Poszukiwanie ścieżek napędzających nabytą oporność na terapię celowaną: wytwarzanie subklonów opornych na leki i przywracanie wrażliwości przez knock-down genów

Ogólnym celem tej platformy przedklinicznej jest zapewnienie standardowej procedury identyfikacji i scharakteryzowania mechanizmów napędzających nabytą oporność na terapie celowane. Metoda ta może pomóc we wdrożeniu popędu genomowego w onkologii, w szczególności w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące heterogeniczności guza i wielu mechanizmów odpowiedzialnych za nabytą oporność na terapię celowaną. Główną zaletą tej techniki jest oszczędność czasu i kosztów, która pozwala na badanie in vitro mechanizmów oporności na terapię celowaną.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię nowotworów, ponieważ oporność płuc jest nadal wyzwaniem dla pojawiających się terapii celowanych. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat mechanizmu związanego z opornością na terapię celowaną, ale może być również wykorzystana do badania skuteczności konwencjonalnych środków chemioterapeutycznych. Ogólnie rzecz biorąc, operatorzy, którzy stosują tę metodę, zataczają się z generacją lekoopornych subklonów, co jest krokiem najtrudniejszym do standaryzacji.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy scharakteryzowaliśmy nabyty mechanizm oporności na trastuzumab w liniach komórkowych HER-dodatniego raka żołądka. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ do generowania i walidacji modeli oporności na leki in vitro potrzebnych jest kilka technik, w tym przywracanie czułości poprzez knock-down genu. Aby rozpocząć tę procedurę, wysiewaj komórki NCI N87 do kolb hodowlanych o powierzchni 25 centymetrów kwadratowych.

Dodać 10 mikrogramów na mililitr trastuzumabu do pożywki w każdej kolbie. Wystawić komórki na działanie tej dawki początkowej, aż wznowią wzrost. Po wznowieniu wzrostu komórek w ciągu około dwóch tygodni należy poddać komórki działaniu dawki trastuzumabu wynoszącej sto mikrogramów na mililitr

Kontynuuj stopniowe zwiększanie stężenia trastuzumabu, czekając, aż komórki wznowią wzrost przed każdą ekspozycją, aż zostanie osiągnięte stężenie 400 mikrogramów na mililitr. Linia komórkowa może wykazywać różną wrażliwość na różne leki. Jednym z rozwiązań tego problemu jest wystawienie komórek na stopniowo zwiększające się dawki leków, zaczynając od dawki około dziesięciokrotnej na godzinę szczytowego stężenia w osoczu, aż do momentu, gdy komórki będą nadal rosły.

Następnie umieść komórki w 24 wielodołkowych płytkach hodowlanych. Wystaw wysiewane komórki na zwiększenie stężeń inhibitora terapii celowanej od 100 mikrogramów na mililitr do 400 mikrogramów na mililitr. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 dni.

Następnie usuń pożywkę i przepłucz komórki 10 mililitrami PBS-1X. Usuń PBS-1X i dodaj od dwóch do trzech mililitrów roztworu utrwalającego. Po 20 minutach usuń roztwór utrwalający i dodaj dwa mililitry 0,5% roztworu fioletu krystalicznego do każdej studzienki.

Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie za pomocą pipety ostrożnie zassać roztwór fioletu krystalicznego. Zanurz płytki w wodzie z kranu, aby spłukać wszelkie pozostałe pozostałości.

Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej do dwóch dni. Następnie użyj odwróconego mikroskopu przy 4-krotnym powiększeniu, aby policzyć kolonie zawierające więcej niż 50 komórek. Oblicz współczynnik rezystancji względnej IC50 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Na początek przygotuj zawiesinę jednokomórkową przez trypsynizację, jak opisano w protokole tekstowym. Za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym policz komórki. Następnie wysiewaj 2,5 razy od 10 do pięciu komórek w kolbie T-25 dla każdego warunku.

Następnie rozcieńczyć 12,5 mikrolitra każdego oligonukleotydu siRNA ukierunkowanego na gen lub oligonukleotydu siRNA kontroli negatywnej w minimalnym niezbędnym pożywce transfekcyjnej. Dodaj kationowy odczynnik do transfekcji liposomów w stosunku 1:1 z oligonukleotydami. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Następnie dodać 700 mikrolitrów mieszanki transfekcyjnej do każdej kolby T-25. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech dni. Użyj analizy RT-PCR i Western Blot, aby zweryfikować knock-down genu.

Następnie umieść komórki w 24 wielodołkowych płytkach hodowlanych. Wystaw komórki na rosnące stężenia inhibitora terapii celowanej od 100 mikrogramów na mililitr do 400 mikrogramów na mililitr. Aby zapewnić skuteczność knock-downu genów, oligonukleotydy siRNA muszą być specyficzne dla zmniejszenia ekspresji docelowej.

Zaprojektowane narzędzia i pomiar siRNA był tym samym genem docelowym są przydatne do tego celu. Inkubować w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 dni. Usuń pożywkę i przepłucz komórki 10 mililitrami PBS-1X.

Po usunięciu PBS dodaj dwa do trzech mililitrów roztworu utrwalającego. Następnie usuń roztwór utrwalający i dodaj 0,5% roztwór fioletu krystalicznego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez dwie godziny.

Za pomocą pipety ostrożnie odessać roztwór fioletu krystalicznego. Następnie zanurz talerze w wodzie z kranu. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej do dwóch dni.

Następnie użyj odwróconego mikroskopu przy 4-krotnym powiększeniu, aby policzyć kolonie zawierające więcej niż 50 komórek. W tym badaniu trzy linie komórkowe raka żołądka, które wyrażają wysoki poziom HER2 i są wrażliwe na trastuzumab, są hodowane w pożywce hodowlanej zawierającej docelowe środki terapeutyczne. Z tego uzyskuje się trzy subklony charakteryzujące się stabilnym odpornym fenotypem.

Spośród subklonów, HR NCI N87 jest postrzegany jako najbardziej odporny, osiągając względną rezystancję IC50 wynoszącą 28,57. Analiza ekspresji białek i genów potwierdza hipotezę, że gen IQGAP1 odgrywa kluczową rolę w fenotypie oporności podlinii HR NCI N87. Jak pokazano tutaj, poziom białka IQGAP1 jest pięciokrotnie wyższy w opornym subklonie niż w komórkach rodzicielskich.

A ekspresja genu IQGAP1 jest 2,5-krotnie większa w podlinii HR NCI N87 niż w oryginalnym subklonie. Następnie przeprowadza się wyciszanie genu IQGAP1 w celu oceny jego roli w rozwoju fenotypu oporności na trastuzumab. Test klonogenny dodatkowo potwierdza hipotezę o znaczeniu IQGAP.

Jak widać tutaj, wyciszenie genu przywraca wrażliwość komórki na trastuzumab, obniżając wartość IC50 do siedmiu mikrogramów na mililitr. To, co myślę o tej procedurze, jest ważne, aby pamiętać, że generalnie nie jest łatwo uzyskać lekooporne subklony komórek. I że ta metoda niesie ze sobą potencjalne ryzyko niepowodzenia.

Dzięki tej procedurze możliwe jest uzyskanie kilku komórek klonów charakteryzujących się różnymi mechanizmami napędzającymi nabytą oporność na terapie celowane. Opracowanie standardowej procedury modelowania in-vitro oporności na terapię celowaną powinno umożliwić naukowcom zajmującym się onkologią zbadanie nowego celu wykorzystującego lek w celu przezwyciężenia oporności na leki, co jest największym zarzutem wobec terapii najnowszej generacji.