Name: Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę chemicznego rozpałkowania pentylenotetrazolem w myszach 129 SV do badania epilepsji. Technika umożliwia kontrolowane wywoływanie napadów i analizę zmian behawioralnych oraz neuropsychiatrycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty JSPS KAKENHI o numerach 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 i 17K07086, MEXT KAKENHI o numerach grantów 25110737 i 23110525, AMED Grant Number JP18ek0109311, oraz SENSHIN Medical Research Foundation i Japan Epilepsy Research Foundation.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Miejskiego Instytutu Nauk Medycznych w Tokio. Zaleca się myszy poporodowe w wieku 8 - 16 tygodni. Każdy szczep wsobny jest dopuszczalny do eksperymentu. Myszy C57BL/6 są bardziej odporne na PTZ, podczas gdy myszy BALB/c i szwajcarskie albinosy są bardziej wrażliwe na PTZ. W tym badaniu użyto C57BL/6. Podatność na PTZ zależy również od wieku myszy. W porównaniu z młodszymi myszami, starsze myszy są bardziej odporne na PTZ35. Liczba zwierząt używanych do tej metody może się różnić, ale dla każdego warunku wymagane jest co najmniej 6-10 zwierząt.
1. Przygotowanie PTZ
<ol>
	<li>Rozpuścić 2 mg/ml PTZ w sterylnym 0,9% (w/v) NaCl. Przygotuj PTZ w dniu użytkowania.</li>
</ol>
2. Wstrzykiwanie PTZ
<ol>
	<li>Wszystkie eksperymenty wykonuj między 9:00 a 12:00 (w południe).</li>
	<li>Zmierz masę ciała zwierzęcia.</li>
	<li>Umieść zwierzę w komorze obserwacyjnej w celu przyzwyczajenia.</li>
	<li>W okresie przyzwyczajenia (3 min) należy obliczyć objętość roztworu PTZ do wstrzykiwań na podstawie masy ciała zwierzęcia i wcześniej ustalonej dawki do wstrzykiwań. 
	UWAGA: Na przykład, gdy używany jest PTZ 35 mg/kg, 0,875 mg PTZ jest wymagane dla myszy o wadze 25 g (35 mg/kg x 0,025 kg = 0,875 mg). Dlatego należy wstrzyknąć 437,5 μl roztworu PTZ o stężeniu 2 mg/ml (0,875 mg / 2 mg/ml = 0,4375 ml). Dawka do wstrzykiwań PTZ zależy od genotypu i szczepu myszy. W przypadku myszy C57BL/6 typu dzikiego w pierwszym badaniu zalecana jest dawka 30-35 mg PTZ/kg masy ciała. Czułość na PTZ zależy od użytego szczepu myszy36,37. Dawka do wstrzykiwań różni się w zależności od celu eksperymentu.</li>
	<li>Wstrzyknąć PTZ dootrzewnowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przymocowanej do igły o rozmiarze 27 w lewą lub prawą ćwiartkę brzucha zwierzęcia. Należy unikać wstrzykiwania w linii środkowej.
	<ol>
		<li>Należy unikać wielokrotnych wstrzyknięć w tę samą pozycję.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwuj zachowania zwierząt przez 30 minut po podaniu PTZ (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A), a następnie klasyfikuj i oceniaj nieprawidłowe zachowanie, jak pokazano poniżej. Jeśli to możliwe, należy utrzymywać zwierzęta pod obserwacją przez 24 godziny lub co najmniej dodatkowe 6-10 godzin po wstrzyknięciu, zwłaszcza gdy nasilenie napadu osiągnie 3 lub więcej.
	<ol>
		<li>Zwróć uwagę na wszelkie łagodne napady lub zmiany w zachowaniu zwierząt po upływie 30-minutowego okresu obserwacji. Ten przedłużony okres obserwacji może dotyczyć szczególnie ważnego i pełnego wpływu poddrgawkowej dawki PTZ na powstawanie przewlekłych, niesprowokowanych napadów padaczkowych w padaczce.</li>
		<li>Ponadto należy zmierzyć czas trwania napadu dla każdego zaobserwowanego napadu, ponieważ zmiany czasu trwania napadu odnoszą się do nasilenia napadu. Co więcej, opóźnienie do pierwszego napadu po wstrzyknięciu PTZ jest kolejnym ważnym pomiarem do zebrania. Monitorowanie częstotliwości, czasu trwania i opóźnienia napadów ma kluczowe znaczenie dla wszelkich badań molekularnych po napadzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzykiwaj PTZ co drugi dzień (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Liczba wstrzyknięć zależy od celu eksperymentu. Reprezentatywne przykłady są następujące.
	<ol>
		<li>Aby wytworzyć całkowicie rozpalone zwierzęta, gdy zwierzę doświadczy napadu z wynikiem 5 (napad toniczno-kloniczny), zakończ wstrzyknięcie w ciągu dodatkowych trzech podań. W takim przypadku należy zwiększyć dawkę do wstrzykiwań, jeśli napad nie zwiększa się przez trzy kolejne podania. Każde zwierzę może otrzymać inną liczbę i dawkę zastrzyków PTZ.</li>
		<li>Ustal liczbę i dawkę wstrzyknięcia PTZ w każdym stanie, aby ocenić podatność na PTZ, w tym w ocenie leków przeciwpadaczkowych i badaniach fenotypu myszy zmodyfikowanych genetycznie. Wszystkim zwierzętom należy podać taką samą liczbę wstrzyknięć PTZ; Zaleca się wykonanie od 8 do 12 wstrzyknięć. Jeśli zwierzę padnie, wynik napadu powinien być oznaczony jako 6.</li>
		<li>Należy określić dawkę iniekcji niezbędną do utrzymania wysokiej liczby napadów (4 lub 5) dla 10 lub więcej wstrzyknięć w celu zbadania zmian histopatologicznych występujących w napadach padaczkowych. W takim przypadku całkowita liczba wstrzyknięć powinna wynosić od 25 do 30. Należy zmniejszyć dawkę do wstrzyknięcia, jeśli liczba napadów osiągnie 5. Jeśli częstość napadów zmniejszy się do 3 lub mniej, należy zwiększyć dawkę do wstrzykiwań.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wynik napadu
<ol>
	<li>Obserwuj zachowania zwierząt i zapisuj wyniki.
	<ol>
		<li>Klasyfikuj i oceniaj zachowania epilepsji w następujący sposób38,39 (Rysunek 1B): 
		0: normalne zachowanie, brak nieprawidłowości. 
		1: unieruchomienie, leżenie na brzuchu. 
		2: głową, mioklonie kończyn przednich, przednich lub tylnych. 
		3: ciągła mioklonia całego ciała, szarpnięcia miokloniczne, sztywno uniesiony ogon. 
		4: podnoszenie, napad toniczny, upadek na bok. 
		5: napad toniczno-kloniczny, upadek na plecy, dziki pośpiech i skakanie. 
		6: śmierć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmień kryteria zachowania w oparciu o wynik Racine'a40, w zależności od warunków eksperymentalnych.</li>
</ol>
4. Analiza po napadzie
<ol>
	<li>Analiza immunohistopatologiczna
	<ol>
		<li>Utrwalanie perfuzji
		<ol>
			<li>preparat
			<ol>
				<li>Rozpuścić 4% (w/v) paraformaldehydu (PFA) w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4). Podgrzać roztwór do temperatury około 70 °C z dodatkiem kropli 1 M NaOH (około 1 μL 1 M NaOH na 50 ml roztworu PFA).</li>
				<li>Przygotuj lodowato zimny 4% PFA i sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).</li>
				<li>Zainstaluj pompę perystaltyczną z rurką i igłą. Przepuść około 20 ml wody przez rurkę, aby usunąć pozostałości. Następnie umieść otwarty koniec rurki w lodowatym PBS.</li>
			</ol>
			</li>
			<li>Perfuzja przezsercowa i przygotowanie nieruchomego mózgu
			<ol>
				<li>Głęboko znieczul mysz 50% izofluranem/50% etanolem w małym słoiku.</li>
				<li>Utrzymuj mysz w pozycji leżącej, przypinając czubki kończyn przednich i tylnych.</li>
				<li>Przetnij brzuszną linię środkową brzucha i odsłoń przeponę.</li>
				<li>Przetnij membranę wzdłuż brzegu żebrowego. Następnie odetnij obie boczne strony żeber i tułowia. Ściśnij wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy blokujących i przeciśnij klatkę piersiową. Utrzymuj pozycję wyrostka mieczykowatego, przypinając go igłą lub ściskając kleszczami. Odsłoń serce.</li>
				<li>Włóż igłę do lewej komory i wykonaj nacięcie w prawym przedsionku za pomocą nożyczek. Należy pamiętać, aby nie wbić igły zbyt głęboko w serce, ponieważ może ona przebić wewnętrzną ścianę.</li>
				<li>Rozpocznij stały przepływ lodowatego PBS przez igłę, aby wypłukać krew (około 15 - 20 ml/min).</li>
				<li>Gdy krew zostanie usunięta z organizmu, przenieś probówkę do 4% roztworu paraformaldehydu (około 60 ml) bez dodawania pęcherzyków. Następnie zatrzymaj perfuzję.</li>
				<li>Przeciąć tylną szyję i kręgosłup oraz zdjąć skórę głowy i grzbietową część czaszki nożyczkami preparacyjnymi.</li>
				<li>Przetnij kość przedszczękową między oczodołami oka i całkowicie usuń grzbietową część czaszki.</li>
				<li>Stwórz szczelinę między mózgiem a kością szyjną od tylnej strony i przetnij nerwy trójdzielne i skrzyżowanie wzrokowe pod mózgiem. Ostrożnie wyjmij mózg i umieść go w fiolce zawierającej 4% PFA. Utrwalaj mózg w temperaturze 4°C przez 12-16 godzin.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie plastra mózgu
		<ol>
			<li>Przenieś unieruchomiony mózg do 20% sacharozy/PBS, aż mózg zanurzy się w roztworze, aby umożliwić krioprotekcję.</li>
			<li>Wytnij nieruchomy mózg w oparciu o wymaganą orientację plastra i wymaganą część mózgu.</li>
			<li>Ustaw kriomikrotom. Ustaw ostrze w odpowiedniej pozycji i utrzymuj stopień mikrotomu w temperaturze poniżej -20 °C.</li>
			<li>Umieść wstępnie przycięty mózg na scenie i pokryj mózg 20% sacharozą/PBS. Roztwór sacharozy/PBS będzie stopniowo zamrażał, pokrywając mózg na scenie, aż mózg zostanie całkowicie osadzony w zamrożonej 20% sacharozy/PBS.</li>
			<li>Pokrój mózg (o grubości 30 μm), przesuwając ostrze przez tkankę. Przenieść plastry do PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Immunohistochemia fluorescencyjna
		<ol>
			<li>Umyj niezbędne plastry w 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) przez 10 minut, 3 razy w temperaturze pokojowej (RT).</li>
			<li>Zablokować plastry poprzez inkubację w PBST z 2% surowicą kozią lub 5% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) przez 1 - 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Inkubować plastry w roztworze przeciwciała o odpowiednim stężeniu przeciwciała pierwszorzędowego w PBST z 2% surowicą kozią lub 5% BSA przez 1 do 7 nocy w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Myj plastry w PBST przez 10 minut, 3 razy w temperaturze smożonej.</li>
			<li>Inkubować wycinki w roztworze przeciwciała drugorzędowego o odpowiednim stężeniu przeciwciała drugorzędowego w PBST przez 1-2 godziny w temperaturze słonecznej, w osłonie przed światłem.</li>
			<li>Zamontuj plastry na szkiełkach podstawowych i przykryj podłożem montażowym i szkłem nakrywkowym.</li>
			<li>Obserwuj plastry za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test trzykomorowy
	<ol>
		<li>preparat
		<ol>
			<li>Przygotuj co najmniej 2, 2-6-miesięczne myszy 129/Sv tej samej płci co badane myszy, aby stały się "obcą myszą". Przyzwyczaj wszystkie myszy w klatce przed analizą. Na każdą sesję treningową umieść mysz w klatce i pozostaw ją na 15 minut.</li>
			<li>Przed każdą fazą habituacji z badaną myszą wyczyść całe urządzenie i obie klatki, przecierając powierzchnię 70% etanolem.</li>
			<li>Umieść puste klatki w dwóch bocznych komorach aparatu 3-komorowego i otwórz drzwi między komorami.</li>
			<li>Aby przyzwyczaić badaną mysz, umieść badaną mysz w środkowej komorze i pozwól myszy swobodnie poruszać się po aparacie, dopóki mysz nie zbada obu klatek, plus dodatkowe 5 minut. Badane zwierzęta, które mogą bać się klatki, nie badają klatki przez 20 minut i nie powinny być używane do tej analizy. Takie zwierzęta unikają klatki i rzadko się do niej zbliżają.</li>
			<li>Po tym, jak zwierzę przejdzie do środkowej komory, zamknij drzwi i pozwól myszy swobodnie poruszać się w środkowej komorze przez 5 minut. W tym okresie umieść jedną z myszy 129/Sv w klatce, aby przyzwyczaić się do klatki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza społeczna
		<ol>
			<li>Przeprowadź tę analizę natychmiast po okresie przyzwyczajenia badanej myszy.</li>
			<li>Umieść klatkę zawierającą mysz 129/Sv, zwaną "klatką Stranger 1", w jednej z bocznych komór i umieść pustą klatkę, zwaną "klatką obiektu", w drugiej bocznej komorze.</li>
			<li>Otwórz drzwi i monitoruj zachowanie myszy obiektu.</li>
			<li>Pozwól badanej myszy poruszać się swobodnie przez 10 minut i zapisz następujące parametry zachowania. Jeśli badana mysz boi się myszy w klatce Nieznajomego 1, na co wskazuje unikanie przez mysz klatki Nieznajomego 1 i pozostawanie w rogu jednej z komór, zwierzę nie powinno być wykorzystywane do analizy. 
			a) Czas spędzony w każdej komnacie, komorze Nieznajomego 1, komorze Obiektu i komorze środkowej. 
			b) Czas spędzony na badaniu każdej klatki, klatki Nieznajomego 1 i klatki Obiektu. (Mysz jest klasyfikowana jako badająca klatkę, jeśli mysz wącha lub hartuje mysz lub klatkę) 
			c) Liczba wejść do każdej komory (opcjonalnie) 
			d) Całkowita przebyta odległość (opcjonalnie)</li>
			<li>Gdy mysz przejdzie do środkowej komory, zamknij drzwi.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Analiza nowości społecznych
		<ol>
			<li>Przeprowadź tę analizę natychmiast po analizie społecznej.</li>
			<li>Przetrzyj obie klatki 70% etanolem.</li>
			<li>Umieść kolejną mysz 129/Sv w jednej z klatek, zwanej "klatką Stranger 2" i umieść klatkę Stranger 2 w jednej z komór. Umieść mysz Nieznajomego 1 w drugiej klatce, zwanej "klatką Nieznajomego 1", a następnie umieść klatkę Nieznajomego 1 w drugiej komnacie.</li>
			<li>Otwórz drzwi i monitoruj zachowanie myszy obiektu.</li>
			<li>Pozwól badanej myszy poruszać się swobodnie przez 10 minut i mierz te same parametry behawioralne, które opisano w analizie społecznej. 
			UWAGA: Mysz Stranger 1 i Stranger 2 powinna być wybierana losowo. Komnata Nieznajomego 1 i komnata Obiektu, a także komnata Nieznajomego 1 i komnata Nieznajomego 2 powinny być wybierane losowo.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontekstowa dyskryminacja ze strachu
	<ol>
		<li>Klimatyzacja
		<ol>
			<li>Przed każdą próbą kondycjonowania należy oczyścić aparaturę doświadczalną, przecierając powierzchnię 70% etanolem.</li>
			<li>Umieść mysz w aparacie kondycjonującym o określonych warunkach (kształt aparatu, kolor ścian, materiał podłogi, zapach, oświetlenie i głośność hałasu tła powinny być z góry określone). Na przykład użyta tutaj aparatura kondycjonująca była kwadratowym aparatem z przezroczystymi ściankami z pleksi, metalową siatką podłogową, zapachem etanolu, jasnością 100 luksów i białym szumem tła 65 dB.</li>
			<li>Kondycjonuj mysz przez wstrząs stopą z pseudolosowym czasem porażenia prądem 0,1 mA przez 2 s x 3 razy w ciągu 5 minut.</li>
			<li>Po kondycjonowaniu umieść mysz w klatce domowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ocena pamięci
		<ol>
			<li>Przed każdą oceną należy oczyścić aparaturę doświadczalną, przecierając powierzchnię 70% etanolem.</li>
			<li>Następnego dnia po kondycjonowaniu umieść mysz w tym samym urządzeniu, w którym znajduje się stan szoku i zmierz czas zamrażania w ciągu 5 minut.</li>
			<li>Później tego samego dnia umieść mysz w nowatorskim aparacie i zmierz czas zamrażania podczas 5-minutowej oceny. Zastosowano tu trójkątny aparat z białymi ściankami z pleksi, płytową podłogą, brakiem zapachu, jasnością 30 luksów i białym szumem 70 dB.</li>
			<li>Porównaj czas zamarzania między tym samym stanem a nowym stanem. Myszy z normalną zdolnością zapamiętywania zamarzną bardziej w tym samym stanie niż w nowym stanie. Zamrożenie definiuje się unieruchomienie zwierzęcia na dłużej niż 2 s.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu przedstawiamy szeroko dostępny protokół tworzenia farmakologicznego modelu zwierzęcego padaczki. Rozpałka chemiczna za pośrednictwem PTZ ma długą historię i jest powszechnie akceptowanym modelem do badania histopatologii i patologii komórkowej padaczki41. Model epilepsji z chemicznym rozpalaniem był już wcześniej analizowany przez Suzdak i Jansen, 1995,42. Farmakologiczna indukcja napadów, zwłaszcza w przypadku PTZ, jest łatwą i prostą metodą wywoływania ciężk...

Epilepsja to przewlekłe zaburzenie neurologiczne, które charakteryzuje się nawracającymi napadami i dotyka około 1% osób. Mechanizmy leżące u podstaw epileptogenezy i powstawania napadów padaczkowych u pacjentów z padaczką nie mogą być w pełni wyjaśnione w badaniach klinicznych. W związku z tym do badania padaczki wymagany jest odpowiedni model zwierzęcy1.
Do badania fizjologii epilepsji i identyfikacji leków przeciwpadaczkowych użyto różnych modeli zwierzęcych epilepsji2,3. Wśród tych modeli, farmakologiczna indukcja napadów jest powszechną metodą stosowaną do generowania modelu zwierzęcego do badania patologii padaczki4. Ta metoda jest niedroga i prosta. Rozpalanie za pośrednictwem elektrody jest również powszechnie stosowaną metodą, ale koszty tej procedury są wyższe, a metoda wymaga umiejętności chirurgicznych i elektrycznych do wywołania powtarzających się napadów5.
Indukcja farmakologiczna jest również korzystna, ponieważ czas i liczba napadów są łatwo kontrolowane. Genetyczne modele myszy, które wykazują spontaniczne napady, są również wykorzystywane w badaniach nad padaczką. Jednak przewidzenie, kiedy i jak często pojawiają się napady w tych modelach genetycznych, może być niemożliwe6. Do obserwacji zachowań epileptycznych genetycznie zmodyfikowanych myszy wymagany jest system monitorowania6.
Kwas kainowy, pilokarpina i pentylenotetrazol (PTZ) są powszechnie stosowane jako leki wywołujące drgawki7. Kwas kainowy jest agonistą receptorów glutaminianu, a pilokarpina aktywuje receptory cholinergiczne. PTZ jest antagonistą receptora kwasu gamma-aminomasłowego (GABA)-A8. PTZ hamuje funkcję synaps hamujących, co prowadzi do zwiększonej aktywności neuronów. Regulacja ta powoduje uogólnione napady padaczkowe u zwierząt9. Pojedyncze wstrzyknięcie kwasu kainowego i pilokarpiny może wywołać ostre napady, zwłaszcza stan padaczkowy (SE)10,11 a SE za pośrednictwem kwasu kainowego lub pilokarpiny sprzyja przewlekłym napadom spontanicznym i nawracającym12,13. Zapisy elektroencefalograficzne (EEG) i analiza zachowania wykazały, że spontaniczne nawracające napady są obserwowane miesiąc po pojedynczym wstrzyknięciu12,13. Pojedyncze wstrzyknięcie konwulsyjnej dawki PTZ również wywołuje ostry napad. Jednak przewlekłe napady samoistne po pojedynczym wstrzyknięciu PTZ są trudne do sprowokowania. Przewlekłe podawanie PTZ jest wymagane do wywołania powtarzających się napadów14. W obu metodach generowanie powtarzających się napadów jest w stanie wywołać patologię bardziej podobną do padaczki ludzkiej niż generowanie ostrych napadów. W przypadku PTZ każde wstrzyknięcie wywołuje napad, a nasilenie napadu nasila się stopniowo z każdym wstrzyknięciem. Wreszcie, pojedynczy zastrzyk PTZ o niskiej dawce wywołuje ciężki napad toniczno-kloniczny. W tej fazie każde wstrzyknięcie wywołuje silne drgawki. Ponadto, opóźnienie i czas trwania napadu również zmieniają się w trakcie wstrzyknięć. Opóźnienie do napadu tonicznego często skraca się w drugiej fazie rozpalania15. Ponadto nasileniu napadu towarzyszy wydłużony czas trwania napadu16. Badanie mechanizmu molekularnego regulującego nasilenie, opóźnienie i czas trwania napadu jest przydatne do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych17,18,19.
Napady są często wywoływane przez pojedyncze ogólnoustrojowe podanie PTZ, a powrót do zdrowia jest bardzo szybki, w ciągu 30 minut4,5. Dzięki temu liczba napadów jest bardziej kontrolowana w modelu rozpałkowym PTZ. Jednak monitorowanie EEG wykazało, że uogólnione skoki mogą być obserwowane do 12 godzin po napadzie za pośrednictwem PTZ20. W związku z tym zwierzęta powinny pozostać pod obserwacją przez 24 godziny po napadzie mioklonicznym lub tonicznym21 w celu dokładniejszej analizy mechanizmów rozpalania.
Podawanie leków przeciwpadaczkowych, takich jak etosuksymid, walproinian, fenobarbital, wigabatryna i retygabina3, przed lub po wstrzyknięciu PTZ łagodzi nasilenie napadu3,22,23. Podobnie, wykazano, że myszy z nokautem, które nie mają genów zaangażowanych w zaostrzenie napadów, takich jak metaloproteinaza macierzy-924, FGF-2225 i neuritin26, wykazują zmniejszone nasilenie napadu po wielokrotnych wstrzyknięciach PTZ. Ponadto dzięki tej metodzie możliwa jest obserwacja zmian histopatologicznych po napadach padaczkowych. U pacjentów z padaczką skroniową występują typowe zmiany histologiczne w mózgu, takie jak kiełkowanie włókien mszystych27,28, nieprawidłowa migracja neuronów ziarnistych29, astrogliosis30, śmierć komórek neuronalnych w hipokampie31,32, oraz stwardnienie w hipokampie33. Podobne zmiany obserwuje się u zwierząt modelowych z padaczką. Wśród dostępnych metod, rozpalanie chemiczne za pośrednictwem PTZ jest dobrą, powtarzalną i niedrogą metodą tworzenia zwierzęcego modelu padaczki. W modelu SE za pośrednictwem pilokarpiny kontrola napadów jest trudna i wiele myszy umiera lub nie rozwija SE34. Natomiast śmiertelność i nasilenie napadów są bardziej kontrolowane w modelu PTZ. Ponadto PTZ jest tańszy niż kwas kainowy, a umiejętności w zakresie chirurgii mózgu myszy nie są wymagane do podawania leków.

<table><tbody><tr><td>Pentylenotetrazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>MANAC</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Mysz</td><td>CLEA Japan</td><td></td><td>C57Bl/6NJcl, po porodzie 8 tygodni,</td></tr><tr><td>strzykawka męska (1mL)</td>Igła <td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>(27G x 3/4") (0,40 x 19 mm)</td><td>Terumo</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler</td><td>PE2000</td><td>Ten produkt jest produktem wycofanym z rynku. Prawie odpowiednik FX-2000i z FXi-12-JA firmy A& Firma D.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>nacalai tesque</td><td>31511-05</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystatyczna</td><td>ATTO</td><td>SJ1211</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>nacalai tesque</td><td>30404-45</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Yamato</td><td>REM-700</td><td>Ten produkt jest produktem wycofanym z rynku. Prawie odpowiednik REM-710</td></tr><tr><td>Ostrze mikrotomu</td><td>Feather</td><td>S35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td> Przeciwciało antysynaptoporynowe <td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Układy synaptyczne</td><td>102 002</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ZnT3</td><td>Układy synaptyczne</td><td>197 002</td><td></td></tr><tr><td>anty-doublecortin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8066</td><td>Ten produkt jest produktem wycofanym z rynku. Nie testowaliśmy równoważnego produktu (sc-271390).</td></tr><tr><td>Kontekstowy aparat do badania dyskryminacji strachu</td><td>O'hara Trzykomorowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>aparat testowy</td><td>Muromachi</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenotetrazol (PTZ) jest antagonistą receptora GABA-A. Dootrzewnowe wstrzyknięcie PTZ zwierzęciu wywołuje ostry, ciężki napad padaczkowy po podaniu dużej dawki, podczas gdy sekwencyjne wstrzyknięcia dawki poddrgawkowej stosowano do opracowania chemicznej podpałki, modelu padaczki. Pojedyncze wstrzyknięcie PTZ w małej dawce wywołuje łagodny napad bez drgawek. Jednak powtarzające się wstrzyknięcia PTZ w małych dawkach obniżają próg wywołania napadu konwulsyjnego. Wreszcie, ciągłe podawanie małych dawek PTZ wywołuje ciężki napad toniczno-kloniczny. Metoda ta jest prosta i ma szerokie zastosowanie w badaniu patofizjologii padaczki, która jest definiowana jako choroba przewlekła, która obejmuje powtarzające się napady. Ten protokół rozpalania chemicznego powoduje powtarzające się napady padaczkowe u zwierząt. Za pomocą tej metody oszacowano podatność na napady za pośrednictwem PTZ lub stopień nasilenia napadów padaczkowych. Te zalety doprowadziły do zastosowania tej metody do badań przesiewowych leków przeciwpadaczkowych i genów związanych z padaczką. Ponadto metoda ta została wykorzystana do zbadania uszkodzeń neuronów po napadach padaczkowych, ponieważ zmiany histologiczne obserwowane w mózgach pacjentów z padaczką pojawiają się również w mózgach zwierząt poddanych działaniu substancji chemicznych. W związku z tym protokół ten jest przydatny do wygodnego tworzenia zwierzęcych modeli padaczki.

Wielokrotne wstrzyknięcia PTZ wywołują wzrost nasilenia napadów. Sześć myszy C57BL/6 otrzymało PTZ, a kolejne 6 myszy otrzymało sól fizjologiczną w ramach grupy kontrolnej. Dawka PTZ wynosiła 35 mg/kg i wykonano 10 iniekcji. Wynik nasilenia napadów stopniowo wzrastał wraz z iniekcjami PTZ, podczas gdy wstrzyknięcia soli fizjologicznej nie wywołały napadów ani nieprawidłowych zachowań (Rycina 2). Analiza ANOVA z późniejszym testem Bonferroniego wykazała istotn...

Ten protokół opisuje metodę chemicznego rozpalania pentylenotetrazolu i dostarcza mysi model padaczki. Protokół ten może być również wykorzystany do badania podatności na indukcję i patogenezę napadów padaczkowych po napadach padaczkowych u myszy.

Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Ta metoda może pomóc w głębokiej analizie padaczki. Napad wywoła zmiany histologiczne w mózgu, które mogą być zaangażowane w neuropsychiatryczne zaburzenia rozwojowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że samodzielna dawka PTZ może wywoływać kontrolowane napady lepiej niż inne obecne metody.Przygotowanie wstrzyknięcia należy rozpocząć od rozpuszczenia 2 miligramów na mililitr PTZ w sterylnym 0,9% chlorku sodu. Zważ zwierzę, a następnie umieść je w komorze obserwacyjnej na 3-minutowy okres przyzwyczajenia. Następnie wstrzyknąć PTZ międzyotrzewnowo za pomocą 1-mililitrowej strzykawki przymocowanej do igły o rozmiarze 27 w lewą lub prawą ćwiartkę brzucha zwierzęcia.Na koniec obserwuj zwierzę po wstrzyknięciu PTZ pod kątem nieprawidłowego zachowania. Uzyskaj co najmniej dwie myszy SV w wieku od dwóch do sześciu miesięcy, które są tej samej płci co badane myszy, aby być obcą myszą. Każda obca mysz musi być trzymana osobno.Podczas każdej sesji treningowej pozostaw mysz w klatce w celu przyzwyczajenia się przez 15 minut. Wyczyść całe urządzenie w obu klatkach, przecierając powierzchnię 70% etanolem. Następnie umieść puste klatki w dwóch bocznych komorach aparatu trzykomorowego i otwórz drzwi między komorami.Aby przyzwyczaić badaną mysz, umieść ją w środkowej komorze i pozwól myszy swobodnie poruszać się po urządzeniu, dopóki mysz nie zbada obu klatek, plus dodatkowe pięć minut. Po tym, jak zwierzę przejdzie do środkowej komory, zamknij drzwi i pozwól myszy swobodnie poruszać się w środkowej komorze przez pięć minut. W tym okresie umieść jedną ze 129 myszy SV w klatce, aby przyzwyczaić się do klatki.Natychmiast po okresie przyzwyczajenia badanej myszy, umieść klatkę zawierającą mysz 129 SV, zwaną klatką Obcego Jednego, w jednej z bocznych komór i umieść pustą klatkę, zwaną klatką Obiektu, w drugiej bocznej komorze. Otwórz drzwi i monitoruj zachowanie myszy obiektu. Pozwól badanej myszy poruszać się swobodnie przez 10 minut i zapisz cztery parametry behawioralne.Po pierwsze, czas spędzony w każdej komnacie, komorze Stranger One, komorze Obiektu i komnacie środkowej. Po drugie, czas spędzony na badaniu każdej klatki, klatki Stranger One i klatki Obiektu. Numer trzy, liczba wejść do każdej komnaty, a numer cztery, całkowita przebyta odległość.Gdy mysz przejdzie do środkowej komory, zamknij drzwi. Po wyczyszczeniu klatek rozpocznij analizę nowości społecznych, umieszczając kolejną mysz 129 SV w jednej z klatek, zwanej klatką Stranger Two, i umieść klatkę Stranger Two w jednej z komór. Umieść mysz Stranger One w drugiej klatce, zwanej klatką Stranger One i umieść klatkę Stranger One w drugiej komorze.Na koniec otwórz drzwi i monitoruj zachowanie myszy obiektu. Pozwól badanej myszy poruszać się swobodnie przez 10 minut i mierz te same parametry behawioralne, które opisano w analizie społecznej. Zacznij od umieszczenia myszy w aparacie kondycjonującym z określonymi warunkami.Na przykład kwadratowe urządzenie z przezroczystymi ściankami z pleksiglasu, metalową siatką podłogową, zapachem etanolu, jasnością 100 luksów i białym szumem tła 65 decybeli. Kondycjonuj mysz za pomocą wstrząsu stopy z pseudolosowym czasem 0,1 miliampera wstrząsów elektrycznych przez dwie sekundy trzy razy w ciągu pięciu minut. Następnie po kondycjonowaniu umieść mysz z powrotem w klatce domowej.Dzień po kondycjonowaniu przeprowadź ocenę pamięci, umieszczając mysz w tym samym urządzeniu, co w stanie szoku i mierząc czas zamrażania w ciągu pięciu minut. Później tego samego dnia umieść mysz w nowatorskim aparacie i zmierz czas zamrażania podczas pięciominutowej oceny. Na koniec porównaj czas zamarzania między tym samym stanem a nowym stanem.Wyniki wykazały, że wynik napadu stopniowo wzrastał po wstrzyknięciach PTZ, podczas gdy zastrzyki z soli fizjologicznej nie wywoływały żadnych napadów ani nieprawidłowych zachowań. Co więcej, powtarzające się napady sprzyjały nieprawidłowemu tworzeniu się gałęzi aksonalnych lub kiełkowaniu włókien omszałych i nieprawidłowej migracji komórek ziarnistych w hipokampie. Myszy leczone PTZ wykazywały normalne kontakty społeczne.Myszy spędzały więcej czasu w komorze Stranger One niż w komorze Object i badały klatkę Stranger One więcej niż badały klatkę Object. Myszy leczone PTZ wykazywały nienormalną nowość społeczną, co wskazuje na upośledzenie pamięci społecznej. Myszy leczone PTZ wykazywały również upośledzoną pamięć w kontekstowym teście strachu.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak labirynt wodny Morrisa lub inne testy pamięci, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące upośledzonej zdolności pamięci, na którą wpływa napad padaczkowy. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się padaczką do zbadania mechanizmu neuropsychiatrycznych zaburzeń rozwojowych wywołanych napadami padaczkowymi przy użyciu modelowych zwierząt.

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film przedstawia procedurę wywoływania stanu padaczkowego (SE) u myszy poprzez systemowe podawanie pilokarpiny w celu modelowania padaczki skroniowej.

Leczenie układowe pilokarpiny: mysi model padaczki skroniowej

Ten film pokazuje procedurę wywoływania napadów wywołanych ciepłem u transgenicznej myszy z mutacjami genów związanymi z padaczką poprzez stopniowe zwiększanie temperatury ciała w kontrolowanej komorze. Protokół ten służy do badania mechanizmów napadów i potencjalnych terapii padaczki.

Wyzwalanie i monitorowanie napadów padaczkowych wywołanych ciepłem w transgenicznym modelu myszy

Ten film pokazuje proces wywoływania padaczki u myszy za pomocą zastrzyków z pentylenotetrazolu (PTZ), antagonisty receptora GABA-A. Wielokrotne dootrzewnowe podawanie PTZ stopniowo obniża próg drgawkowy poprzez hamowanie napływu jonów chlorkowych, zakłócanie hamowania neurotransmisji i prowadzenie do nadpobudliwości neuronów, które wywołują drgawki. Proces ten prowadzi do rozpalenia i rozwoju napadów samoistnych, naśladujących przewlekłą padaczkę.

Ustalenie modelu napadów padaczkowych indukowanych pentylenotetrazolem u myszy

Źródło: Shandra, O. et al., Wywoływanie padaczki pourazowej w mysim modelu powtarzalnego rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu.  J. Vis. Exp.

Technika wywoływania napadów pourazowych w modelu mysim za pomocą urazu urazowego spowodowanego spadkiem masy ciała

Transgeniczne i nokautujące mysie modele chorób neurologicznych są przydatne do badania roli genów w prawidłowej i nieprawidłowej neurofizjologii. W artykule opisano metodologie, które można wykorzystać do badania długotrwałego wzmocnienia, mechanizmu komórkowego, który może leżeć u podstaw uczenia się i pamięci, w transgenicznych i nokautujących, swobodnie zachowujących się mysich modelach neuropatologii.

Długotrwałe nasilenie synapsy zakrętu perforacyjnego i zębatego u swobodnie zachowujących się myszy

Ten artykuł demonstruje skuteczność akupunktury, modeli epilepsji i analizy snu u gryzoni. Opisano procedurę akupunktury i identyfikację punktów akupunkturowych. Pilokarpina lub pentylenotetrazol (PTZ) jest stosowany w celu wywołania padaczki. Do analizy snu wykorzystuje się elektrokortykogram (ECoG), elektromiogram (EMG), temperaturę mózgu i zapisy aktywności lokomotorycznej.

Manipulacja elektrokortykogramem padaczkowym (ECoG) i snem u szczurów i myszy za pomocą akupunktury

Ten systematyczny protokół opisuje nowy zwierzęcy model padaczki pourazowej po powtarzającym się łagodnym urazowym uszkodzeniu mózgu. Pierwsza część szczegółowo opisuje etapy indukcji urazowego uszkodzenia mózgu przy użyciu zmodyfikowanego modelu spadku masy ciała. Druga część zawiera instrukcje dotyczące podejścia chirurgicznego dla jedno- i wielokanałowych systemów akwizycji danych elektroencefalograficznych.

Wywoływanie padaczki pourazowej w mysim modelu powtarzalnego rozlanego urazowego uszkodzenia mózgu

Ten raport opisuje metody generowania modelu padaczki skroniowej na podstawie elektrycznego rozpalenia transgenicznych myszy VGAT-Cre. Rozpalone myszy VGAT-Cre mogą być przydatne w określaniu, co powoduje padaczkę i w badaniach przesiewowych nowych terapii.

Przygotowanie i wszczepienie elektrod dla elektrycznie zapalających myszy VGAT-Cre w celu wygenerowania modelu padaczki skroniowej

Ciało migdałowate odgrywa kluczową rolę w padaczce skroniowej, która wywodzi się z tej struktury i z niej się rozprzestrzenia. Ten artykuł zawiera szczegółowy opis wytwarzania głębokich elektrod mózgowych z funkcjami zarówno rejestrującymi, jak i stymulującymi. Wprowadza model padaczki przyśrodkowego płata skroniowego wywodzącej się z ciała migdałowatego.

Użycie elektrody bipolarnej do stworzenia mysiego modelu padaczki skroniowej poprzez elektryczne rozppalenie ciała migdałowatego

Protokół wprowadza innowacyjną metodę analizy i wizualizacji zachowań związanych z napadami padaczkowymi wywołanymi pentylenotetrazolem u myszy. Podejście to wykracza poza tradycyjne wyniki Racine'a, zapewniając bardziej wszechstronną ocenę różnorodności i temporalnej dynamiki zachowań ICTAL.

Charakterystyka behawioralna napadów wywołanych pentylenotetrazolem: wyjście poza skalę Racine'a

Poznaj metodę chemicznego rozpałkowania pentylenotetrazolem w myszach 129 SV do badania epilepsji. Technika umożliwia kontrolowane wywoływanie napadów i analizę zmian behawioralnych oraz neuropsychiatrycznych.

Model rozpałki indukowany pentylenotetrazolem

Przeglądaj więcej filmów