Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro
12 marca 2018
Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.
Ogólnym celem tego testu inwazji jest ilościowe określenie zdolności migracyjnych i inwazyjnych rzadkich i wrażliwych komórek w warunkach 3D bez usuwania komórek z ich mikrośrodowiska. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem dotyczące zdolności do inwazji wrażliwych i wrażliwych zdarzeń, takich jak produkt fuzji komórek rakowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki są analizowane w ich pierwotnym mikrośrodowisku przy użyciu ustawienia 3D.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię raka, ponieważ może być stosowana do badań przesiewowych środków farmakologicznych zdolnych do hamowania inwazji komórek rakowych i przerzutów. Wizualna demonstracja tej techniki ma kluczowe znaczenie. Zasysanie w temperaturze i pH mieszaniny kolagenu wpływa na jej polimeryzację, a nieostrożne obchodzenie się z żelem powoduje odklejanie się.
Zacznij od potraktowania 35-milimetrowej płytki hodowlanej z 10-milimetrowym szklanym dnem jednym mililitrem jednego molowego kwasu solnego, aby obniżyć hydrofobowość szkła. Po 15 minutach umyj płytkę dwa razy jednym mililitrem PBS na pranie, a następnie raz umyj jednym mililitrem 70% etanolu. Następnie przepłucz płytkę jednym mililitrem pożywki hodowlanej właściwej dla komórek będących przedmiotem zainteresowania.
I zasiej płytkę interesującymi Cię komórkami. Następnie umieść płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych. Gdy komórki osiągną 100% konfluencję, połącz 114,5 mikrolitrów świeżo przygotowanego kolagenu z ogona szczura, 16,6 mikrolitrów pożywki 10 X DMEM i 33,1 mikrolitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej atraktantem chemioterapii o znaczeniu w probówce mikrowirówkowej na lodzie.
Zneutralizuj mieszaninę kolagenu 14 mikrolitrami wodorowęglanu sodu i pokryj komórki 80 mikrolitrami żelu. Pozwól kolagenowi polimeryzować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla przez 30 minut. Następnie nałożyć na żel dwa mililitry zredukowanej dwuprocentowej pożywki do hodowli komórek surowicy i ostrożnie umieścić komórki w inkubatorze na odpowiedni okres doświadczalny bez usuwania kolagenu.
Pod koniec inkubacji delikatnie usunąć pożywkę i ostrożnie spłukać żel jednym mililitrem PBS. Utrwal komórki jednym mililitrem czteroprocentowego paraformaldehydu przez 15 minut, a następnie wykonaj dwa płukania w jednym mililitrze PBS na pranie. Następnie oznacz komórki roztworem DAPI przez 20 minut w temperaturze pokojowej i zobrazuj in vitro trójwymiarową inwazję kolagenu za pomocą mikroskopii konfokalnej.
W tym miejscu pokazano ilościowe określenie inwazji żelu kolagenowego przez linię komórkową raka piersi i produkty fuzji komórek raka piersi w odpowiedzi na atraktant chemioterapii w ciągu 48-godzinnego okresu migracji. W szczególności zaobserwowano również migrację rzadkich produktów fuzji komórek raka piersi do żelu kolagenowego w odpowiedzi na atraktant chemioterapii. Komórki pozostają zdrowe przez cały eksperyment z żelem kolagenowym, o czym świadczy utrzymanie przez nie solidnej liczby komórek i ich morfologii po 48 godzinach od polimeryzacji żelu.
Ten pionowy test żelu kolagenowego umożliwia również analizę kinetyki migracji komórek podczas inwazji poprzez obrazowanie migracji komórek w serii Z, a także morfologii migrujących komórek, które mają być uchwycone in situ. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o użyciu naczynia do hodowli zwierząt kompatybilnego z mikroskopem. Po tej procedurze można wprowadzić inne zmienne, takie jak modyfikacja siły kolagenu lub stosowanie różnych atraktantów chemioterapii, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu zaangażowania ECM na inwazję komórek lub różnych atraktantów chemioterapii na inwazję komórek.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii i nowotworów do badań przesiewowych w kierunku farmakologicznych inhibitorów przerzutów, a także do badania gojenia się ran we wszystkich reakcjach zapalnych in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić zdolność migracyjną i inwazyjną rzadkich i wrażliwych komórek, w warunkach 3D, bez zniekształcania komórek w mikro zaangażowaniu. Nie zapominaj, że chodzenie z ludzkimi komórkami rakowymi, kwasem solnym, paraformaldehydem i DAPI może być niezwykle niebezpieczne i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak korzystanie z bio szamba numer dwa i wstrzymania oparów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który pozwala na ilościowe określenie zdolności do migracji i inwazji rzadkich oraz wrażliwych komórek w środowisku trójwymiarowym, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórkowego. Metoda ta ma szczególne znaczenie w badaniach nad nowotworami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Migracja komórek
- Badania nad rakiem
- Testy inwazyjności
Wstęp
- Test umożliwia analizę komórek w ich pierwotnym mikrośrodowisku.
- Jest on przeznaczony do badania rzadkich i wrażliwych komórek.
- Zrozumienie inwazji komórkowej jest kluczowe dla rozwoju terapii nowotworowych.
- Wizualna prezentacja techniki jest niezbędna do jej prawidłowego wykonania.
Cel badania
- Ilościowe określenie zdolności komórek do migracji i inwazji.
- Zbadanie zdolności inwazyjnych komórek wrażliwych.
- Przesiewowe badanie środków farmakologicznych hamujących inwazję i przerzutowanie komórek nowotworowych.
Zastosowane metody
- Odwrócony test inwazji pionowej
- Trójwymiarowa hodowla komórkowa
- Analiza komórek w ich mikrośrodowisku
- Ocena wpływu temperatury i pH na polimeryzację kolagenu
Główne wyniki
- Wykazano zdolność do analizy zachowania komórek w środowisku 3D.
- Podkreślono znaczenie utrzymania mikrośrodowiska komórkowego.
- Przedstawiono informacje na temat zdolności inwazyjnych komórek nowotworowych.
- Wykazano potencjał w zakresie przesiewania środków terapeutycznych.
Wnioski
- Analiza ta jest cennym narzędziem w badaniach nad nowotworami.
- Pozwala ona na zachowanie mikrośrodowiska wrażliwych komórek.
- Może wspomagać opracowywanie terapii ukierunkowanych na inwazję i przerzuty nowotworowe.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza ta umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym ocenę potencjału inwazyjnego rzadkich i wrażliwych modeli komórkowych w fizjologicznie istotnym mikrośrodowisku 3D, bez zakłócania natywnych oddziaływań między komórkami a ECM. Poprzez zachowanie oryginalnej niszy komórkowej, metoda ta wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad celami terapeutycznymi związanymi z przerzutowaniem oraz zwiększa pewność prognostyczną w wczesnej fazie walidacji celów. Rozwiązuje ona krytyczną lukę w badaniach przesiewowych przedklinicznych, w których tradycyjne analizy naruszają integralność mikrośrodowiska, zwiększając tym samym ciągłość translacyjną od etapu odkrycia do optymalizacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ocenę inwazji w rzadkich modelach komórkowych lub modelach pochodzących z fuzji w natywnych warunkach mikrośrodowiskowych.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność artefaktową spowodowaną przemieszczaniem się komórek, co poprawia powtarzalność fenotypów inwazyjnych w poszczególnych eksperymentach.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka związanego z wyborem celu terapeutycznego poprzez powiązanie zaburzeń molekularnych z funkcjonalnymi efektami inwazji w kontekście 3D.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość testu: Generuje ustandaryzowane, ilościowe wskaźniki inwazji, które są kompatybilne z obrazowaniem wysokotreściowym oraz zautomatyzowanymi procesami analizy.
- Powtarzalność: Minimalizuje zmienność między dołkami poprzez wyeliminowanie mechanicznego naruszania warstw komórek podczas przygotowania testu.
- Skalowalność: Kompatybilny z różnymi stężeniami kolagenu i chemoatraktantami, co umożliwia prowadzenie badań nad związkiem struktura-aktywność (SAR) inhibitorów przerzutowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w badaniach nad chorobami: Modeluje inwazję nowotworową u ludzi z wykorzystaniem hybrydowych komórek fibroblastyczno-nabłonkowych, które odzwierciedlają oddziaływania stroma-guz in vivo.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki uzyskane in vitro z walidacją przedkliniczną poprzez zachowanie wskazówek mikrośrodowiskowych, które są kluczowe dla zachowań inwazyjnych.
- Decyzje z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza funkcjonalnych danych dotyczących inwazji w celu priorytetyzacji celów lub związków, co zmniejsza prawdopodobieństwo niepowodzenia w późnych etapach badań wynikającego ze słabego modelowania mikrośrodowiska.
Integracja potoku i przepływu pracy
Test ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, stanowiąc alternatywę zachowującą mikrośrodowisko dla komór Boydena lub systemów transwell w programach badawczych dotyczących przerzutowania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dróg inwazji poprzez umożliwienie obrazowania z-stack w czasie rzeczywistym migracji komórek w fizjologicznych żelach kolagenowych.
- Przesiewanie: Dostarcza danych końcowych dotyczących inwazji, odpowiednich do przesiewania bibliotek związków, szczególnie w przypadku czynników ukierunkowanych na przebudowę ECM lub sygnalizację chemotaktyczną.
- Analityka: Umożliwia kwantyfikację liczby komórek inwazyjnych oraz analizę morfometryczną, zapewniając wieloparametrowe odczyty dla korelacji struktura-funkcja.
- Badania translacyjne: Modeluje inwazję opośredniczoną przez zrąb z wykorzystaniem hybryd MSC-nowotwór, wspierając mechanistyczne badania powiązane z biomarkerami.
- Zastosowania przedsiębiorstwa: Możliwość adaptacji w różnych typach nowotworów i ko-kulturach zrębnych, co sprzyja ponownemu wykorzystaniu platformy w programach badawczych nad przerzutowaniem i gojeniem ran.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję wyników fałszywie dodatnich wynikających z zaburzeń mikrośrodowiska.
- Wartość operacyjna: Zwiększa odporność testu dzięki standaryzacji protokołów polimeryzacji żelu i nakładania warstw.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczenie fizjologicznie istotnych danych o inwazji na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia stratyfikację ryzyka w rozwoju inhibitorów przerzutowania w oparciu o funkcjonalne profile inwazji 3D.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie trójwymiarowych kultur komórkowych oraz mikroskopii konfokalnej w celu dokładnego określenia stopnia inwazji.
- Metoda zależy od precyzyjnej kontroli temperatury i pH podczas przygotowywania kolagenu, aby zapewnić spójną polimeryzację żelu.
- Wymagane jest zastosowanie standaryzowanych dawek chemoatraktanta oraz pożywek o obniżonej zawartości surowicy w celu uzyskania powtarzalnych odpowiedzi chemotaktycznych.
- Adaptacja do alternatywnych białek ECM (np. Matrigel, fibryna) może wymagać optymalizacji kinetyki żelowania oraz stężenia.
- Metoda jest ograniczona do komórek adherentnych lub póładherentnych, zdolnych do inwazji w górę przez warstwę żelu; zawiesiny nieadherentne mogą wymagać modyfikacji.
