Name: Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj bezsoczewkową mikroskopię wideo do dynamicznej analizy przylegających kultur komórkowych HeLa. Ta metoda umożliwia śledzenie cyklu komórkowego i proliferacji w inkubatorze.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają nic do potwierdzenia.

1. Pozyskiwanie danych z monitorowania hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Hodować komórki HeLa w DMEM + glutamina (np.pożywkę (GlutaMAX) uzupełnioną o 10% (v/v) inaktywowaną termicznie płodową surowicę cielęcą oraz 1% penicyliny i streptomycyny.</li>
	<li>Powlekamy szklane płytki kultur 6-dołkowe fibronektyną (25 &#181;g/mL) przez 1 h. Następnie wysiej 2 x 104 komórek na studzienkę.</li>
	<li>W czasie akwizycji wymieniaj pożywkę co 3 dni.</li>
	<li>Do akwizycji time-lapse należy użyć bezsoczewkowego mikroskopu wideo (dostępnego w sprzedaży). 
	UWAGA: Metoda ta opiera się na technice bezsoczewkowej obrazowania obliczeniowego opisanej przez Ozcana i wsp.16 który został zmodyfikowany w celu prowadzenia ciągłego monitorowania w inkubatorze w kontrolowanej temperaturze 37 &#176;C12,15Wyposażono go w sensor obrazu CMOS (complementary metal oxide semiconductor) o rozmiarze piksela wynoszącym 1.67 &#181;m oraz obszar obrazowania o wymiarach 6,4 x 4,6 mm2Oświetlenie wielodługościowe jest zapewniane przez wieloźródłowe urządzenie z diodami emitującymi światło (LED), które dostarcza światło czerwone, zielone i niebieskie. Długości fal są odpowiednio centrowane na 636, 521 i 452 nm, przy szerokości pasma widmowego wynoszącej odpowiednio 25, 45 i 25 nm. Diody LED w kolorach czerwonym, zielonym i niebieskim (RGB) znajdują się powyżej 150 &#181;m otwór zastawkowy w odległości około 5 cm od komórek. Moc światła mierzona w pobliżu diody LED jest tak niska, że 10 &#181;W przy każdej długości fali, a czas naświetlania wynosi zaledwie jedną sekundę na jedną akwizycję. W związku z tym nie przewiduje się problemów z fototoksycznością podczas obserwacji kultur komórkowych za pomocą bezsoczewkowego mikroskopu wideo.</li>
	<li>Umieść naczynie z hodowlą komórkową w kontakcie z sensorem CMOS (Rysunek 1). Należy użyć naczynia z szklaną lamelką na dnie, co jest istotne dla jakości obrazowania bezsoczewkowego. Można stosować również naczynia plastikowe, jednak jakość obrazowania bezsoczewkowego ulegnie pogorszeniu ze względu na niskie właściwości optyczne takich naczyń.</li>
	<li>Sterowanie mikroskopem bezsoczewkowym odbywa się za pomocą oprogramowania do akwizycji (dostępnego w sprzedaży), które realizuje zarówno akwizycję time-lapse, jak i rekonstrukcję holograficzną. Parametrami, które użytkownik musi wprowadzić w interfejsie oprogramowania, są: częstotliwość klatek, czas trwania eksperymentu oraz rodzaj hodowli komórkowej, t. j. komórki adherentne lub komórki w zawiesinie.</li>
	<li>Skonfiguruj parametry wejściowe oprogramowania akwizycyjnego. Ustaw częstotliwość klatek na jedną akwizycję co 10 minut oraz ustaw typ hodowli komórkowej na „adherent”. 
	UWAGA: Częstotliwość obrazowania wynosząca jedna akwizycja co 10 minut stanowi optymalny kompromis, ponieważ zapewnia niezawodne śledzenie komórek, podczas gdy rozmiar otrzymanego zbioru danych do analizy pozostaje na rozsądnym poziomie. Najwyższa częstotliwość obrazowania możliwa do osiągnięcia w tej konfiguracji mikroskopii bezsoczewkowej to jedna akwizycja co 5 minut. Dalsze zwiększanie częstotliwości obrazowania prowadzi do nadmiernego nagrzewania się sensora CMOS, co może negatywnie wpłynąć na żywotność hodowanych komórek.</li>
	<li>Rozpocznij akwizycję poklatkową, a algorytm rekonstrukcji holograficznej (dostępny komercyjnie) automatycznie przetworzy dane z akwizycji bezsoczewkowej, aby uzyskać obraz fazowy hodowli komórkowej. Algorytm rekonstrukcji holograficznej opiera się na wielodługościowym algorytmie odzyskiwania fazy.17 or dostarcza zrekonstruowany w kolorach RGB obraz fazy w zakresie [-&#960;, +&#960;] dla każdej pojedynczej komórki w szerokim polu widzenia o rozmiarze 29,4 mm2Zasadą bezsoczewkowej holografii w linii (in-line) jest oświetlenie cienkiej próbki (w z=0) falą płaską (o amplitudzie 1 po normalizacji) i rejestracja na sensorze CMOS powstałego w wyniku dyfrakcji obrazu intensywności w krótkiej odległości z=Z, zazwyczaj 1 mm za próbką. W naszej konfiguracji oświetlenie jest sekwencyjnie przełączane na 3 długości fal (&#955;1=0.450 &#181;m, &#955;2=0.540 &#181;m, &#955;3=0.647 &#181;m) w celu pomiaru trzech dyfraktogramów tej samej próbki.</li>
</ol>
2. Analiza danych z hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Do śledzenia komórek należy użyć algorytmu Trackmate, będącego otwartoźródłową wtyczką do programu Fiji, służącą do zautomatyzowanego śledzenia pojedynczych cząstek18. W pierwszej kolejności należy załadować pełną sekwencję obrazów time-lapse do programu Fiji (komenda load image sequence). Ze względu na duży rozmiar zbiorów danych, które zazwyczaj obejmują 400 klatek RGB o rozmiarze 29,7 Mb, szybciej jest załadować je w formacie 8-bitowym. Następnie wtyczka Trackmate w programie Fiji prowadzi użytkownika przez kilka etapów algorytmu śledzenia komórek, mianowicie etap detekcji komórek, etap śledzenia komórek oraz kilka filtrów stosowanych do detekcji komórek i obliczonych ścieżek. Na każdym etapie należy skonfigurować algorytmy i niezwłocznie wyświetlić wyniki, aby w razie potrzeby można było łatwo nawigować w przód i w tył w celu ponownego dostrojenia ustawień. Różne menu interfejsu Trackmate przedstawiono na Ryc. 2 wraz z rzeczywistymi ustawieniami zastosowanymi w eksperymencie z komórkami HeLa.</li>
	<li>Parametry wejściowe oprogramowania akwizycyjnego należy ustawić w następujący sposób (patrz Ryc. 2). Ustawić szacowaną średnicę plamy (estimated blob diameter) na 15 pikseli, próg detektora (detector threshold) na 0,25, maksymalną odległość łączenia (linking maximum distance) na 15 pikseli, maksymalną odległość zamykania luk (gap-closing max distance) na 15 pikseli oraz liczbę punktów na ścieżkę (number of spots in tracks) na 3,5. 
	UWAGA: Ustawienia te będą się oczywiście różnić w zależności od eksperymentu, zwłaszcza „szacowana średnica plamy”, która odpowiada rozmiarowi komórki (tutaj podana w pikselach o wartości 1,67 µm). Ta sama uwaga dotyczy „maksymalnej odległości łączenia”, która uwzględnia maksymalną odległość pokonaną przez komórkę w ciągu dwóch kolejnych klatek (tutaj podana w pikselach o wartości 1,67 µm). Jej optymalna wartość zależy od mobilności komórek, ale także od ich gęstości.</li>
	<li>Po zakończeniu procesu śledzenia komórek należy wygenerować wyniki w postaci trzech plików tekstowych (przycisk „Analysis”, patrz Ryc. 2). Najbardziej użyteczny plik o nazwie „Spots in tracks statistics” zawiera tabelę z listą wszystkich wykrytych komórek wraz z ich odpowiednimi pozycjami (x,y) w akwizycji, numerem klatki i numerem ścieżki. Na podstawie tych danych należy przeprowadzić segmentację komórek i wykryć podziały komórkowe przy użyciu dedykowanych algorytmów (patrz uzupełniające pliki z kodem). Dwa pozostałe pliki nazywają się „Links in tracks statistics” oraz „Track statistics” i zawierają wszystkie wyniki dotyczące ścieżek, np. czas trwania ścieżki, liczbę wykrytych luk, początkową klatkę ścieżki itp.</li>
	<li>Należy użyć algorytmu segmentacji komórek (patrz uzupełniający plik z kodem), aby automatycznie wyodrębnić z zrekonstruowanego obrazu fazowego kilka parametrów opisujących morfologię komórek. Parametrami tymi są powierzchnia komórki (S), długość osi głównej komórki (L), długość osi mniejszej komórki (l) oraz współczynnik kształtu komórki (L/l). Faza odzyskana z mikroskopii bezsoczewkowej jest proporcjonalna do gęstości i grubości warstwy preparatu, jak omówiono wcześniej15.</li>
	<li>Oprócz cech morfologicznych komórki należy wyodrębnić ilościowe pomiary suchej masy komórki (CDM) z zrekonstruowanej fazy13,19,20 
	<img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq1v3.jpg" />&#160;Równ. (1) 
	gdzie&#160;φ(x,y) jest zrekonstruowanym przesunięciem fazowym19, λ to długość fali, a&#160;α = 1,8 x 10-4 m3/kg to specyficzny współczynnik załamania, który wiąże zmienność współczynnika załamania z suchą masą1,19.</li>
	<li>Grubość komórki należy ocenić, szacując różnicę między współczynnikiem załamania światła komórki a współczynnikiem załamania medium hodowlanego. Zależność między grubością komórki h(x,y) a zmierzonym przesunięciem fazowym jest określona przez20: 
	<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq2v3.jpg" />&#160;Równ. (2.1) 
	<img alt="Równanie 3" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq3v3.jpg" />Równ. (2.2) 
	gdzie&#160;Δn(x,y) = ncell (x,y) - nmedium (x,y), czyli różnica współczynnika załamania między komórką a medium hodowlanym. W dalszej części przyjmuje się stałą wartość Δn = 0,025, oszacowaną na podstawie współczynnika załamania zmierzonego w jądrach komórek HeLa (n = 1,35511) oraz współczynnika załamania medium hodowlanego w postaci soli fosforanowo-buforowanej (PBS) (n = 1,33). Chociaż wartość grubości komórki ma charakter jedynie orientacyjny, ponieważ opiera się na założeniu, jej względne wahania są istotne i mogą być wykorzystane do wykrywania dzielących się komórek.</li>
	<li>Należy użyć dedykowanego algorytmu (patrz uzupełniający plik z kodem), aby wykryć wystąpienie podziałów komórkowych, a następnie wyodrębnić ścieżki komórek powiązane z wykrytymi podziałami. W celu wykrycia podziału komórki najpierw identyfikuje się komórki o zmierzonej grubości większej niż 8 µm, a następnie sprawdza, czy w bliskim sąsiedztwie przestrzennym i czasowym pojawia się nowa komórka. W ten sposób detekcja podziałów komórkowych opiera się na dwóch solidnych kryteriach. Alternatywne i bardziej rozbudowane metody wykrywania podziałów komórkowych można zastosować do bezsoczewkowej akwizycji time-lapse21,22,23.</li>
</ol>

<ol><li>Zangle, T. A., Teitell, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+mass+profiling%3A+an+emerging+approach+in+quantitative+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Live-cell mass profiling: an emerging approach in quantitative biophysics.</a> Nat Methods. 11 (12), 1221-1228 (2014).</li>
<li>Popescu, G., Park, K., Mir, M., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+technologies+for+measuring+single+cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">New technologies for measuring single cell mass.</a> Lab Chip. 14 (4), 646-652 (2014).</li>
<li>Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+massively+parallel+single-cell+drug+response+measurements+via+live+cell+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Rapid, massively parallel single-cell drug response measurements via live cell interferometry.</a> Biophys J. 101 (5), 1025-1031 (2011).</li>
<li>Mir, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 108 (32), 13124-13129 (2011).</li>
<li>Girshovitz, P., Shaked, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+cell+morphological+parameters+based+on+interferometric+phase+microscopy+and+their+application+to+cell+life+cycle+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Generalized cell morphological parameters based on interferometric phase microscopy and their application to cell life cycle characterization.</a> Biomed Opt Express. 3 (8), 1757-1773 (2012).</li>
<li>Kemper, B., Bauwens, A., Vollmer, A., Ketelhut, S., Langehanenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+cell+division+monitoring+of+endothelial+cells+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative cell division monitoring of endothelial cells by digital holographic microscopy.</a> J Biomed Opt. 15 (3), (2010).</li>
<li>Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+quantitative+imaging+for+monitoring+single+cancer+cell+growth+kinetics+and+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response.</a> PLoS One. 9 (2), 1-8 (2014).</li>
<li>Bon, P., Savatier, J., Merlin, M., Wattellier, B., Monneret, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+and+measurement+of+living+cell+morphometric+features+with+single-shot+quantitative+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Optical detection and measurement of living cell morphometric features with single-shot quantitative phase microscopy.</a> J Biomed Opt. 17 (7), (2012).</li>
<li>Aknoun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+cell+dry+mass+measurement+usinq+quantitative+phase+imaging+with+quadriwave+lateral+shearing+interferometry%3A+an+accuracy+and+sensitivity+discussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Living cell dry mass measurement usinq quantitative phase imaging with quadriwave lateral shearing interferometry: an accuracy and sensitivity discussion.</a> J Biomed Opt. 20 (1), 1-4 (2015).</li>
<li>Cotte, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+phase+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Marker-free phase nanoscopy.</a> Nature Photonics. 7 (2), 113-117 (2013).</li>
<li>Choi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Kesavan, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+monitoring+of+major+cell+functions+by+means+of+lensfree+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">High-throughput monitoring of major cell functions by means of lensfree video microscopy.</a> Sci Rep. 4, 1-11 (2014).</li>
<li>Zheng, G., Lee, S. A., Antebi, Y., Elowitz, M. B., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ePetri+dish%2C+an+on-chip+cell+imaging+platform+based+on+subpixel+perspective+sweeping+microscopy+%28SPSM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The ePetri dish, an on-chip cell imaging platform based on subpixel perspective sweeping microscopy (SPSM).</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (41), 16889-16894 (2011).</li>
<li>Pushkarsky, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+single-cell+motility+analysis+on+a+chip+using+lensfree+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Automated single-cell motility analysis on a chip using lensfree microscopy.</a> Sci Rep. 4, 4717(2014).</li>
<li>Allier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+dense+cell+cultures+by+multiwavelength+lens-free+video+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Imaging of dense cell cultures by multiwavelength lens-free video microscopy.</a> Cytom Part A. 91 (5), 1-10 (2017).</li>
<li>Su, T. -W., Seo, S., Erlinger, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+lensfree+imaging+and+characterization+of+a+heterogeneous+cell+solution+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-throughput lensfree imaging and characterization of a heterogeneous cell solution on a chip.</a> Biotechnol Bioeng. 102 (3), 856-868 (2009).</li>
<li>Delacroix, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+lens-free+microscopy%3A+a+new+tool+for+the+laboratory+diagnosis+of+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid lens-free microscopy: a new tool for the laboratory diagnosis of meningitis.</a> Sci Rep. 7, 39893(2017).</li>
<li>Tinevez, J. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+an+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2016).</li>
<li>Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am J Physiol Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).</li>
<li>Liu, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+for+cell+biology+and+disease+diagnosis%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index for cell biology and disease diagnosis: past, present and future.</a> Lab Chip. 16, 634-644 (2016).</li>
<li>Rapoport, D. H., Becker, T., Mamlouk, A. M., Schicktanz, S., Kruse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+validation+algorithm+allows+for+automated+cell+tracking+and+the+extraction+of+biologically+meaningful+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel validation algorithm allows for automated cell tracking and the extraction of biologically meaningful parameters.</a> PLoS One. 6 (11), e27315(2011).</li>
<li>Al-Kofahi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cell+lineage+construction%3A+A+rapid+method+to+analyze+clonal+development+established+with+murine+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Automated cell lineage construction: A rapid method to analyze clonal development established with murine neural progenitor cells.</a> Cell Cycle. 5 (3), 327-335 (2006).</li>
<li>Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I., van Cappellen, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+in+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking in cell and developmental biology.</a> Semin Cell Dev Biol. 20 (8), 894-902 (2009).</li>
<li>Posakony, J. W., England, J. M., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+growth+and+division+during+the+cell+cycle+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial growth and division during the cell cycle in HeLa cells.</a> J Cell Biol. 74 (2), 468-491 (1977).</li>
<li>Zocchi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+CD38+Increases+Intracellular+Calcium+Concentration+and+Reduces+Doubling+Time+in+HeLa+and+3T3+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of CD38 Increases Intracellular Calcium Concentration and Reduces Doubling Time in HeLa and 3T3 Cells.</a> J Biol Chem. 273 (14), 8017-8024 (1979).</li>
<li>Reitzer, L. J., Wice, B. M., Kennell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+glutamine%2C+not+sugar%2C+is+the+major+energy+source+for+cultured+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that glutamine, not sugar, is the major energy source for cultured HeLa cells.</a> J Biol Chem. 254 (8), 2669-2676 (1979).</li>
<li>Benedetti, A. D. E., Joshi-barve, S., Rinker-Schaeffer, C., Rhoads, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Antisense+RNA+against+Initiation+Factor+eIF-4E+mRNA+in+HeLa+Cells+Results+in+Lengthened+Cell+Division+Times%2C+Diminished+Translation+Rates%2C+and+Reduced+Levels+of+Both+eIF-4E+and+the+p220+Component+of+eIF-4F%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Antisense RNA against Initiation Factor eIF-4E mRNA in HeLa Cells Results in Lengthened Cell Division Times, Diminished Translation Rates, and Reduced Levels of Both eIF-4E and the p220 Component of eIF-4F.</a> Mol Cell Biol. 11 (11), 5435-5445 (1991).</li>
<li>Kumei, Y., Nakajima, T., Sato, A., Kamata, N., Enomoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+of+G1+phase+duration+and+enhancement+of+c-myc+gene+expression+in+HeLa+cells+at+hypergravity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Reduction of G1 phase duration and enhancement of c-myc gene expression in HeLa cells at hypergravity.</a> J Cell Sci. 93 (2), 221-226 (1989).</li>
<li>Ginzberg, M. B., Kafri, R., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+being+the+right+%28cell%29+size%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">On being the right (cell) size.</a> Science. 348 (6236), 1245075(2015).</li>
<li>Mathieu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+lens-free+imaging+of+cell+migration+in+diverse+physical+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Time-lapse lens-free imaging of cell migration in diverse physical microenvironments.</a> Lab Chip. 16 (17), 3304-3316 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule pokazujemy, że mikroskopia wideo bez soczewek może być używana w inkubatorze do uchwycenia kinetyki tysięcy komórek. Aby opisać ogólną metodologię, wyjaśniliśmy, w jaki sposób 2,7-dniowe nabycie komórek HeLa w kulturze może być analizowane za pomocą standardowych algorytmów śledzenia komórek. Rezultatem jest zestaw danych zawierający pomiary 2,2 x 106 komórek i 10 584 ścieżki cyklu komórkowego. Akwizycji dokonano na hodowli komórek Hela o stosunkowo dużej odległości między komórkami (gęstość kom...

Monitorowanie hodowanych komórek ssaków przez kilka cykli komórkowych i dokładne mierzenie wielkości komórek i suchej masy komórek jest trudnym zadaniem. Kilka technik optycznych bez etykiet jest w stanie wykonać to zadanie1,2: interferometria przesunięcia fazowego3, cyfrowa mikroskopia holograficzna (DHM)4,5,6,7, czterofalowa boczna interferometria ścinająca8,9 i Ilościowa tomografia fazowa<klasa SUP="XREF">10,<KLASA SUP="XREF">11. Metody te doprowadziły do wielu nowych spostrzeżeń na temat cyklu komórkowego komórek ssaków. Jednak rzadko są one sprzężone z algorytmami automatycznego śledzenia komórek, a ich przepustowość pozostaje ograniczona podczas pomiaru trajektorii masy komórek1 (N<20 w odpowiednio3,4,5,6). W związku z tym potrzebna jest nowatorska metoda optyczna do pomiaru trajektorii masy komórki z dużymi statystykami (N>1000).
W tym artykule demonstrujemy zdolność mikroskopii wideo bez soczewek do jednoczesnego obrazowania tysięcy komórek bezpośrednio w inkubatorze, a następnie ilościowego określania metryk pojedynczych komórek wzdłuż tysięcy indywidualnych ścieżek cyklu komórkowego. Mikroskopia bezsoczewkowa to ilościowa technika obrazowania fazowego, która pozwala na uzyskanie obrazu fazowego gęsto upakowanych komórek w bardzo dużym polu widzenia (zwykle kilkadziesiąt mm2, tutaj 29,4 mm2)12,13,14,15. Na poziomie pojedynczej komórki określanych jest kilka wskaźników, np. powierzchnia komórki, sucha masa komórki, grubość komórki, długość głównej komórki i współczynnik proporcji komórki12,15, z każdego obrazu. Następnie, stosując algorytm śledzenia komórek, cechy te można wykreślić dla każdej pojedynczej komórki jako funkcję czasu eksperymentu14,15. Ponadto, wykrywając występowanie podziałów komórkowych w ścieżkach komórkowych, możliwe jest wyodrębnienie innych ważnych informacji, takich jak początkowa sucha masa komórki (tuż po podziale komórki), końcowa sucha masa komórki (tuż przed podziałem komórki) oraz czas trwania cyklu komórkowego, tj. czas między dwoma kolejnymi podziałami15. Wszystkie te pomiary można obliczyć przy użyciu bardzo dobrych statystyk (N>1000), ponieważ duże pole widzenia zazwyczaj pozwala na analizę od 200 do 10 000 komórek w jednej akwizycji bez soczewek.
Aby wyjaśnić tę metodologię opartą na mikroskopii wideo bez soczewek, opisujemy protokół monitorowania i ilościowego oznaczania hodowli komórek HeLa przez 2,7 dnia. Analiza danych to czteroetapowy proces oparty na holograficznej rekonstrukcji o wielu długościach fali, śledzeniu komórek, segmentacji komórek i algorytmach podziału komórek. Tutaj pokazano, że rozdzielczość przestrzenna i stosunkowo duża liczba klatek na sekundę (jedna akwizycja co 10 minut) uzyskane za pomocą tego zestawu do mikroskopii wideo bez soczewek są kompatybilne ze standardowymi algorytmami śledzenia komórek. Pełna analiza tego zestawu danych skutkuje pomiarem 10 584 ścieżek komórek w pełnych cyklach komórkowych.
Podsumowując, mikroskopia wideo bez soczewek jest potężnym narzędziem do automatycznego monitorowania tysięcy nieoznakowanych, niezsynchronizowanych i niezmodyfikowanych komórek na eksperyment; każda komórka jest śledzona przez kilka cykli komórkowych. Nasze pomiary dostarczają zatem średniej wartości kilku parametrów komórek, ale co ważniejsze, zmienności międzykomórkowej w dużej populacji komórek.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop wideo bez soczewek Cytonote&nbsp;</td><td>Oprogramowanie do</td> akwizycji Iprasense <td></td><td></td></tr><tr><td>Horus</td><td>Iprasense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki hodowlane ze szklanym dnem</td><td>Korporacja MatTek</td><td>Część nr: P06G-0-14-F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM + GlutaMAX średni&nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>inaktywowana termicznie surowica cielęca&nbsp;</td><td>Eurobio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penicylina i streptomycyna&nbsp;</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab, zestaw narzędzi do przetwarzania obrazu&nbsp;</td><td>Matematyka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Tutaj pokazujemy, że mikroskopia wideo bez soczewek pozwala nam jednocześnie uchwycić kinetykę tysięcy komórek bezpośrednio w inkubatorze i że możliwe jest monitorowanie i ilościowe określanie pojedynczych komórek w kilku cyklach komórkowych. Opisujemy pełny protokół stosowany do monitorowania i ilościowego oznaczania hodowli komórek HeLa przez 2,7 dnia. Najpierw akwizycja kultur komórkowych odbywa się za pomocą mikroskopu wideo bez soczewek, a następnie dane są analizowane zgodnie z czteroetapowym procesem: rekonstrukcją holograficzną na wielu długościach fali, śledzeniem komórek, segmentacją komórek i algorytmami wykrywania podziałów komórek. W rezultacie pokazujemy, że możliwe jest zebranie zestawu danych zawierającego ponad 10 000 ścieżek cyklu komórkowego i więcej niż 2 x 106 pomiarów morfologicznych komórek.

W procesie rekonstrukcji holograficznej pole światła jest opisane przez pole skalarne A (gdzie <img alt="Równanie 4" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq4v3.jpg" /> jest wartością zespoloną A na płaszczyźnie w odległości z od próbki, dla pozycji bocznej <img alt="Równanie 5" src="/files/ftp_upload/56580/56580eq5v3.jpg" /> i przy długości fali λ). Propagację światła modeluje teoria Huygensa-Fresnela, która dostarcza jądra propagatora <img alt="Równanie 6" src="/f...

Mikroskopia wideo bez soczewek umożliwia nam monitorowanie kultur komórkowych bezpośrednio w inkubatorze. Tutaj opisujemy pełny protokół używany do pozyskiwania i analizowania trwającego 2,7 dnia pozyskiwania hodowanych komórek HeLa, co prowadzi do zestawu danych 2,2 x 106 pomiarów morfologii poszczególnych komórek i 10584 ścieżek cyklu komórkowego.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Ogólnym celem tej metodologii jest pozyskanie i analiza dynamiki dużej populacji przylegających komórek monitorowanych za pomocą bezsoczewkowej mikroskopii wideo. Uważamy więc, że ta technika jest interesująca w wielu dziedzinach biologii i do badania proliferacji komórek, zapalenia pęcherza moczowego komórek, badań przesiewowych leków lub monitorowania różnych procesów biologicznych. Więc ta technika jest wolna od etykiet i jest bardzo prosta.Ale jest bardzo skuteczny w badaniu dużych populacji komórek. Cóż za pomysł na tę metodę, kiedy przenieśliśmy się z dziedziny wykrywania bakterii na dziedzinę obrazowania komórek ssaków. Wtedy przydało się, że biolog, będą potrzebowali poklatkowego pobrania obwodu bezpośrednio do inkubatora.Następnie zbudowaliśmy niestandardowy mikroskop wideo bez soczewek, który jest kompatybilny z inkubatorem, a także opracowaliśmy algorytm rekonstrukcji holograficznej, aby uzyskać obraz tysięcy komórek, które są obecne w bardzo dużym polu widzenia. Rozpocznij tę procedurę od pokrycia 6-dołkowej szklanej płytki dolnej fibronektyną w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Po 1 godzinie usuń nadmiar fibronektyny i wypłucz 6-dołkową szklaną płytkę dolną PBS.W tej demonstracji wykorzystano komórki Hela wyhodowane w DMEM, plus pożywkę glutaminową, uzupełnione 10% ciepłem w aktywowanej płodowej surowicy cielęcej oraz 1% penicyliną i streptomycyną. Wysiewaj dwadzieścia tysięcy komórek na płytkę hodowlaną. Ważne jest, aby używać pojemnika ze szklanym dnem.Za jakość akwizycji bez soczewek. Umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze na górze wideomikroskopu bez soczewek. Bezsoczewkowy mikroskop wideo używany do tej akwizycji poklatkowej jest dostępny na rynku.Posiada półprzewodnikowy czujnik obrazu z tlenku metalu o obszarze obrazowania 29,4 milimetra kwadratowego i rozstawie pikseli 1,67 mikrometra. Oświetlenie o wielu długościach fali jest zapewniane przez wielochipową diodę elektroluminescencyjną umieszczoną nad otworkiem o średnicy 150 mikrometrów w odległości około 5 centymetrów od ogniw. Przed rozpoczęciem akwizycji poklatkowej ważne jest, aby sprawdzić, czy na pokrywie nie ma kondensacji.Ponieważ kondensacja pogorszy jakość obrazu akwizycji. Jeśli na pokrywie płytki hodowlanej wystąpiła kondensacja, wyczyść pokrywę. Steruj mikroskopem wideo bez soczewek za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do akwizycji.Który wykonuje zarówno akwizycję poklatkową, jak i rekonstrukcję holograficzną. Wprowadź wymagane parametry wejściowe w interfejsie oprogramowania. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 1 akwizycję co 10 minut, typ kultury komórkowej na przylegającą, a czas trwania eksperymentu na 3 dni.Rozpocznij akwizycję poklatkową. Zdjęcie przedstawia przykład pełnego pola widzenia akwizycji raw w kanale niebieskim na obszarze 29,4 milimetra kwadratowego w jednej klatce. Panel B jest szczegółem panelu A, a panel C jest szczegółem panelu B. Algorytm rekonstrukcji holograficznej automatycznie przetworzy akwizycję bez soczewki, aby uzyskać obraz fazowy hodowli komórkowej.Pokazany jest przykładowy obraz komórek przed rozpakowaniem fazy, a następnie obraz po rozpakowaniu fazy. Śledzenie komórek odbywa się za pomocą algorytmu TrackMate, wtyczki Fidżi o otwartym kodzie źródłowym do automatycznego śledzenia pojedynczych cząstek. Po załadowaniu, pełnym akwizycji poklatkowej na Fidżi i skonfigurowaniu algorytmów zgodnie z opisem w protokole tekstowym, ustaw parametry wejściowe.Ustaw szacowaną średnicę plamki na 15 pikseli, próg detektora na 0,25, maksymalną odległość łączenia na 15 pikseli, maksymalną odległość zamykania przerwy na 15 pikseli, a liczbę punktów na ścieżce na 3,5. Pierwszym krokiem w algorytmie śledzenia komórek jest wykrycie komórek w akwizycji bez soczewki. Wyświetlane są wyniki algorytmu śledzenia komórek, przy czym wszystkie ścieżki komórek są wyświetlane w ponad pięćdziesięciu klatkach, czyli około 8 godzin.Z kodem kolorystycznym odpowiadającym medianie prędkości. Dolny panel to szczegółowy obraz żółtego prostokąta z górnego panelu. Reprezentatywny klip wideo ze śledzenia komórek jest pokazany tutaj.Pod koniec procesu śledzenia komórek wybierz przycisk analizy, aby wygenerować wyniki w postaci 3 plików tekstowych. Na podstawie tych danych przeprowadza się segmentację komórek i wykrywa podziały komórek za pomocą dedykowanych algorytmów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym i plikach kodu dodatkowego. Kompilacja wszystkich pomiarów pojedynczych komórek w pełnej akwizycji poklatkowej tworzy wykresy punktowe kilku metryk w funkcji czasu.Całkowita liczba komórek w pełnym polu widzenia wzrasta z dwóch tysięcy do piętnastu tysięcy w ciągu 2,7 dnia. Pomnożone przez liczbę punktów czasowych prowadzi to do dużego zestawu danych wykrytych komórek. Każdy z nich charakteryzuje się współrzędnymi i cechami morfologicznymi, takimi jak sucha masa, powierzchnia, średnia grubość, główna długość dostępu i współczynnik kształtu.Połączenie algorytmów śledzenia i segmentacji komórek umożliwia pomiary kinetyczne na poziomie pojedynczej komórki. Ten przykład pokazuje analizę ścieżki komórki trwającą około sześćdziesięciu sześciu godzin i wykazującą 4 podziały komórek w punktach czasowych zakreślonych na żółto. W funkcji czasu obliczono kilka wskaźników: powierzchnię komórki, suchą masę, średnią grubość i ruchliwość komórki.Rozkład czasu trwania cyklu komórkowego dla 2,7-dniowej obserwacji był zbliżony do agouzowskiego. Średnio 16,5 godziny. Długości cykli komórkowych, mierzone automatycznie, są dobrze skorelowane z tymi mierzonymi ręcznie.Zbadano również inne parametry, takie jak początkowa sucha masa komórki, końcowa sucha masa oraz średnie tempo wzrostu podczas cyklu komórkowego. Po opanowaniu, pełna analiza danych akwizycji poklatkowej może zostać wykonana w ciągu kilku godzin, w zależności od konfiguracji procesora i wydajności sprzętu. Podczas próby wykonania tej procedury bardzo ważne jest, aby dokładnie określić początkowe stężenie komórek.Jeśli początkowe stężenie komórek jest zbyt duże, algorytm śledzenia komórek nie będzie w stanie prawidłowo zdefiniować trajektorii komórek. Ale jeśli stężenie komórek jest zbyt niskie, statystyki pełnej analizy również będą zbyt niskie. Zgodnie z tą procedurą, można przeprowadzić zautomatyzowane analizy śledzenia komórek, aby odpowiedzieć na inne pytania z dziedziny: biologii, biologii podstawowej lub chemotaksji.Ta nowa technika toruje również drogę do monitorowania linii komórkowych, która, miejmy nadzieję, przyniesie interesujące informacje na temat cyklu komórkowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić akwizycję poklatkową za pomocą mikroskopii wideo bez soczewek i jak analizować dużą populację komórek.

lens-free-video-microscopy-for-dynamic-quantitative-analysis-adherent

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono bezsoczewkową obrazowanie i charakterystykę komórek na chipie. To podejście do obrazowania komórek na chipie zapewnia kompaktowe i kosztowo efektywne narzędzie do diagnostyki medycznej oraz wysokoprzepustowych zastosowań w biologii komórki, co czyni je szczególnie odpowiednim dla obszarów o ograniczonych zasobach.

Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej

Celem niniejszej pracy jest przeszkolenie czytelnika w obsłudze zintegrowanego mikroskopu sił atomowych i obrazowania optycznego do stymulacji mechanicznej żywych komórek w hodowli. Przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku. Zaprezentowano reprezentatywny zestaw danych obrazujący odpowiedź żywych komórek na stymulację mechaniczną.

Badanie odpowiedzi żywych komórek na stymulację mechaniczną za pomocą zintegrowanej mikroskopii optycznej i sił atomowych

Ta metoda pozwala na monitorowanie komórek w czasie rzeczywistym oraz ilościowe pomiary różnych parametrów migracji komórkowej, takich jak prędkość, przemieszczenie i wektor prędkości. W przeciwieństwie do metod tradycyjnych, to podejście w czasie rzeczywistym nie opiera się na ilościowych pomiarach migracji w punkcie końcowym; zamiast tego umożliwia ciągłe monitorowanie i obliczanie różnych parametrów.

Ilościowa analiza przypadkowej migracji komórek z wykorzystaniem mikroskopii wideo time-lapse

Topologię adhezji komórek do podłoża mierzy się z nanometrową precyzją za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem pod zmiennym kątem (VA-TIRFM).

Nanotopologia adhezji komórek w badaniu z wykorzystaniem fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia pod zmiennym kątem (VA-TIRFM)

Pokazujemy test oparty na mikrofluidyce do pomiaru skali czasowej dla komórek do przejścia przez sekwencję zwężeń w skali mikronów.

Technika mikroprzepływowa do badania odkształcalności komórek

Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Ze względu na niski stosunek sygnału do szumu (SNR) czujników opartych na transferze energii rezonansu (FRET) Fӧrster, pomiar sygnałów cAMP był wyzwaniem, zwłaszcza w trzech wymiarach przestrzennych. W tym miejscu opisujemy metodologię obrazowania i analizy hiperspektralnej FRET, która umożliwia pomiar rozkładu cAMP w trzech wymiarach przestrzennych.

Pomiar trójwymiarowych rozkładów cAMP w żywych komórkach przy użyciu 4-wymiarowego (x, y, z i λ) hiperspektralnego obrazowania i analizy FRET

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten manuskrypt opisuje konstrukcję i działanie mikrotensjometru/mikroskopu konfokalnego do wykonywania jednoczesnych pomiarów napięcia międzyfazowego i reologii dylatacyjnej powierzchni przy jednoczesnej wizualizacji morfologii międzyfazowej. Zapewnia to konstruowanie w czasie rzeczywistym relacji struktura-właściwości interfejsów ważnych w technologii i fizjologii.

Mikrotensjometr do mikroskopii konfokalnej Wizualizacja dynamicznych interfejsów

Prezentowany protokół opisuje rozwój i wykorzystanie techniki barwienia aktyną na bazie falloidyny z konfokalną laserową mikroskopią skaningową (CLSM) do wizualizacji przylegającej struktury warstwy komórkowej w mikroprzepływowych kanałach hodowli dynamicznej i tradycyjnych komorach do hodowli statycznej ze stałą studnią. Takie podejście pomaga w ocenie zbiegu warstw komórkowych, tworzenia monowarstw i jednorodności grubości warstwy.

Przygotowanie i ocena strukturalna monowarstw komórek nabłonka w fizjologicznie dobranym urządzeniu do hodowli mikroprzepływowej

Poznaj bezsoczewkową mikroskopię wideo do dynamicznej analizy przylegających kultur komórkowych HeLa. Ta metoda umożliwia śledzenie cyklu komórkowego i proliferacji w inkubatorze.

Bezsoczewkowa mikroskopia wideo do dynamicznej i ilościowej analizy przylegających kultur komórkowych

Przeglądaj więcej filmów