Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych
23 lutego 2018
Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.
Ogólnym celem tej metodologii jest pozyskanie i analiza dynamiki dużej populacji przylegających komórek monitorowanych za pomocą bezsoczewkowej mikroskopii wideo. Uważamy więc, że ta technika jest interesująca w wielu dziedzinach biologii i do badania proliferacji komórek, zapalenia pęcherza moczowego komórek, badań przesiewowych leków lub monitorowania różnych procesów biologicznych. Więc ta technika jest wolna od etykiet i jest bardzo prosta.
Ale jest bardzo skuteczny w badaniu dużych populacji komórek. Cóż za pomysł na tę metodę, kiedy przenieśliśmy się z dziedziny wykrywania bakterii na dziedzinę obrazowania komórek ssaków. Wtedy przydało się, że biolog, będą potrzebowali poklatkowego pobrania obwodu bezpośrednio do inkubatora.
Następnie zbudowaliśmy niestandardowy mikroskop wideo bez soczewek, który jest kompatybilny z inkubatorem, a także opracowaliśmy algorytm rekonstrukcji holograficznej, aby uzyskać obraz tysięcy komórek, które są obecne w bardzo dużym polu widzenia. Rozpocznij tę procedurę od pokrycia 6-dołkowej szklanej płytki dolnej fibronektyną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po 1 godzinie usuń nadmiar fibronektyny i wypłucz 6-dołkową szklaną płytkę dolną PBS.
W tej demonstracji wykorzystano komórki Hela wyhodowane w DMEM, plus pożywkę glutaminową, uzupełnione 10% ciepłem w aktywowanej płodowej surowicy cielęcej oraz 1% penicyliną i streptomycyną. Wysiewaj dwadzieścia tysięcy komórek na płytkę hodowlaną. Ważne jest, aby używać pojemnika ze szklanym dnem.
Za jakość akwizycji bez soczewek. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze na górze wideomikroskopu bez soczewek. Bezsoczewkowy mikroskop wideo używany do tej akwizycji poklatkowej jest dostępny na rynku.
Posiada półprzewodnikowy czujnik obrazu z tlenku metalu o obszarze obrazowania 29,4 milimetra kwadratowego i rozstawie pikseli 1,67 mikrometra. Oświetlenie o wielu długościach fali jest zapewniane przez wielochipową diodę elektroluminescencyjną umieszczoną nad otworkiem o średnicy 150 mikrometrów w odległości około 5 centymetrów od ogniw. Przed rozpoczęciem akwizycji poklatkowej ważne jest, aby sprawdzić, czy na pokrywie nie ma kondensacji.
Ponieważ kondensacja pogorszy jakość obrazu akwizycji. Jeśli na pokrywie płytki hodowlanej wystąpiła kondensacja, wyczyść pokrywę. Steruj mikroskopem wideo bez soczewek za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do akwizycji.
Który wykonuje zarówno akwizycję poklatkową, jak i rekonstrukcję holograficzną. Wprowadź wymagane parametry wejściowe w interfejsie oprogramowania. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 1 akwizycję co 10 minut, typ kultury komórkowej na przylegającą, a czas trwania eksperymentu na 3 dni.
Rozpocznij akwizycję poklatkową. Zdjęcie przedstawia przykład pełnego pola widzenia akwizycji raw w kanale niebieskim na obszarze 29,4 milimetra kwadratowego w jednej klatce. Panel B jest szczegółem panelu A, a panel C jest szczegółem panelu B. Algorytm rekonstrukcji holograficznej automatycznie przetworzy akwizycję bez soczewki, aby uzyskać obraz fazowy hodowli komórkowej.
Pokazany jest przykładowy obraz komórek przed rozpakowaniem fazy, a następnie obraz po rozpakowaniu fazy. Śledzenie komórek odbywa się za pomocą algorytmu TrackMate, wtyczki Fidżi o otwartym kodzie źródłowym do automatycznego śledzenia pojedynczych cząstek. Po załadowaniu, pełnym akwizycji poklatkowej na Fidżi i skonfigurowaniu algorytmów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, ustaw parametry wejściowe.
Ustaw szacowaną średnicę plamki na 15 pikseli, próg detektora na 0,25, maksymalną odległość łączenia na 15 pikseli, maksymalną odległość zamykania przerwy na 15 pikseli, a liczbę punktów na ścieżce na 3,5. Pierwszym krokiem w algorytmie śledzenia komórek jest wykrycie komórek w akwizycji bez soczewki. Wyświetlane są wyniki algorytmu śledzenia komórek, przy czym wszystkie ścieżki komórek są wyświetlane w ponad pięćdziesięciu klatkach, czyli około 8 godzin.
Z kodem kolorystycznym odpowiadającym medianie prędkości. Dolny panel to szczegółowy obraz żółtego prostokąta z górnego panelu. Reprezentatywny klip wideo ze śledzenia komórek jest pokazany tutaj.
Pod koniec procesu śledzenia komórek wybierz przycisk analizy, aby wygenerować wyniki w postaci 3 plików tekstowych. Na podstawie tych danych przeprowadza się segmentację komórek i wykrywa podziały komórek za pomocą dedykowanych algorytmów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym i plikach kodu dodatkowego. Kompilacja wszystkich pomiarów pojedynczych komórek w pełnej akwizycji poklatkowej tworzy wykresy punktowe kilku metryk w funkcji czasu.
Całkowita liczba komórek w pełnym polu widzenia wzrasta z dwóch tysięcy do piętnastu tysięcy w ciągu 2,7 dnia. Pomnożone przez liczbę punktów czasowych prowadzi to do dużego zestawu danych wykrytych komórek. Każdy z nich charakteryzuje się współrzędnymi i cechami morfologicznymi, takimi jak sucha masa, powierzchnia, średnia grubość, główna długość dostępu i współczynnik kształtu.
Połączenie algorytmów śledzenia i segmentacji komórek umożliwia pomiary kinetyczne na poziomie pojedynczej komórki. Ten przykład pokazuje analizę ścieżki komórki trwającą około sześćdziesięciu sześciu godzin i wykazującą 4 podziały komórek w punktach czasowych zakreślonych na żółto. W funkcji czasu obliczono kilka wskaźników: powierzchnię komórki, suchą masę, średnią grubość i ruchliwość komórki.
Rozkład czasu trwania cyklu komórkowego dla 2,7-dniowej obserwacji był zbliżony do agouzowskiego. Średnio 16,5 godziny. Długości cykli komórkowych, mierzone automatycznie, są dobrze skorelowane z tymi mierzonymi ręcznie.
Zbadano również inne parametry, takie jak początkowa sucha masa komórki, końcowa sucha masa oraz średnie tempo wzrostu podczas cyklu komórkowego. Po opanowaniu, pełna analiza danych akwizycji poklatkowej może zostać wykonana w ciągu kilku godzin, w zależności od konfiguracji procesora i wydajności sprzętu. Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby dokładnie określić początkowe stężenie komórek.
Jeśli początkowe stężenie komórek jest zbyt duże, algorytm śledzenia komórek nie będzie w stanie prawidłowo zdefiniować trajektorii komórek. Ale jeśli stężenie komórek jest zbyt niskie, statystyki pełnej analizy również będą zbyt niskie. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić zautomatyzowane analizy śledzenia komórek, aby odpowiedzieć na inne pytania z dziedziny: biologii, biologii podstawowej lub chemotaksji.
Ta nowa technika toruje również drogę do monitorowania linii komórkowych, która, miejmy nadzieję, przyniesie interesujące informacje na temat cyklu komórkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić akwizycję poklatkową za pomocą mikroskopii wideo bez soczewek i jak analizować dużą populację komórek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia metodologię wykorzystującą bezsoczewkową mikroskopię wideo do monitorowania hodowli komórkowych bezpośrednio wewnątrz inkubatora. Protokół ten umożliwia pozyskiwanie i analizę obszernych zbiorów danych dotyczących morfologii komórek oraz dynamiki cyklu komórkowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Techniki mikroskopowe
- Badania proliferacji komórek
Wprowadzenie
- Bezsoczewkowa mikroskopia wideo jest bezetykietową techniką obrazowania.
- Umożliwia ona akwizycję obrazów kultur komórkowych w trybie poklatkowym.
- Metoda ta jest skuteczna w badaniu dużych populacji komórek adherentnych.
- Znajduje zastosowanie w różnych dziedzinach biologii, w tym w badaniach przesiewowych leków.
Cel badania
- W celu pozyskania i analizy dynamiki dużych populacji komórek adherentnych.
- W celu zapewnienia prostej, a zarazem skutecznej metody monitorowania zachowania komórek.
- W celu ułatwienia badań nad proliferacją komórek oraz innymi procesami biologicznymi.
Zastosowane metody
- Bezosadnikowa wideomikroskopia do obrazowania.
- Akwizycja obrazów z odstępami czasowymi (time-lapse) hodowlanych komórek HeLa.
- Analiza morfologii pojedynczych komórek.
- Śledzenie dynamiki cyklu komórkowego przez 2,7 dnia.
Główne wyniki
- Pozyskanie zbioru danych zawierającego 2,2 x 106 pomiarów.
- Śledzenie 10 584 przebiegów cyklu komórkowego.
- Wykazanie skuteczności mikroskopii bezsoczewkowej w badaniach komórkowych.
- Wnioski dotyczące proliferacji i zachowania komórek w kontrolowanym środowisku.
Wnioski
- Mikroskopia wideo bezsoczewkowa jest cennym narzędziem w badaniach z zakresu biologii komórki.
- Metodologia ta umożliwia szeroko zakrojone gromadzenie danych na temat dynamiki komórek.
- Technika ta może usprawnić badania w różnych zastosowaniach biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezosadnicza mikroskopia wideo umożliwia wysokoprzepustowe, ilościowe monitorowanie przylegających kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorach, wspierając dynamiczną analizę proliferacji i morfologii komórek w rozdzielczości pojedynczych komórek. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną we wczesnych etapach odkrywania leków i opracowywania testów poprzez generowanie wielkoskalowych, rozdzielczych w czasie zbiorów danych. Podejście to jest strategicznie ukierunkowane na usprawnienie podejmowania decyzji w kluczowych punktach zwrotnych w procesach badawczo-rozwojowych (R&D) w sektorze biofarmaceutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach nad biofarmaceutykami&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia analizę kinetyczną tysięcy pojedynczych komórek w celu zbadania proliferacji i dynamiki cyklu komórkowego.
- Wspiera funkcjonalną walidację hipotez biologicznych poprzez ilościowe, podłużne śledzenie pojedynczych komórek.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ujawnianie heterogeniczności w zachowaniu komórek i wzorcach podziałów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia standaryzowane obrazowanie bez znakowania do powtarzalnego monitorowania kultur komórkowych w procesach przesiewowych.
- Generuje ilościowe wyniki morfologiczne i kinetyczne, odpowiednie do optymalizacji i walidacji testów.
- Umożliwia skalowalną, zautomatyzowaną akwizycję danych dla zastosowań w wysokoprzepustowym przesiewaniu treści (high-content screening).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostarcza zestawów danych rozdzielczych w czasie, które mogą wspomagać odkrywanie biomarkerów translacyjnych w przypadku dopasowania do modeli istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, umożliwiając solidną, ilościową analizę zachowania komórek.
- Zmniejsza niepewność biologiczną przy wyborze modelu przedklinicznego dzięki szczegółowym pomiarom linii komórkowych i proliferacji.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejsza metoda wpisuje się w kontinuum od odkrycia do fazy przedklinicznej, umożliwiając bezpośrednią, ilościową obserwację hodowli komórkowych, co wspiera zarówno testowanie hipotez, jak i przygotowanie testów analitycznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia analizę kinetyki proliferacji i podziału komórek w oparciu o postawione hipotezy.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do opracowywania testów i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Dostarcza wielkoskalowe zestawy danych z obrazowania poklatkowego (time-lapse) do statystycznego porównywania warunków doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Stwarza potencjał do dopasowania biomarkerów w przypadku zastosowania w systemach istotnych dla przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną platformę obrazowania bez użycia znaczników, którą można dostosować do wielu programów badawczo-rozwojowych (R&D).
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na komórkach.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, odtwarzalność i skalowalność procesów monitorowania komórek.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie wiarygodnych danych ilościowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój zasobów badawczych i przedklinicznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek, obrazowaniu time-lapse oraz analizie obliczeniowej.
- Zależne od dostępu do sprzętu do bezsoczewkowej mikroskopii wideo oraz kompatybilnego oprogramowania analitycznego.
- Wymaga standaryzacji parametrów akwizycji i przepływów przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych typów komórek adherentnych, lecz wrażliwa na początkową koncentrację komórek i warunki hodowli.
- Przepustowość analizy danych jest zależna od infrastruktury obliczeniowej i wydajności sprzętowej.
