Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Patogeny przenoszone przez żywność przyczyniają się do dużej części problemów zdrowia publicznego na całym świecie, które znacząco wpływają na śmiertelność i zachorowalność ludzi. Konwencjonalne metody wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność wymagają skomplikowanej obsługi próbek i są czasochłonne. Ostatnio bioczujniki okazały się obiecującą i kompleksową metodą wykrywania, której zaletą jest szybkie wykrywanie i praktyczność.

Rozwój biosensorów opiera się na zmodyfikowanej elektrodzie z nanocząstkami złota stabilizowanymi kwasem polimlekowym. Elektroda węglowa z sitodrukiem została zmodyfikowana w celu zwiększenia powierzchni czynnej elektrody roboczej. Błękit metylenowy stosowany jako kompleks redoks ma silne wiązanie z jednoniciowym DNA unieruchomionego DNA sondy.

Ta zależność wysokiej finezji jest reprezentowana przez wysoki prąd szczytowy. Hybrydyzacja jednoniciowego DNA z jego komplementarną sekwencją zastępuje związane cząsteczki błękitu metylenowego, co zmniejsza prąd różnicowej woltamperometrii impulsowej. Mogło to być spowodowane mniejszą ilością błękitu metylenowego zgromadzonego na powierzchni zmodyfikowanej elektrody z komplementarnym dwuniciowym DNA, co było spowodowane nieosiągalnym oddziaływaniem między zasadami guaniny.

Kolor przygotowanych roztworów zmienia się od żółtego do czarniawego, a na końcu do ciemnorubinowoczerwonego. Wskazywało to, że sól złota została zredukowana przez jony cytrynianu. Rozpuszczony kwas polimlekowy zmieszano z wcześniej przygotowanym roztworem nanocząstek złota, a następnie jednorodnie wymieszano w temperaturze pokojowej, którą następnie oznaczono jako nanocząstki złota stabilizowane kwasem polimlekowym.

Spektroskopia ultrafioletowa w świetle widzialnym, dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego, transmisyjna mikroskopia elektronowa i skaningowa mikroskopia elektronowa z dyspersją energii wykorzystano do scharakteryzowania nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym. Około 25 mikrolitrów jednorodnego roztworu nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym szybko pipetowano na elektrodę węglową z sitodrukiem i suszono na powietrzu przez 24 godziny przed użyciem. Zmodyfikowane elektrody zostały następnie scharakteryzowane elektrochemicznie w żelazocyjanku potasu w celu zmierzenia pola powierzchni czynnej, elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej, powtarzalności, odtwarzalności i stabilności.

Optymalizację warunków unieruchomienia określono za pomocą trzech czynników: stężenia jednoniciowego DNA w zakresie od 0,2 do 1,4 mikromola, czasu w zakresie od 30 do 220 minut oraz temperatury w zakresie od 25 do 75 stopni Celsjusza. Z kolei o optymalizacji warunków hybrydyzacji decydowały dwa czynniki, którymi są czas w zakresie od pięciu do 35 minut oraz temperatura w zakresie od 25 do 75 stopni Celsjusza. Poddane działaniu zmodyfikowane elektrody zostały następnie zanurzone w 20-mikromolowym błękitie metylenowym na 30 minut.

Niespecyficznie wchłonięte DNA i nadmiar błękitu metylenowego usunięto przez przemycie buforem octanu soli o pH 4,5, a następnie spłukano wodą dejonizowaną. Szczytowy prąd redukcji błękitu metylenowego mierzono techniką woltamperometrii impulsowej różnicowej. Różnicowy pomiar woltamperometrii impulsowej wykonano przy użyciu buforu fosforanowego soli o pH 7,0, który nie zawierał wskaźnika.

Podobną procedurę przeprowadzono dla wszystkich interakcji. Vibrio parahaemolyticus jako szczepy referencyjne i osiem innych szczepów bakteryjnych, a mianowicie Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus i Vibrio alginolyticus powszechnego patogenu przenoszonego przez żywność zostało wykorzystanych do walidacji elektrochemicznego biosensora DNA w tym badaniu. Rutynowa subkultura szczepów bakteryjnych na odpowiednim agarze była przeprowadzana co dwa tygodnie, aby utrzymać ich żywotność.

Ilość komórek Vibrio parahaemolyticus oznaczono za pomocą techniki płytki rozsiewającej. Jeden milimetr kultury komórkowej bakterii przeniesiono do dziewięciomilimetrowego bulionu sojowego z tryptykazą zawierającego 3% chlorek sodu, aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia 10. Następnie 0,1 mililitra każdego czynnika rozcieńczenia, zaczynając od jednego współczynnika rozcieńczenia od 10 do 10 razy współczynnika rozcieńczenia 10, rozprowadzono na płytce CHROMagar Vibrio w celu zliczenia kolonii.

Sercówki zostały pozyskane z mokrego targu, a następnie szybko przewiezione do laboratorium w chłodziarce do lodu w celu analizy. Sercówki podzielono na dwie grupy, a mianowicie grupę leczoną i niepoddawaną działaniu środka, przy założeniu, że sercówki były zbierane równomiernie od początku zbiorów do momentu umieszczenia ich w chłodni na rynku. Sercówki w grupie leczonej poddano wstępnej obróbce, przechowując je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez 24 godziny, a następnie wystawiono na działanie światła ultrafioletowego w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez cztery godziny przed ekstrakcją DNA.

Oczekiwano, że temperatura zamarzania i ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe zastosowane w grupie kontrolnej zabiją go lub przynajmniej ograniczą naturalnie gromadzące się patogeny przenoszone przez żywność w sercówkach. Nie zastosowano wyższego reżimu pasteryzacji wynoszącego 70 stopni Celsjusza, ponieważ celem kontrolowanych warunków w tym badaniu było naśladowanie rzeczywistej sytuacji świeżych sercówek. Tymczasem próbki z grupy nieleczonej były bezpośrednio analizowane bez żadnej obróbki wstępnej, gdy tylko dotarły do laboratorium.

Sercówki umyto w wodzie destylowanej i wyszorowano z brudu przed usunięciem tkanek z muszli za pomocą sterylnych kleszczy i komory laminarnej. Około 10 gramów próbek tkanek sercówki homogenizowano homogenizatorem w 19 mililitrach sterylnego bulionu sojowego z tryptykazą zawierającego 3% chlorku sodu przez 60 sekund. Znana ilość patogenów przenoszonych przez żywność została następnie dodana do dziewięciu milimetrów homogenizowanego bulionu z próbki dla próbek wzbogaconych.

Próbki bez wzbogaceń wykorzystano jako kontrolę ujemną. Około jednego mililitra próbek pipetowano do probówki Eppendorfa w celu ekstrakcji próbki DNA, która miała być wykorzystana do testu biosensora i reakcji łańcuchowej polimerazy. Genomowe DNA patogenu przenoszonego przez żywność zostało następnie wyekstrahowane z próbek wzbogaconych i niewzbogaconych.

Genomowe DNA wyekstrahowano po zmodyfikowanej procedurze lizy gotowanej. Genomowe DNA odwirowywano z prędkością 12 000 obrotów na minutę przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uzyskać klarowną zawiesinę, a supernatant utrzymywano w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do dalszego wykorzystania. Do określenia stężenia i czystości wyekstrahowanego genomowego DNA użyto biofotometru.

Tożsamość wszystkich szczepów została następnie określona za pomocą standardowych testów biochemicznych i zweryfikowana za pomocą sekwencjonowania genu 16 SR RNA. Na koniec genomowe DNA poddano denaturacji w temperaturze 92 stopni Celsjusza przez dwie minuty i szybko schłodzono w lodowatej wodzie przed zastosowaniem biosensora. Dalsze potwierdzenie patogenów przenoszonych przez żywność przeprowadzono za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy ukierunkowanej na odpowiedni gen.

Amplifikowany produkt i ich rozmiary oznaczono za pomocą elektroforezy na 1,5% żelu agarozowym. Obrazy żelu zostały wykonane za pomocą systemu dokumentacji żelu. Na podstawie widm widzialnych w ultrafiolecie potwierdzono wytwarzanie nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym, w wyniku czego wzrost plazmy powierzchniowej i pik rezonansowy ustalono na około 540 nanometrach.

Powstawanie i istnienie nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym wykazano w zakresie długości fal od 500 do 600 nanometrów, w zależności od wielkości cząstek. Wszystkie krystalitowe piki nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym zaobserwowano w dwóch teatrach pod kątem 31,7, 38,2, 44,4, 64,7 i 77,7 stopnia. Intensywność pików krystalitu również wzrosła, gdy szersze piki dyfrakcyjne weszły w 31,7 stopnia, co sugeruje, że zimne nanocząstki były osadzone w kwasie polimlekowym i sugeruje tworzenie się polifazowych nanostruktur złota.

Z krzywej rozkładu cząstek z transmisyjnej mikroskopii elektronowej i obrazów nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym można było zauważyć, że nanocząstki złota mają kształt prawie kulisty. Wielkość nanocząstek mieściła się w zakresie około 37 nanometrów, czyli nieco więcej niż uzyskano ze wzoru Scherrera, co sugeruje polikrystaliczny charakter zsyntetyzowanych nanocząstek. Główny rozmiar nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym obliczono za pomocą równania Sherrera, określając szerokość odbicia 100 Bragga.

Z tabeli obliczono wielkość krystalitów nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym na 27 nanometrów. Na podstawie obrazów ze skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją polową i widm rentgenowskich z dyspersją energii, zmodyfikowana elektroda węglowa z sitodrukiem miała najwyższy procent wagowy złota, największą gęstość i największą strukturę pokrycia nanocząstkami. Widmo promieniowania rentgenowskiego z dyspersją energii potwierdziło, że wytworzone nanocząstki złota stabilizowane kwasem polimlekowym składały się wyłącznie ze złota i nie wykazywały żadnego innego pierwiastka poza pikiem odpowiadającym węglowi i tlenowi.

Potencjały pików anodowych i katodowych były spójne przy różnych szybkościach skanowania, co sugeruje, że reakcja elektrochemiczna była odwracalna w oparciu o separację pików. Pole powierzchni czynnej zmodyfikowanych elektrod obliczono jako 0,26 centymetra kwadratowego i 0,41 centymetra kwadratowego odpowiednio dla gołej elektrody i elektrody zmodyfikowanej. Wynik ten potwierdził, że poprawa zapewniana przez nanocząstki złota stabilizowane kwasem polimlekowym na powierzchni aktywnej była stosunkowo wyższa w porównaniu z gołą elektrodą.

Wartość rezystancji przenoszenia ładunku dla gołej elektrody wynosiła 1 932 omów, podczas gdy zmodyfikowanej elektrody spadła do 1 444 omów. Spadek wartości rezystancji przenoszenia ładunku w zmodyfikowanej elektrodzie mógł wynikać ze spadku lokalnej stałej dielektrycznej i/lub wzrostu grubości podwójnej warstwy elektrycznej, co sugeruje, że żelazocyjanek potasu działał poprzez absorpcję na granicy faz metalu lub roztworu. Prądy szczytowe zwiększały się stopniowo wraz z modyfikacją gołej elektrody przy użyciu nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym, które wykazały, że wyższa czułość była odwrotnością niższej rezystancji przenoszenia ładunku.

Względne odchylenie standardowe zmodyfikowanej elektrody wyprowadzono jako 4,26%Elektroda z modyfikacją nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym dała lepsze względne odchylenie standardowe po kilku pomiarach. Względne wartości odchylenia standardowego wynoszące 4,05% dla zmodyfikowanej elektrody wskazują na lepszą odtwarzalność wytwarzania elektrody dla nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym. Zoptymalizowane stężenie DNA wynosiło 1,2 mikromolowego jednoniciowego DNA.

Optymalny czas unieruchomienia jednoniciowego DNA został wybrany na 180 minut. Optymalna temperatura unieruchomienia jednoniciowego DNA została wybrana na 55 stopni Celsjusza. Optymalny czas hybrydyzacji dwuniciowego DNA wybrano na 10 minut.

Optymalna temperatura hybrydyzacji dwuniciowego DNA została wybrana na 35 stopni Celsjusza. Komplementarne DNA wykazywało najniższy prąd szczytowy wynoszący 0,73 mikroampera wśród badanego DNA, niekomplementarne DNA, trzy niedopasowane zasady DNA i jedna niedopasowana zasada DNA. Oczywiste jest, że wysoki prąd z DNA, który był celem ataku, jest mniejszy niż prąd innych sekwencji oligonukleotydów.

Wynik ten wskazuje, że bioczujnik może być używany do rozróżniania z wysoką czułością i swoistością. Skonstruowany biosensor DNA charakteryzował się selektywnością wykrywania hybrydyzacji za pomocą unieruchomionego DNA sondy na powierzchni zmodyfikowanej elektrody. Ciągły spadek prądu szczytowego woltamperometrii impulsowej różnicowego błękitu metylenowego na zmodyfikowanej elektrodzie został wywołany w wyniku wzrostu stężenia komplementarnego DNA.

Liniowa korelacja między logarytmem różnych docelowych stężeń DNA od 0,2 pikomolara do 0,02 milimola a logarytmem szczytowego prądu redukcji błękitu metylenowego jest przedstawiona za pomocą współczynnika regresji liniowej wynoszącego 0,96. Procentowy odzysk dla wyprodukowanego biosensora DNA powoli spadł do nie mniej niż 80% jego początkowego sygnału po sześciu miesiącach przechowywania, co wskazuje, że sonda jednoniciowego DNA na powierzchni zmodyfikowanej elektrody jest wysoce stabilna. Dobra długoterminowa stabilność w temperaturze poniżej 45 stopni Celsjusza może być przyczyną silnej reakcji między nanocząstkami złota stabilizowanymi kwasem polimlekowym a jednoniciowym DNA.

Przebadano produkty amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy dla dziewięciu różnych gatunków bakterii, którymi były Bacillus cereus, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Vibrio alginolyticus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumoniae i Vibrio parahaemolyticus. Różnicowy prąd szczytowy woltamperometrii impulsowej uzyskany po ocenie reaktywności krzyżowej wykazuje bardzo wyraźne wykrywanie Vibrio parahaemolyticus w porównaniu z innymi gatunkami bakterii. Można to zaobserwować zmniejszając liczbę par zasad, obserwuje się wzrost sygnału woltamperometrii impulsowej różnicowej.

Jest to związane z większą ilością cząsteczek błękitu metylenowego aż do sond. Z analizy reakcji łańcuchowej polimerazy stwierdzono Vibrio parahaemolyticus zarówno w próbkach kolczastych poddanych działaniu substancji, jak i nietraktowanych, jak pokazano na pasie siódmym, ósmym, dziewiątym, 10, 11 i 12. Natomiast próbki poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu kolców na pasie pierwszym, drugim, trzecim, czwartym, piątym i szóstym były pozbawione Vibrio parahaemolyticus.

Wyniki detekcji wykorzystano za pomocą opracowanego biosensora DNA, który z powodzeniem określił obecność Vibrio parahaemolyticus w badanej grupie składającej się z próbek wzbogaconych i niewzbogaconych. Wyniki te pozytywnie korelują z wcześniej omówionymi wynikami reakcji łańcuchowej polimerazy. Zastosowanie nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym ma ogromny potencjał aplikacyjny jako modyfikacja dla dalszego sensu wytwarzania.

Wysoką selektywność można osiągnąć, gdy kompleks redoks wiąże się silniej z niezhybrydyzowaną cząsteczką biorozpoznania, co może być innowacją, którą warto śledzić.