drosophila. Pozwala to na analizę morfologii mięśni oraz lokalizację białek i innych składników komórek mięśniowych.

Przekroje woskowe i mrożone mięśni dorosłych osobników Drosophila

Przedstawiamy protokół zbierania i przetwarzania krio-tomogramów elektronowych całych mitochondriów. Technika ta zapewnia szczegółowy wgląd w strukturę, funkcję i organizację dużych kompleksów białek błonowych w natywnych błonach biologicznych.

Wizualizacja dimerów syntazy ATP w mitochondriach za pomocą kriotomografii elektronowej

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Przedstawiamy metodę ilościowego określania powierzchni mięśniowej, która jest pośrednią metodą określania masy mięśniowej u dorosłych Drosophila. Demonstrujemy zastosowanie naszej metodologii, analizując pośrednie mięśnie lotu w modelu Drosophila choroby dystrofii miotonicznej.

Optyczne oznaczanie obszaru mięśni w przekroju poprzecznym dorosłych mięśni lotu pośredniego Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokół do badania rozkładu mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego w całych komórkach po modyfikacji genetycznej za pomocą korelacyjnej mikroskopii elektronowej światła i objętości, w tym barwienia peroksydazą askorbinianową 2 i peroksydazy chrzanowej, seryjnego cięcia komórek z i bez genu docelowego w tej samej sekcji oraz seryjnego obrazowania za pomocą mikroskopii elektronowej.

Obrazowanie mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego za pomocą korelacyjnej mikroskopii świetlnej i objętościowej

Przedstawiono protokół, który pozwala na wizualizację nienaruszonego Drosophila melanogaster na dowolnym etapie rozwoju za pomocą tomografii mikrokomputerowej.

Obrazowanie całego zwierzęcia Drosophila melanogaster za pomocą tomografii mikrokomputerowej

Opisujemy przygotowanie wstęg odcinków szeregowych i ich zbieranie na dużym nośniku transferu do użycia jako próbki tomografii matrycowej, wraz z automatycznymi procedurami obrazowania w skaningowym mikroskopie elektronowym. Protokół umożliwia badania przesiewowe, wyszukiwanie i ukierunkowane obrazowanie miejscowych, rzadkich zdarzeń oraz pozyskiwanie dużych ilości danych.

Tomografia matrycowa do ukierunkowanego pozyskiwania informacji objętościowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Ten protokół opisuje, jak zrekonstruować grzebienie mitochondrialne, aby uzyskać obrazowanie 3D z wysoką dokładnością, wysoką rozdzielczością i wysoką przepustowością.

Trójwymiarowa technika wizualizacji ultrastrukturalnych zmian mitochondrialnych w komórkach raka trzustki

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Drosophila to potężny model do zrozumienia podstawowych mechanizmów miogenezy. Ten protokół do sekcji i przygotowania przecięć półklatki piersiowej umożliwia mikroskopową analizę mięśni pośrednich lotów zarówno w stadium poczwarki, jak i dorosłych. Protokół ten umożliwia konfokalne obrazowanie morfologii komórkowej, lokalizacji białek, struktury mięśni oraz wielu innych aspektów miogenezy.

Rozwarstwienie pośrednich mięśni lotu Drosophila melanogaster do podejść mikroskopowych

Odkryj strukturę mitochondrialną w mięśniu lotu Drosophila za pomocą tomografii elektronowej o przekroju szeregowym. Ta metoda umożliwia szczegółową analizę trójwymiarowej ultrastruktury komórkowej.

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym (Wideo) | JoVE Journal

Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Przeglądaj więcej filmów