Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem
12 czerwca 2018
Ten protokół opisuje metodę chemicznego rozpalania pentylenotetrazolu i dostarcza mysi model padaczki. Protokół ten może być również wykorzystany do badania podatności na indukcję i patogenezę napadów padaczkowych po napadach padaczkowych u myszy.
Ta metoda może pomóc w głębokiej analizie padaczki. Napad wywoła zmiany histologiczne w mózgu, które mogą być zaangażowane w neuropsychiatryczne zaburzenia rozwojowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że samodzielna dawka PTZ może wywoływać kontrolowane napady lepiej niż inne obecne metody.
Przygotowanie wstrzyknięcia należy rozpocząć od rozpuszczenia 2 miligramów na mililitr PTZ w sterylnym 0,9% chlorku sodu. Zważ zwierzę, a następnie umieść je w komorze obserwacyjnej na 3-minutowy okres przyzwyczajenia. Następnie wstrzyknąć PTZ międzyotrzewnowo za pomocą 1-mililitrowej strzykawki przymocowanej do igły o rozmiarze 27 w lewą lub prawą ćwiartkę brzucha zwierzęcia.
Na koniec obserwuj zwierzę po wstrzyknięciu PTZ pod kątem nieprawidłowego zachowania. Uzyskaj co najmniej dwie myszy SV w wieku od dwóch do sześciu miesięcy, które są tej samej płci co badane myszy, aby być obcą myszą. Każda obca mysz musi być trzymana osobno.
Podczas każdej sesji treningowej pozostaw mysz w klatce w celu przyzwyczajenia się przez 15 minut. Wyczyść całe urządzenie w obu klatkach, przecierając powierzchnię 70% etanolem. Następnie umieść puste klatki w dwóch bocznych komorach aparatu trzykomorowego i otwórz drzwi między komorami.
Aby przyzwyczaić badaną mysz, umieść ją w środkowej komorze i pozwól myszy swobodnie poruszać się po urządzeniu, dopóki mysz nie zbada obu klatek, plus dodatkowe pięć minut. Po tym, jak zwierzę przejdzie do środkowej komory, zamknij drzwi i pozwól myszy swobodnie poruszać się w środkowej komorze przez pięć minut. W tym okresie umieść jedną ze 129 myszy SV w klatce, aby przyzwyczaić się do klatki.
Natychmiast po okresie przyzwyczajenia badanej myszy, umieść klatkę zawierającą mysz 129 SV, zwaną klatką Obcego Jednego, w jednej z bocznych komór i umieść pustą klatkę, zwaną klatką Obiektu, w drugiej bocznej komorze. Otwórz drzwi i monitoruj zachowanie myszy obiektu. Pozwól badanej myszy poruszać się swobodnie przez 10 minut i zapisz cztery parametry behawioralne.
Po pierwsze, czas spędzony w każdej komnacie, komorze Stranger One, komorze Obiektu i komnacie środkowej. Po drugie, czas spędzony na badaniu każdej klatki, klatki Stranger One i klatki Obiektu. Numer trzy, liczba wejść do każdej komnaty, a numer cztery, całkowita przebyta odległość.
Gdy mysz przejdzie do środkowej komory, zamknij drzwi. Po wyczyszczeniu klatek rozpocznij analizę nowości społecznych, umieszczając kolejną mysz 129 SV w jednej z klatek, zwanej klatką Stranger Two, i umieść klatkę Stranger Two w jednej z komór. Umieść mysz Stranger One w drugiej klatce, zwanej klatką Stranger One i umieść klatkę Stranger One w drugiej komorze.
Na koniec otwórz drzwi i monitoruj zachowanie myszy obiektu. Pozwól badanej myszy poruszać się swobodnie przez 10 minut i mierz te same parametry behawioralne, które opisano w analizie społecznej. Zacznij od umieszczenia myszy w aparacie kondycjonującym z określonymi warunkami.
Na przykład kwadratowe urządzenie z przezroczystymi ściankami z pleksiglasu, metalową siatką podłogową, zapachem etanolu, jasnością 100 luksów i białym szumem tła 65 decybeli. Kondycjonuj mysz za pomocą wstrząsu stopy z pseudolosowym czasem 0,1 miliampera wstrząsów elektrycznych przez dwie sekundy trzy razy w ciągu pięciu minut. Następnie po kondycjonowaniu umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
Dzień po kondycjonowaniu przeprowadź ocenę pamięci, umieszczając mysz w tym samym urządzeniu, co w stanie szoku i mierząc czas zamrażania w ciągu pięciu minut. Później tego samego dnia umieść mysz w nowatorskim aparacie i zmierz czas zamrażania podczas pięciominutowej oceny. Na koniec porównaj czas zamarzania między tym samym stanem a nowym stanem.
Wyniki wykazały, że wynik napadu stopniowo wzrastał po wstrzyknięciach PTZ, podczas gdy zastrzyki z soli fizjologicznej nie wywoływały żadnych napadów ani nieprawidłowych zachowań. Co więcej, powtarzające się napady sprzyjały nieprawidłowemu tworzeniu się gałęzi aksonalnych lub kiełkowaniu włókien omszałych i nieprawidłowej migracji komórek ziarnistych w hipokampie. Myszy leczone PTZ wykazywały normalne kontakty społeczne.
Myszy spędzały więcej czasu w komorze Stranger One niż w komorze Object i badały klatkę Stranger One więcej niż badały klatkę Object. Myszy leczone PTZ wykazywały nienormalną nowość społeczną, co wskazuje na upośledzenie pamięci społecznej. Myszy leczone PTZ wykazywały również upośledzoną pamięć w kontekstowym teście strachu.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak labirynt wodny Morrisa lub inne testy pamięci, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące upośledzonej zdolności pamięci, na którą wpływa napad padaczkowy. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się padaczką do zbadania mechanizmu neuropsychiatrycznych zaburzeń rozwojowych wywołanych napadami padaczkowymi przy użyciu modelowych zwierząt.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę chemicznego wywoływania napadów za pomocą pentylenotetrazolu (PTZ) w celu stworzenia mysiego modelu epilepsji. Analizie poddano wpływ powtarzających się napadów na wyniki behawioralne oraz towarzyszące im zmiany neuronalne. Metoda ta umożliwia badaczom zgłębianie neuropsychiatrycznych zaburzeń rozwojowych indukowanych napadami przy użyciu myszy szczepu 129 SV.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza behawioralna
- Badania nad epilepsją
Wstęp
- Pentylenetetrazol (PTZ) jest wykorzystywany do kontrolowanego indukowania napadów drgawek.
- Napady drgawek mogą wywołać w mózgu zmiany histologiczne związane z zaburzeniami rozwojowymi.
- Model ten dostarcza wiedzy na temat podatności na napady drgawek oraz ich wpływu na zachowanie.
- Analiza obserwacyjna pomaga ocenić reakcję na nowość społeczną oraz upośledzenie pamięci u traktowanych myszy.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego modelu mysiego do badania epilepsji.
- Zbadanie wpływu napadów indukowanych PTZ na zachowania społeczne i pamięć.
- Analiza mechanizmów leżących u podstaw zaburzeń neuropsychiatrycznych wywołanych napadami.
Zastosowane Metody
- Oceny behawioralne są przeprowadzane z wykorzystaniem myszy 129 SV.
- PTZ jest podawany poprzez wstrzyknięcie doszpikowe w celu wywołania napadów drgawkowych.
- Po podaniu PTZ monitorowane jest zachowanie w testach społecznych i pamięciowych.
- Kluczowe etapy obejmują okresy habituacji zarówno dla myszy badanych, jak i obcych przed rozpoczęciem testów.
- Dane dotyczące napadów i zachowania są systematycznie rejestrowane do późniejszej analizy.
Główne wyniki
- Iniekcje PTZ spowodowały wzrost punktacji napadów oraz wystąpienie nieprawidłowych zachowań.
- Epizody napadów doprowadziły do zauważalnych zmian w strukturze mózgu, takich jak kiełkowanie włókien mszystych.
- Myszy traktowane PTZ wykazywały upośledzenie pamięci społecznej oraz reakcji lękowych kontekstowych w porównaniu z grupą kontrolną.
- Powtarzające się napady wpłynęły na wyniki behawioralne, co wskazuje na reperkusje w zakresie funkcji neuropsychiatrycznych.
Wnioski
- Badanie ustanawia nowy model służący do badania mechanizmów leżących u podstaw epilepsji oraz jej konsekwencji behawioralnych.
- Wyniki podkreślają znaczenie wykorzystania modeli zwierzęcych w ocenie zaburzeń neuropsychiatrycznych związanych z aktywnością napadową.
- Podejście to może ułatwić przyszłe badania nad interwencjami terapeutycznymi w przypadku epilepsji i schorzeń z nią związanych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Model myszy z indukowanym pentylenotetrazolem (PTZ) procesem kindlingu stanowi solidną i skalowalną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw epilepsji oraz neuropsychiatrycznych zaburzeń wywołanych napadami. Model ten umożliwia ilościową ocenę podatności na napady, upośledzenia behawioralne i patologię neuronalną, co zwiększa pewność predykcyjną w wczesnych etapach walidacji celów terapeutycznych i screeningu związków. Jego powtarzalność i znaczenie translacyjne sprawiają, że jest on cennym narzędziem w selekcji projektów oraz ograniczaniu ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków na OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną ocenę podatności na napady oraz ich progresji w kontrolowanym systemie in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie aktywności napadów z punktami końcowymi histologicznych i behawioralnych.
- Ułatwia funkcjonalną walidację genów i szlaków związanych z epilepsją.
- Stanowi podstawę do zwiększenia pewności prognostycznej w wyborze i priorytetyzacji celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany, powtarzalny model do przesiewania leków przeciwpadaczkowych.
- Generuje ilościowe wyniki behawioralne i histologiczne do oceny związków.
- Wspiera standaryzację testów i porównywalność między badaniami.
- Umożliwia skalowalną, wysokoprzepustową ocenę potencjalnych interwencji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie patologii modelu zwierzęcego ze zmianami w ludzkim mózgu w padaczce w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia badanie wywołanych napadami deficytów neuropsychiatrycznych i poznawczych istotnych dla punktów końcowych w badaniach klinicznych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów z uwzględnieniem analizy ryzyka poprzez dostarczanie danych o skuteczności istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ułatwia odkrywanie i walidację biomarkerów w procesie translacji z etapu przedklinicznego na kliniczny.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten integruje się z kontinuum odkrywania leków, od wczesnych badań mechanistycznych, przez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną, wspierając zarówno ograniczanie ryzyka związanego z celem terapeutycznym, jak i selekcję związków.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez dotyczących mechanizmów napadów i następstw neuropsychiatrycznych.
- Przesiew: Oferuje powtarzalne, ilościowe wyniki behawioralne i histologiczne do rankingowania związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie wyników napadów, wskaźników behawioralnych i neuropatologii w różnych grupach badawczych.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia przedkliniczne z istotnością kliniczną poprzez zestawienie patologii mózgu zwierząt i pacjentów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalny, zestandaryzowany model do bieżącej oceny portfolio CNS i eksploracji mechanistycznej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów i szlaków dla epilepsji oraz zaburzeń z nią związanych.
- Wartość operacyjna: Dostarcza zestandaryzowanych, skalowalnych i odtwarzalnych przepływów pracy do wdrożenia w wielu zespołach.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach programów CNS.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów o zwalidowanych podstawach mechanistycznych.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymagana jest wiedza z zakresu obsługi zwierząt, analizy behawioralnej oraz oceny neuropatologicznej.
- Wymagany jest dostęp do specjalistycznej aparatury behawioralnej i histologicznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów dawkowania, obserwacji i punktacji pomiędzy członkami zespołu.
- Adaptacja metody do różnych szczepów myszy lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji protokołu.
- Interpretacja wyników powinna uwzględniać ograniczenia specyficzne dla gatunku oraz modelu.
