Ultrastruktura mitochondrialna 3D mięśnia lotu pośredniego Drosophila ujawniona przez tomografię elektronową o przekroju szeregowym

Ogólnym celem tego filmu jest określenie zastosowania tomografii elektronowej przekroju szeregowego do badania ultrastruktury mitochondrialnej mięśnia lotu pośredniego Drosophila. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii struktury komórki, takie jak struktura i funkcjonalny związek z mitochondriami. Główną zaletą tej techniki jest to, że ultrastruktura komórkowa ujawnia się w trzech wymiarach.

Aby rozpocząć eksperyment, znieczul pięć próbek Drosophola na lodzie i zanurz każdą muchę w jednym mililitrze 4% niskotopliwej agarozy w buforze fosforanowym. Pozwól agarozie zestalić się na lodzie. Następnie za pomocą mikrotomu z wibrującymi ostrzami pokrój Drosopholę zatopioną w żelu agarozowym na plastry o grubości 100 mikrometrów.

Zanurz plastry w roztworze utrwalającym zawierającym 2,5% aldehydu glutarowego w jednomolowym buforze fosforanowym w punkcie zerowym. Umyj skrawki tkanek w trzech kroplach buforu fosforanowego, a następnie przemyj je dwiema kroplami buforu fosforanowego o zawartości 20% BSA. Umieść sekcje w złotych nośnikach do zamrażania pod wysokim ciśnieniem lub HPF, wypełnionych buforem i 20% BSA.

Następnie załaduj próbkę zawierającą nośniki do zamrażarki wysokociśnieniowej zgodnie z instrukcją obsługi. Po zamrożeniu uwolnić nośniki z uchwytu pod ciekłym azotem i przenieść je do urządzenia do swobodnego podstawiania schłodzonego do minus 140 stopni Celsjusza. Wykonaj protokół bezpłatnego substytucji koktajlem FS zawierającym 2% aldehydu glutarowego, 2% tetratlenku osmu, 0,1% octanu uranylu w acetonie.

Zanurz próbki w żywicy w temperaturze pokojowej. Następnie polimeryzuj żywicę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 16 godzin. Przytnij bloki próbki, aby odsłonić żądaną powierzchnię bloku zawierającą tkankę.

Następnie poddaj 10-nanometrowym cząstkom złota 1% BSA przez 30 minut. Umyj i zawiesij cząsteczki złota w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS. Nałóż cząsteczki złota na miedziane siatki ślizgowe pokryte folią węglową, aby utworzyć znaczniki odniesienia.

Cięcie odcinków seryjnych o grubości od 200 do 250 nanometrów za pomocą ultramikrotomu. Następnie zbierz sekcje szeregowe na siatkach szczelinowych, używając idealnej pętli dla cienkich sekcji. Zabarwić skrawki cytrynianem ołowiu Reynoldsa przez 10 minut.

Nałóż drugą warstwę fiducialnych cząstek złota na wierzch sekcji. Załaduj siatkę na dwuosiowy uchwyt tomograficzny i włóż do transmisyjnego mikroskopu elektronowego pracującego przy napięciu 200 kilowoltów. Ustaw mikroskop w ogniskowej eucentrycznej.

Skonfiguruj oprogramowanie do automatycznego gromadzenia danych, dostosuj i wyrównaj wiązkę elektronów przy ustawieniu obrazowania wieloskalowego, uzyskaj ciemne i jasne odniesienia kamery w pustym obszarze bez filmu węglowego przy ustawieniu zbierania tomografii. Następnie zbierz atlas siatki w małym powiększeniu. Wybierz mitochondria na odcinkach szeregowych jako cele do zbierania tomografii, uzyskaj serię nachylenia od ujemnych 60 stopni do dodatnich 60 stopni z przyrostami co dwa stopnie na osi A dla każdego celu.

Na koniec zbierz drugą serię przechyłu. Obróć uchwyt próbki o 90 stopni. Zdobądź nowy atlas.

Wybierz odpowiednie pozycje i uzyskaj serię pochylenia na osi B dla każdego celu. Za pomocą tej metody wygenerowano mikrofotografie 2D i tomografy 3D z odcinków seryjnych obejmujących całą objętość mitochondrium. Połączone tomogramy o przekroju szeregowym są rzutowane w celu utworzenia przekroju podłużnego z osią z pokazaną pionowo.

Tomografia elektronowa o przekroju szeregowym została zastosowana do analizy cech strukturalnych grzebienia mitochondrialnego, które odzwierciedlają ich stan energetyczny i starzenie się. Wycinki mitochondrialnych rekonstrukcji tomograficznych elektronów ujawniają przejścia między błonami blaszkowymi w osi z. Segmentacja tomograficzna ilustrująca lewoskrętną spiralę w 3D.

Przeanalizowano wzorce przełączania Cristae i odwzorowano kolory na modelu segmentacji. Wycinek tomograficzny pokazuje zbieg macierzy bocznej przez błony grzebieniowe. Wygenerowano model segmentacji tomogramu w celu pokazania zbiegu macierzy bocznej i reprezentatywnych cristae.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać tomografię elektronową o przekroju szeregowym, którą można dostosować do badania dowolnej struktury komórkowej w trzech wymiarach.