Name: Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Poznaj odwrócony trójwymiarowy test inwazyjny do analizy migracji rzadkich i wrażliwych komórek nowotworowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. Ta metoda umożliwia badanie inwazji i przesiewanie leków hamujących przerzuty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIMHD-G12MD007581) przez RCMI-Center for Environmental Health na Uniwersytecie Stanowym Jackson oraz Departament Obrony USA, Idea Award 11-1-0205.

UWAGA: Ten protokół jest opisany w McArdle et al.11. Oś czasu znajduje się w Rysunek 1.
1. Przygotowanie płytki hodowlanej
<ol>
	<li>Umyć naczynie hodowlane o średnicy 35 mm zawierające studzienkę ze szklanym dnem o średnicy 10 mm w 1 ml 1 M kwasu solnego (HCl) przez 15 minut, aby obniżyć hydrofobowość szklanego dna.</li>
	<li>Przemyć płytkę hodowlaną dwukrotnie 1 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby pozbyć się całego HCl.</li>
	<li>Umyj płytkę hodowlaną dwukrotnie 1 ml 70% etanolu.</li>
	<li>Przepłukać płytkę hodowlaną 1 ml pożywki do hodowli specyficznej dla komórki (tutaj użyj α-MEM uzupełnionego 10% inaktywowanego termicznie FBS i 1% aminokwasów endogennych). 
	nuta: Poddaną działaniu substancji płytkę hodowlaną zawierającą pożywkę hodowlaną można przechowywać w inkubatorze CO2 z nawilżaczem w temperaturze 37 °C do następnego dnia.</li>
	<li>Hoduj komórki (MSCs i kokulturę MCF-7) w poddanej działaniu szklanego dna 35-milimetrowej szalki hodowlanej do 100% zgryzu. Wspólna hodowla 35 000 komórek MSC i 75 000 komórek MCF7 przez 24 godziny.</li>
</ol>
2. Przygotowanie żelu kolagenowego
<ol>
	<li>Końcówki mikropipet używane do pipetowania żelu kolagenowego należy przechowywać w zamrażarce, aby zapobiec polimeryzacji kolagenu w kontakcie. 
	nuta: To jest najważniejszy krok.</li>
	<li>Określ objętość kolagenu I z ogona szczura do użycia na podstawie stężenia zapasu kolagenu. Przygotuj 100 μl żelu kolagenowego do tego testu. 
	nuta: Wysokie stężenie kolagenu z ogona szczura I działa lepiej. Określ objętość 10x Zmodyfikowanego Podłoża Orła firmy Dulbecco, które ma być użyte do odpowiedniego rozcieńczenia kolagenu.</li>
	<li>Połączyć na lodzie kolagen z ogona szczura I (3,8 μg/ml bulionu), 10x Dulbecco's Modified Eagle's Medium i 1x pożywkę do hodowli komórkowych uzupełnioną 2% płodową surowicą bydlęcą i odpowiednim chemoatraktantem do końcowego stężenia kolagenu 2,4 mg/ml.</li>
	<li>Dodać do mieszaniny 4,5% roztworu wodorowęglanu sodu, aby zneutralizować żel kolagenowy. 
	nuta: Objętość dodanego roztworu wodorowęglanu sodu może się różnić w zależności od dokładnego pH innych odczynników. Najlepiej jest przetestować mieszaninę za pomocą pasków pH, aby zapewnić neutralny roztwór, lub użyć wskaźnika pH w pożywce hodowlanej.</li>
	<li>Umieścić 80 μl mieszaniny kolagenu na komórkach w studzience ze szklanym dnem naczynia hodowlanego.</li>
	<li>Pozostawić żel kolagenowy do polimeryzacji przez 30 minut w inkubatorze CO2 z nawilżaczem w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przykryj żel kolagenowy 2 ml pożywki komórkowej ze zredukowaną surowicą (2%) i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 z nawilżaczem przez 24, 48 lub 72 godziny 
	ostrożność: Z płytką należy obchodzić się ostrożnie, aby zapobiec odklejaniu się żelu kolagenowego od szklanego dna.</li>
</ol>
3. Przykład przygotowania żelu kolagenowego przy użyciu wywaru kolagenu z ogona szczura o sile 3,8 μg /ml
<ol>
	<li>Na lodzie połącz 114,5 μl kolagenu z ogona szczura, 16,6 μl 10x DMEM i 33,1 μl pożywki hodowlanej zawierającej chemoatraktant.</li>
	<li>Zneutralizować mieszaninę kolagenu za pomocą 14,0 μl wodorowęglanu sodu.</li>
	<li>Postępuj jak w kroku 2.5.</li>
</ol>
4. Obrazowanie komórek
<ol>
	<li>Delikatnie wyjmij nośnik z naczynia.</li>
	<li>Delikatnie spłucz żel 1 ml PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki 1 ml 4% paraformaldehydu przez 15 minut.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 1 ml PBS.</li>
	<li>Wybarwić komórki roztworem DAPI (100 ng/ml) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopu konfokalnego w różnych miejscach i wykonaj obrazy 400 μm z-stack każdego miejsca w krokach co 16 μm. Zastosowany mikroskop posiada dyskowy zespół skanujący, który umożliwia obrazowanie konfokalne za pomocą światła białego, źródła wzbudzenia łukowego. Użyj obiektywu 20X z przysłoną numeryczną 0,75.</li>
	<li>Odtwórz obrazy .
	<ol>
		<li>Otwórz obrazy dla danego żelu (około 25 obrazów) i utwórz stos obrazów, klikając obraz → układa → obrazy do stosu. Pierwszy obraz odpowiadał dnu żelu (z = 0 μm), drugi obraz odpowiadał pierwszemu krokowi w kierunku z (z = 16 μm), trzeci obraz odpowiadał drugiemu krokowi w kierunku z (z = 32 μm). Oceń każde jądro na każdej głębokości obrazu i wyznacz głębokość, na której jądro było w najostrzejszej ostrości, jako głębokość inwazji dla tej konkretnej komórki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Friedl, P., Brocker, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+cell+locomotion+within+three-dimensional+extracellular+matric%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matric.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 41-64 (2000).</li>
<li>Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+architecture%3A+the+ultimate+regulator+of+breast+epithelial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function.</a> Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Yarrow, J. C., Perlman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+cell+migration+assay+using+scratch+wound+healing%2C+a+comparison+of+image-based+readout+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparison of image-based readout methods.</a> BMC Biotechnol. 4, 21(2004).</li>
<li>Wolf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensation+mechanism+in+tumor+cell+migration%3A+mesenchymal-amoeboid+transition+after+blocking+of+pericellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis.</a> J Cell Biol. 160, 267-277 (2003).</li>
<li>Sahai, E., Marshall, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differing+modes+of+tumour+cell+invasion+have+distinct+requirements+for+Rho%2FROCK+signalling+and+extracellular+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differing modes of tumour cell invasion have distinct requirements for Rho/ROCK signalling and extracellular proteolysis.</a> Nat Cell Biol. 5, 711-719 (2003).</li>
<li>Kam, Y., Guess, C., Estrada, L., Weidow, B., Quaranta, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+circular+invasion+assay+mimics+in+vivo+invasive+behavior+of+cancer+cell+lines+and+distinguishes+single-cell+motility+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">A novel circular invasion assay mimics in vivo invasive behavior of cancer cell lines and distinguishes single-cell motility in vitro.</a> BMC Cancer. 8, 198(2008).</li>
<li>Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+analysis+of+current+in+vitro+and+in+vivo+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays.</a> Int J Exp Pathol. 90, 195-221 (2009).</li>
<li>Poujade, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+migration+of+an+epithelial+monolayer+in+response+to+a+model+wound%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 15988-15993 (2007).</li>
<li>Noubissi, F. K., Harkness, T., Alexander, C. M., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis-induced+cancer+cell+fusion%3A+a+mechanism+of+breast+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Apoptosis-induced cancer cell fusion: a mechanism of breast cancer metastasis.</a> FASEB J. 29, 4036-4045 (2015).</li>
<li>McArdle, T. J., Ogle, B. M., Noubissi, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+In+Vitro+Inverted+Vertical+Invasion+Assay+to+Avoid+Manipulation+of+Rare+or+Sensitive+Cell+Types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">An In Vitro Inverted Vertical Invasion Assay to Avoid Manipulation of Rare or Sensitive Cell Types.</a> J Cancer. 7, 2333-2340 (2016).</li>
<li>Noubissi, F. K., Ogle, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cell+Fusion%3A+Mechanisms+Slowly+Unravel%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer Cell Fusion: Mechanisms Slowly Unravel.</a> Int J Mol Sci. 17, (2016).</li>
<li>Meyvantsson, I., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+models+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell culture models in microfluidic systems.</a> Annu Rev Anal Chem. 1, 423-449 (2008).</li>
<li>Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+migration+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell migration in three dimensions.</a> Methods In Enzymol. 406, 625-643 (2006).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat Materials. 13, 645-652 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie istnieje żaden konkurencyjny interes.

Tutaj opisujemy prosty test odwróconej inwazji pionowej, który jest wygodny dla różnych typów komórek, w tym komórek rzadkich i / lub zależnych od ich mikrośrodowiska. W tym teście inwazji 3D komórki pozostają w swoim pierwotnym mikrośrodowisku i są pokryte żelem kolagenowym zawierającym chemoatraktant. Komórki następnie migrują i atakują kolagen. W tym teście komórki mogą być barwione i łatwo monitorowane w żelu. Prostota i powtarzalność tego testu sprawia, że jest to wygodne narzędzie do badania migracji i inwazji komó...

Ruchliwość komórek to normalny proces rozwojowy i fizjologiczny komórek. Jednak zmiany we wzorcu i zdolności komórek do migracji i inwazji są związane ze stanami patologicznymi, w tym chorobami zapalnymi i przerzutami raka1,2,3. Przerzuty są prawdopodobnie najsłabiej poznanym aspektem raka. Aby uzyskać przerzuty, komórki rakowe muszą zdegradować macierz zewnątrzkomórkową (ECM), zaatakować lokalną tkankę i wejść w stan wewnątrznaczyniowy. Po wejściu do krążenia komórki rakowe rozprzestrzeniają się do odległego miejsca, wynaczyniają się i tworzą guzy wtórne. Dlatego zdolność komórek do degradacji ECM, migracji i inwazji jest związana z ich potencjałem przerzutowym. Opracowano różne podejścia do analizy i ilościowego określenia zdolności komórek do migracji i inwazji. Do najczęściej stosowanych podejść należą test gojenia się ran, mikroskopia poklatkowa i test w komorze Boydena. Test gojenia się ran4 i mikroskopia poklatkowa to proste i wygodne testy, które dają wstępny wgląd w migrację komórek. Jednak oba są testami 2D, które nie odzwierciedlają środowiska 3D, w którym komórki istnieją in vivo. Badania wykazały, że komórki reagują inaczej na środowisko 3D w porównaniu z 2D one5,6. Co więcej, testy gojenia się ran są trudne do odtworzenia i uzyskania wyników ilościowych7,8,9. Test Cell Exclusion Zone, który jest modyfikacją 3D testu gojenia się ran, jest testem bardziej istotnym fizjologicznie, ale nie jest odpowiedni dla komórek o niskiej liczbie, takich jak komórki hybrydowe powstałe w wyniku fuzji komórek10,11.
Test komorowy Boydena jest testem trójwymiarowym, który dostarcza odpowiednich mikrośrodowisk do badań komórkowych. Wymaga to jednak usunięcia komórek z ich pierwotnego mikrośrodowiska i zdeponowania ich w górnej komorze systemu testów Boydena, aby migrować i atakować w dół w kierunku pożywki zawierającej chemoatraktant. To podejście 3D nie jest odpowiednie do analizy zdolności migracji i inwazji komórek podatnych na ich mikrośrodowisko i/lub ograniczonej liczby10,11,12. Nowszym podejściem do analizy migracji i inwazji komórek jest test w komorze gradientowej mikroprzepływów13. Chociaż test ten jest odpowiedni i wiarygodny w badaniach migracji i inwazji, jest droższy i może być technicznie trudny dla typowego laboratorium. Opisujemy tutaj prosty test odwróconej inwazji pionowej, który jest kompatybilny z wieloma typami komórek, w tym komórkami wrażliwymi na swoje mikrośrodowisko i/lub ograniczoną liczbą. Test ten został zaadaptowany z protokołu zaproponowanego przez Hoopera i wsp.14. W tym teście komórki pozostają w swoim pierwotnym mikrośrodowisku, a ich migracja i inwazja są monitorowane, gdy przemieszczają się w górę w żelu kolagenowym zawierającym chemoattractant11. Test ten jest powtarzalny i został zoptymalizowany i zwalidowany w 35-milimetrowej naczyniu hodowlanym. Można go dostosować do różnych warunków testowych, w tym do różnych rozmiarów hodowli komórkowych, różnych matryc lub siły adhezji oraz różnych chemoatraktantów. Test ten może służyć jako platforma in vitro do wstępnych badań przesiewowych w procesie odkrywania leków.

<table><tbody><tr><td>MatTek P35G-1.5-10C</td><td>MatTek Corporation, Ashland, MA</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Naczynia ze szkła matowego</td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura I</td><td>Corning, Corning, NY, USA</td><td>354236</td><td>Żel kolagenowy</td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>H1758</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA</td><td>10010023</td><td>Pbs</td></tr><tr><td>10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>D2429</td><td>10X DMEM</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>konfokalny mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td> Mikroskop <td>koncentryczny</td><td>Olympus IX81</td></tr><tr><td>Zdefiniowana płodowa surowica</td> <td>bydlęcaGE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA</td><td>SH30070.03</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire wielofotonowy laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA</td><td>40x NA 0,8 obiektyw</td><td>MPLSM</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Imaris</td><td>Bitplane Inc. Zurych, CH</td><td>Imaris 7.5.2</td><td>Imaris oprogramowanie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>D9542</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, Stany</td><td>Zjednoczone 50980487</td><td>PFA</td></tr><tr><td>&alfa--minimum niezbędne podłoże</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA</td><td>M0894</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC; Manassas, Wirginia, Stany Zjednoczone</td><td>HBT-22</td><td></td></tr><tr><td>MSC</td><td>Trivedi i Hematti, 2007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 20X UPLAPO</td><td>Olympus America, Center Valley, PA, USA</td><td>36-064</td><td>Obiektyw Olympus UPLSAPO 20X</td></tr></tbody></table>

ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Chociaż testy inwazji 3D zostały już opracowane, wyzwaniem pozostaje badanie komórek bez wpływu na integralność ich mikrośrodowiska. Tradycyjne testy 3D, takie jak komora Boydena, wymagają, aby komórki zostały przemieszczone z pierwotnej lokalizacji hodowli i przeniesione do nowego środowiska. Nie tylko zaburza to procesy komórkowe, które są nieodłącznie związane z mikrośrodowiskiem, ale często prowadzi do utraty komórek. Problemy te są szczególnie trudne, gdy mamy do czynienia z komórkami, które są albo rzadkie, albo niezwykle wrażliwe na swoje mikrośrodowisko. W tym miejscu opisujemy rozwój testu inwazji 3D, który pozwala uniknąć obu tych problemów. W tym teście komórki są siane w małym studzienku, a na komórkach umieszcza się matrycę ECM zawierającą chemoatraktant. Nie wymaga to przemieszczenia komórek i pozwala komórkom na inwazję w górę matrycy. W tym teście można ocenić inwazję komórek, a także morfologię komórek w żelu kolagenowym. Za pomocą tego testu charakteryzujemy zdolność inwazyjną rzadkich i wrażliwych komórek; komórki hybrydowe powstałe w wyniku fuzji między komórkami raka piersi MCF7 a mezenchymalnymi/multipotencjalnymi komórkami macierzystymi/zrębowymi (MSC).

W celu opracowania i optymalizacji protokołu testu inwazji 3D in vitro wykorzystaliśmy 35-mm naczynie hodowlane ze szklanym dnem oraz kolagen typu I z ogona szczura. Za pomocą tego testu wykazaliśmy, że po 48 h, przy zastosowaniu IGF1 (18.6 ng/mL) jako chemoatraktanta, komórki raka piersi MCF7 oraz komórki MSC potrafiły wniknąć w głąb żelu kolagenowego na średnią odległość odpowiednio 0.04 ± 1.8 µm oraz 41.3 ± 76.0 µm (Rysunek 2). Co ważniejsze, wyka...

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Ogólnym celem tego testu inwazji jest ilościowe określenie zdolności migracyjnych i inwazyjnych rzadkich i wrażliwych komórek w warunkach 3D bez usuwania komórek z ich mikrośrodowiska. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem dotyczące zdolności do inwazji wrażliwych i wrażliwych zdarzeń, takich jak produkt fuzji komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są analizowane w ich pierwotnym mikrośrodowisku przy użyciu ustawienia 3D.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, ponieważ może być stosowana do badań przesiewowych środków farmakologicznych zdolnych do hamowania inwazji komórek rakowych i przerzutów. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie. Zasysanie w temperaturze i pH mieszaniny kolagenu wpływa na jej polimeryzację, a nieostrożne obchodzenie się z żelem powoduje odklejanie się.Zacznij od potraktowania 35-milimetrowej płytki hodowlanej z 10-milimetrowym szklanym dnem jednym mililitrem jednego molowego kwasu solnego, aby obniżyć hydrofobowość szkła. Po 15 minutach umyj płytkę dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie, a następnie raz umyj jednym mililitrem 70% etanolu. Następnie przepłucz płytkę jednym mililitrem pożywki hodowlanej właściwej dla komórek będących przedmiotem zainteresowania.I zasiej płytkę interesującymi Cię komórkami. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną 100% konfluencję, połącz 114,5 mikrolitrów świeżo przygotowanego kolagenu z ogona szczura, 16,6 mikrolitrów pożywki 10 X DMEM i 33,1 mikrolitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej atraktantem chemioterapii o znaczeniu w probówce mikrowirówkowej na lodzie.Zneutralizuj mieszaninę kolagenu 14 mikrolitrami wodorowęglanu sodu i pokryj komórki 80 mikrolitrami żelu. Pozwól kolagenowi polimeryzować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez 30 minut. Następnie nałożyć na żel dwa mililitry zredukowanej dwuprocentowej pożywki do hodowli komórek surowicy i ostrożnie umieścić komórki w inkubatorze na odpowiedni okres doświadczalny bez usuwania kolagenu.Pod koniec inkubacji delikatnie usunąć pożywkę i ostrożnie spłukać żel jednym mililitrem PBS. Utrwal komórki jednym mililitrem czteroprocentowego paraformaldehydu przez 15 minut, a następnie wykonaj dwa płukania w jednym mililitrze PBS na pranie. Następnie oznacz komórki roztworem DAPI przez 20 minut w temperaturze pokojowej i zobrazuj in vitro trójwymiarową inwazję kolagenu za pomocą mikroskopii konfokalnej.W tym miejscu pokazano ilościowe określenie inwazji żelu kolagenowego przez linię komórkową raka piersi i produkty fuzji komórek raka piersi w odpowiedzi na atraktant chemioterapii w ciągu 48-godzinnego okresu migracji. W szczególności zaobserwowano również migrację rzadkich produktów fuzji komórek raka piersi do żelu kolagenowego w odpowiedzi na atraktant chemioterapii. Komórki pozostają zdrowe przez cały eksperyment z żelem kolagenowym, o czym świadczy utrzymanie przez nie solidnej liczby komórek i ich morfologii po 48 godzinach od polimeryzacji żelu.Ten pionowy test żelu kolagenowego umożliwia również analizę kinetyki migracji komórek podczas inwazji poprzez obrazowanie migracji komórek w serii Z, a także morfologii migrujących komórek, które mają być uchwycone in situ. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu naczynia do hodowli zwierząt kompatybilnego z mikroskopem. Po tej procedurze można wprowadzić inne zmienne, takie jak modyfikacja siły kolagenu lub stosowanie różnych atraktantów chemioterapii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu zaangażowania ECM na inwazję komórek lub różnych atraktantów chemioterapii na inwazję komórek.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii i nowotworów do badań przesiewowych w kierunku farmakologicznych inhibitorów przerzutów, a także do badania gojenia się ran we wszystkich reakcjach zapalnych in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić zdolność migracyjną i inwazyjną rzadkich i wrażliwych komórek, w warunkach 3D, bez zniekształcania komórek w mikro zaangażowaniu. Nie zapominaj, że chodzenie z ludzkimi komórkami rakowymi, kwasem solnym, paraformaldehydem i DAPI może być niezwykle niebezpieczne i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak korzystanie z bio szamba numer dwa i wstrzymania oparów.

moving-upwards-simple-flexible-vitro-three-dimensional-invasion-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób pomiaru inwazji komórek przez wkładki do hodowli komórkowych z wykorzystaniem metody fluorescencyjnej.

Test inwazyjności guza FluoroBlok In vitro

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Opisano powszechnie stosowane, wysoce dostępne metody badania migracji komórek i inwazji in vitro. Pierwszą metodą jest test zamykania ran komórkowych, który mierzy ruchliwość komórek. Drugą metodą jest test migracji i inwazji transwell, który ocenia zdolność komórek do chemotakcji i inwazyjności.

Metody in vitro Testy migracji i inwazji komórek

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Inwazja otaczających normalnych tkanek jest cechą charakterystyczną nowotworów złośliwych. Przedstawiamy tutaj prosty, półautomatyczny test mikropłytki inwazji do naturalnej biomatrycy 3D, który został zilustrowany za pomocą wielu modeli zaawansowanych nowotworów u ludzi.

Trójwymiarowy (3D) test inwazji sferoidów guza

Ta metoda ocenia inwazję komórek rakowych ze sferoid na otaczającą matrycę 3D.  Sferoidy są generowane metodą hodowli wiszącej kropli, a następnie osadzane w matrycy składającej się z materiałów błonowych i kolagenu typu I.  Inwazja sferoid jest następnie monitorowana.

Test sferoidalny komórek rakowych do oceny inwazji w warunkach 3D

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Obecny protokół opisuje zintegrowaną metodę badania migracji i inwazji komórek rakowych na jednej platformie w czasie rzeczywistym, zapewniając łatwą do odtworzenia i efektywną czasowo opcję badania mobilności i morfologii komórek.

Prosty przepływ pracy migracji/inwazji przy użyciu zautomatyzowanego imagera Live Cell

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

Inwazja jest głównym zjawiskiem biologicznym w rozwoju i postępie raka. Na proces ten mają wpływ komórki nienowotworowe i składniki mikrośrodowiska guza. Celem pracy jest opisanie alternatywnej metody analizy inwazji komórek nowotworowych in vitro z wykorzystaniem kultur trójwymiarowych (3D).

Alternatywna strategia analizy inwazji komórek in vitro w kulturach 3D

Poznaj odwrócony trójwymiarowy test inwazyjny do analizy migracji rzadkich i wrażliwych komórek nowotworowych w ich naturalnym mikrośrodowisku. Ta metoda umożliwia badanie inwazji i przesiewanie leków hamujących przerzuty.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Przeglądaj więcej filmów