Name: Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 17 min 16 s
Description: Poznaj metodę opracowania elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania Vibrio parahaemolyticus przy użyciu nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym. Ta technika zwiększa czułość detekcji patogenów przenoszonych przez żywność.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować za wsparcie ze strony Universiti Putra Malaysia.

UWAGA: Wszystkie chemiczne i biochemiczne odczynniki, które mają być użyte, powinny być klasy analitycznej i używane bez dalszego oczyszczania. Przygotuj wszystkie roztwory za pomocą sterylnej wody dejonizowanej. Całe szkło należy sterylizować w autoklawie przed sterylizacją.
Uwaga: Proszę stosować wszystkie odpowiednie praktyki bezpieczeństwa podczas wykonywania czynności laboratoryjnych, w tym stosowanie kontroli inżynieryjnych (dygestoria, schowek na rękawiczki) i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice, fartuch laboratoryjny, długie spodnie, buty z zakrytymi palcami).
1. Wytwarzanie i charakterystyka zmodyfikowanej elektrody przy użyciu PLA-AuNPs
<ol>
	<li>Otrzymywanie i charakterystyka PLA-AuNPs
	<ol>
		<li>Szybko dodaj 10 ml roztworu cytrynianu sodu (38,8 mM) do 100 ml wrzącego wodnego roztworu kwasu chloroaurowego (1 mM) i schłodzić go do temperatury otoczenia. Obserwuj zmiany koloru w przygotowanym roztworze AuNPs, który zaczyna się jako żółty, zmienia się w czarniawy, a kończy na ciemnej rubinowej czerwieni.</li>
		<li>Umieść granulki PLA w formie ze stali nierdzewnej do procesu topienia i podgrzej je w temperaturze 190 °C przez 10 minut. Postępuj zgodnie z procedurą prasowania: umieść je pod ciśnieniem 2,2 MPa na 1 minutę w ramach przygotowania arkusza PLA. Arkusz PLA będzie gotowy do użycia po schłodzeniu przez około 3 godziny.</li>
		<li>Energicznie mieszając, rozpuść 0,68 mg arkuszy PLA w 5 ml chloroformu w temperaturze pokojowej. Wymieszać rozpuszczony PLA z 10 ml wcześniej przygotowanego roztworu AuNPs i jednorodnie wymieszać w temperaturze pokojowej. Jednorodne mieszaniny można następnie oznaczyć jako PLA-AuNP i scharakteryzować za pomocą UV-Vis, XRD, TEM i FESEM z EDX.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie i charakterystyka modyfikowanej elektrody węglowej z sitodrukiem 
	UWAGA: SPCE zastosowany w tym badaniu składa się z układu trzech elektrod: przeciwelektrody, węglowej elektrody roboczej i elektrody referencyjnej Ag/AgCl.
	<ol>
		<li>Szybko odpipetować 25 μl jednorodnego roztworu PLA-AuNPs na SPCE, a następnie wysuszyć na powietrzu przez 24 godziny przed użyciem.</li>
		<li>Elektrochemicznie scharakteryzować zmodyfikowane elektrody, SPCE/PLA-AuNPs, w żelazocyjanku potasu (K3[Fe(CN)6]3-/4-) w celu pomiaru powierzchni czynnej, elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej, powtarzalności, odtwarzalności i stabilności30.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA
<ol>
	<li>Przygotowanie sondy 
	Uwaga: Sekwencje sondy ssDNA i komplementarnego DNA zostały wybrane na podstawie informacji z bazy danych National Center for Biotechnology Information (NCBI).
	<ol>
		<li>Zakup syntetycznych oligonukleotydów (20-merowa sonda ssDNA, 20-merowa komplementarna sonda, 20-merowa niedopasowana DNA i 21-merowa niekomplementarna DNA) w postaci liofilizowanego proszku z komercyjnych laboratoriów, w oparciu o następujące sekwencje: 
		tiolowana sonda ssDNA: 5′- / 5ThioMC6-D/CGGATTATGCAGAAGCACTG - 3′ 
		komplementarne DNA: 5′ - CAGTGCTTCTGCATAATCCG - 3′ 
		niedopasowane DNA z jedną zasadą: 5′ - CAGTGCTTCTGC ṪTAATCCG - 3′ 
		niedopasowane DNA z trzema zasadami: 5′ - CAGTGCTTCT Ċ ṪṪTAATCCG - 3′ 
		niekomplementarne DNA: 5′ - CGCACAAGGCTCGACGGCTGA - 3′</li>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe wszystkich oligonukleotydów (100 μM) przy użyciu sterylnego roztworu TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5), podzielonego na porcje analityczne. Przechowywać w temperaturze -4 °C, a następnie odpowiednio rozcieńczyć tuż przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Optymalizacja unieruchomienia i hybrydyzacji 
	Uwaga: Do tego badania użyto SPCE zmodyfikowanego za pomocą PLA-AuNPs, oznaczonego jako SPCE/PLA-AuNPs, a do immobilizacji i hybrydyzacji DNA zastosowano metodę odlewania kroplowego.
	<ol>
		<li>Najpierw unieruchomij 25 μl tiolowanej sondy ssDNA na SPCE/PLA-AuNPs, a następnie wysusz ją na powietrzu przez 24 godziny w temperaturze pokojowej, po czym zostanie ostatecznie oznaczona jako SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA. Określ optymalizację warunków unieruchomienia za pomocą trzech czynników: stężenia ssDNA (w zakresie od 0,2 do 1,4 μM), czasu (w zakresie od 30 do 210 min) i temperatury (w zakresie od 25 do 75 °C).</li>
		<li>Pobrać pipetą 25 μl komplementarnego DNA na powierzchnię SPCE/PLA-AuNPs/ssDNA, aby przeprowadzić zdarzenie hybrydyzacji, po którym można je ostatecznie oznaczyć jako SPCE/PLA-AuNPs/dsDNA. Określ optymalizację warunków hybrydyzacji za pomocą dwóch czynników: czasu (w zakresie od 5 do 30 minut) i temperatury (w zakresie od 25 do 75 °C).</li>
		<li>Zanurz unieruchomione i zhybrydyzowane elektrody w 20 μM MB na 30 minut. Usuń niespecyficznie zaadsorbowane DNA i nadmiar MB, przemywając 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5), a następnie spłukując wodą dejonizowaną. Zmierz prąd szczytowy redukcji MB za pomocą techniki DPV. Wykonać pomiar DPV przy użyciu 0,1 M PBS (pH 7) bez wskaźnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Charakterystyka wytworzonego biosensora DNA
	<ol>
		<li>Zanurzyć SPCE/PLA-AuNPs w 20 μM MB na 30 minut, przemyć 0,5 M ABS/20 mM NaCl (pH 4,5), a następnie spłukać wodą dejonizowaną przed pomiarem. Postępuj zgodnie z podobną procedurą dla wszystkich interakcji, w tym DNA sondy, komplementarnego DNA, niedopasowanego DNA i niekomplementarnych próbek DNA.</li>
		<li>Zmierz redukcję elektrochemiczną. 
		UWAGA: Zmierzyliśmy DPV za pomocą komercyjnie wyprodukowanego Autolabu z oprogramowaniem interfejsu. 
		Pomiary DPV redukcji elektrochemicznej MB wykonane przy potencjale w zakresie od -0,5 V do 0,25 V, z potencjałem krokowym 0,005 V, amplitudą modulacji 0,05 V i szybkością skanowania 7,73 mVs-1 w 0,1 M PBS (pH 7), bez wskaźnika. Dalej badano selektywność, czułość, odtwarzalność i stabilność termiczną wytworzonego biosensora DNA. Przedstawione wyniki przedstawiono w postaci pomiarów wartości średniej w trzech powtórzeniach.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Walidacja wyprodukowanego biosensora DNA przy użyciu prawdziwych próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie szczepów bakteryjnych
	<ol>
		<li>Wybierz próbki bakterii na podstawie ich znacznego zanieczyszczenia owoców morza31,32 . 
		UWAGA: V. parahaemolyticus jako szczepy referencyjne i 8 innych szczepów bakteryjnych (Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritis, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli O157:H7, Bacillus cereus i Vibrio alginolyticus) powszechnego patogenu przenoszonego przez żywność wykorzystano do walidacji elektrochemicznego biosensora DNA w tym badaniu.</li>
		<li>Przeprowadzaj rutynową subkulturę szczepów bakteryjnych na odpowiednim agarze co dwa tygodnie, aby utrzymać ich żywotność, patrz Tabela 1 dla warunków hodowli.</li>
		<li>Utrzymuj długotrwałą konserwację szczepów bakteryjnych w odpowiednich bulionach zawierających 20% (v/v) glicerolu w temperaturze -80 °C, ponieważ glicerol chroni bakterie, zapobiegając tworzeniu się kryształków lodu, które mogą je uszkodzić podczas procesu zamrażania. Następnie zaszczepij pętlę zachowanej kultury komórek bakteryjnych w zapasach glicerolu do odpowiednich bulionów. Inkubuj buliony zgodnie z ich odpowiednim czasem wzrostu i temperaturą, gdy zajdzie potrzeba ożywienia bakterii.</li>
		<li>Określ ilość komórek V. parahaemolyticus za pomocą techniki płytki rozsiewającej33, standardowej i dobrze znanej metody liczenia mikroorganizmów pochodzących z serii rozcieńczeń.
		<ol>
			<li>Kultura V. parahaemolyticus w bulionie sojowym z tryptykazy (TSB + 3% NaCl) w temperaturze 37 °C w stanie wstrząsania 140 obr./min. Następnie przenieś 1 ml kultury komórkowej bakterii do 9 ml TSB + 3% NaCl, aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia 10-1.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powtórz ten krok dziewięć razy, aby uzyskać pełną serię o współczynniku rozcieńczenia do 10-10. Następnie rozprowadź 0,1 ml każdego czynnika rozcieńczenia (zaczynając od 10-1 do 10-10) na selektywnej płytce agarowej Vibrio w celu zliczenia kolonii. Inkubować płytki inkubowane w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Użyj licznika kolonii, aby policzyć poszczególne kolonie, a następnie przelicz wstecznie (policz jtk/odpipeowaną ilość x współczynnik rozcieńczenia), aby uzyskać jednostkę tworzącą kolonię na mililitr gęstości (CFU mL-1). Stężenie jednostek tworzących kolonie (CFU) w zawiesinach komórek bakteryjnych należy określić na podstawie wykresu kalibracyjnego CFU mL-1 w zależności od absorbancji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie testu PCR
	<ol>
		<li>Ekstrakcja genomowego DNA po zmodyfikowanej procedurze lizy gotowanej34. Najpierw rozprowadź pojedynczy szczep bakterii na podłożu agarowym i zaszczep go w pożywce bulionowej, a następnie inkubuj go w stanie względnego wzrostu, w stanie wstrząsania 140 obr./min.</li>
		<li>Odpipetować 1 ml kultury bulionu do mikroprobówki wirówkowej. Odwirować to w temperaturze 4830 x g i 4 °C przez 1 minutę, aby uzyskać granulki. Użyj około 500 μL sterylnego buforu TE do ponownego zaparcia z granulką. Otrzymaną zawiesinę należy przetrzymywać przez 10 minut w temperaturze 98 ± 2 °C w bloku grzewczym i natychmiast schładzać w temperaturze -18 °C przez 10 minut w celu lizy komórek i uwolnienia DNA.</li>
		<li>Odwirować genomowe DNA w temperaturze 4830 x g i w temperaturze 4 °C przez 3 minuty w celu uzyskania klarownej zawiesiny i utrzymać supernatant w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. Użyj pomiaru biofotometrem z absorpcją UV o długości fali 260 nm (jako kwasy nukleinowe pochłaniające długość fali światła), a także przy długości fali 280 nm (jako białka pochłaniające długość fali światła), aby określić stężenie i czystość wyekstrahowanego genomowego DNA, a następnie zidentyfikować wszystkie szczepy za pomocą standardowych testów biochemicznych35 i zweryfikować je za pomocą sekwencjonowania genu 16S rRNA36. Na koniec należy denaturować genomowe DNA w temperaturze 92 °C przez 2 minuty i szybko schłodzić je w lodowatej wodzie przed zastosowaniem do bioczujnika.</li>
		<li>Dalej potwierdź obecność V. parahaemolyticus za pomocą PCR w celu celowania w gen toxR. Wykonaj tę procedurę w termocyklerze, używając pary starterów (5'-GTCTTCTGACGCAATCGTTG-3' i 5'-ATACGAGTGGTTGCTGTCATG-3'). Zoptymalizuj amplifikację PCR w całkowitej objętości reakcji 25 μl składającej się ze sterylnej wody (15,5 μl), buforu (5 μl), startera (1 μl, 10 μM), mieszaniny dNTP (1 μl), matrycy DNA (2 μl) i polimerazy DNA Taq (0,2 μl, 10x).</li>
		<li>Dobrze wymieszaj składniki i ułóż amplifikację PCR sekwencji docelowej w termocyklerze zaprogramowanym na 30 cykli amplifikacji. W naszym badaniu każdy cykl składał się z trzyetapowych reakcji, tj. początkowej denaturacji (94 °C, 3 min), po której następuje 30 cykli denaturacji (94 °C, 1 min), wyżarzania (63 °C, 1,5 min) i przedłużania (72 °C, 1,5 min), a następnie końcowego przedłużenia (72 °C, 7 min).</li>
		<li>Określ amplifikowane produkty i ich rozmiary za pomocą elektroforezy na 1,5% żelu agarozowym. Przechwytywanie obrazów żelu za pomocą komercyjnie produkowanego systemu dokumentacji żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie próbek sercówek
	<ol>
		<li>Uzyskać świeże próbki. 
		UWAGA: Nasze świeże sercówki (Anadara granosa) zostały uzyskane z mokrego targu w Serdang w Selangor i szybko przywiezione do laboratorium w chłodziarce do lodu w celu analizy. Próbki należy podzielić na 2 grupy, a mianowicie grupę poddaną działaniu środka i grupę niepoddaną działaniu środka, zakładając, że sercówki były zbierane równomiernie od początku zbioru do momentu umieszczenia ich w chłodni.</li>
		<li>Sercówki w grupie poddanej działaniu substancji należy wstępnie potraktować, przechowując je w temperaturze -20 °C przez 24 godziny, a następnie wystawić na działanie światła UV w temperaturze 20 °C przez 4 godziny przed ekstrakcją DNA. 
		UWAGA: Temperatura zamarzania i ekspozycja na promieniowanie UV stosowane w grupie kontrolowanej zabija lub przynajmniej ogranicza naturalnie gromadzący się V. parahaemolyticus w sercówkach. Nie należy stosować wyższego reżimu pasteryzacji wynoszącego 70 °C, ponieważ celem warunków kontrolowanych w tym badaniu jest naśladowanie rzeczywistej sytuacji świeżych sercówek. W międzyczasie analizuj próbki bezpośrednio z grupy niepoddanej działaniu substancji bez żadnej obróbki wstępnej, gdy tylko dotrą do laboratorium.</li>
		<li>Subkultura szczepu V. parahaemolyticus ATCC 17802 w TSB (3% NaCl). Oznaczyć poziom żywotnych komórek w inokulum poprzez posiew odpowiednich rozcieńczeń TSB (3% NaCl) na CA w celu uzyskania inokulum 104 CFU mL-1 V. parahaemolyticus. Umyj każdą sercówkę w wodzie destylowanej i wyszoruj ją z brudu przed użyciem sterylnych kleszczy w komorze z przepływem laminarnym w celu usunięcia tkanek z muszli.</li>
		<li>Homogenizować około 10 g próbek tkanek sercówki za pomocą homogenizatora w 90 ml sterylnego TSB (3% NaCl) przez 60 s. Dodać znaną ilość V. parahaemolyticus do 9 ml homogenizowanego bulionu z próbki dla próbek wzbogaconych. Próbki bez wzbogaceń należy stosować jako kontrolę negatywną. Oszacuj liczbę komórek V. parahaemolyticus wzbogaconych o próbki sercówki, posiewając 0,1 ml próbek na CA, a następnie pipetując 1 ml próbek do probówki mikrowirówkowej w celu ekstrakcji próbki DNA, która ma być wykorzystana w teście biosensorycznym i PCR.</li>
		<li>Wyodrębnij genomowe DNA V. parahaemolyticus z próbek wzbogaconych i niewzbogaconych zgodnie ze zmodyfikowaną procedurą lizy gotowanej36. Na koniec określ stężenie i czystość DNA za pomocą pomiaru biofotometrem z absorpcją UV o długości fali 260 nm (jako kwasy nukleinowe pochłaniające długość fali światła), a także przy długości fali 280 nm (jako białka pochłaniające długość fali światła).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowymi krokami w ramach pomyślnego rozwoju tego typu biosensora elektrochemicznego są dobór odpowiednich elementów rozpoznawania biologicznego dla przetwornika (w tym przypadku kwasu nukleinowego lub DNA); chemiczne podejście do konstruowania warstwy detekcyjnej przetwornika; materiał transdukcyjny; optymalizacja immobilizacji i hybrydyzacji DNA; oraz walidacja opracowanego biosensora z wykorzystaniem rzeczywistych próbek.
Kluczem do pomyślnego opracowania czułego i selektywnego elektroche...

Główny temat publicznej i naukowej debaty w ostatnich latach, zatrucia pokarmowe są głównie związane z 3 czynnikami: mikroorganizmami1, chemikaliami2, oraz pasożytami3. Skażona żywność może powodować poważne konsekwencje zdrowotne u ludzi, zwłaszcza w grupie podwyższonego ryzyka, czyli osób o słabym układzie odpornościowym, osób starszych, kobiet w ciąży, niemowląt i małych dzieci4. Z ponad milionem przypadków ostrej biegunki występujących rocznie u dzieci poniżej 5 roku życia w Afryce, Azji i Ameryce Łacińskiej, zatrucia pokarmowe są główną chorobą globalną5,6, a Światowa Organizacja Zdrowia ustaliła mikroorganizmy jako najważniejszy czynnik7. Vibrio parahaemolyticus wyróżnia się wśród najbardziej rozpoznawalnych zjadliwych szczepów. Zwykle spotykana w środowiskach przybrzeżnych, ujściowych i morskich8, jest to bakteria Gram-ujemna, która staje się aktywna w środowiskach o wysokiej zawartości soli i powoduje poważne zapalenie żołądka i jelit u ludzi, gdy jest spożywana w nieodpowiednio ugotowanych, niewłaściwie traktowanych lub surowych produktach morskich9. Dodatkowo, istniejące schorzenia u niektórych osób sprawiają, że są one podatne na infekcje ran, posocznicę lub infekcje ucha wynikające z V. parahaemolyticus10. Czynniki wirulencji hemolizyn V. parahaemolyticus dzielą się na dwa typy, które przyczyniają się do patogenezy choroby: termostabilną bezpośrednią hemolizynę (TDH) kodowaną przez geny tdh i hemolizynę związaną z TDH kodowaną przez geny trh11. Markery wirulencji (geny tdh i trh) V. parahaemolyticus znajdują się głównie w próbkach klinicznych, a nie w próbkach środowiskowych.
V. parahaemolyticus posiada zdolność do przetrwania w szerokim zakresie warunków, szybko reagując na zmiany środowiskowe12. Jego mechanizm proliferacji zwiększa jego potencjał zagrożenia, ponieważ jego toksyczność wzrasta równolegle z masą komórkową13. Co gorsza, zmiany klimatyczne stwarzają tym bakteriom warunki do przyspieszenia wzrostu ich populacji komórek14. Ze względu na wysoką częstotliwość, V. parahaemolyticus musi być monitorowany w całym łańcuchu dostaw żywności, szczególnie w handlu i produkcji owoców morza, ponieważ produkty te znajdują się tam, gdzie występują w ogromnych ilościach15,16 na całym świecie. Obecnie bakterie są identyfikowane i izolowane przy użyciu szeregu metod, w tym testów biochemicznych, wzbogacania i selektywnych pożywek17, enzymatycznego immunomagnetycznego testu sorbentowego (ELISA)18, elektroforezy żelowej w polu pulsacyjnym (PFGE)19, testów aglutynacji lateksu i testów reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR)20. Metody te zwykle wymagają wykwalifikowanego personelu, wyrafinowanych narzędzi i pracochłonnych technik, które nie dostarczają natychmiastowych informacji o skażeniu. To znacznie ogranicza prawdopodobieństwo szybkiego wykrycia szkodliwych zanieczyszczeń i zastosowań na miejscu. Narzędzia do szybkiego wykrywania pozostają wyjątkowym wyzwaniem.
Biosensing staje się obiecującą opcją do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność, ponieważ oferuje oszczędzającą czas, efektywną kosztowo, praktyczną metodę analizy w czasie rzeczywistym21,22,23,24. Jednakże, mimo że uzyskano wiele pozytywnych wyników wykrywania analitów w próbkach wzbogaconych i roztworze wzorcowym przy użyciu biosensorów, nadal brakuje badań zastosowanych do rzeczywistych próbek, zarówno w mieszaninach wodnych, jak i ekstraktach organicznych25. Ostatnio naukowcy coraz częściej przyglądają się bioczujnikom elektrochemicznym wykorzystującym bezpośrednie i/lub pośrednie wykrywanie kwasu dezoksyrybonukleinowego (DNA) ze względu na specyficzne wykrywanie celu komplementarnego poprzez zdarzenie hybrydyzacji26,27,28,29. Te unikalne podejścia są bardziej stabilne w porównaniu z biosensorami opartymi na enzymach, oferując tym samym obiecującą technologię miniaturyzacji i komercjalizacji. Celem opisywanego tutaj badania jest skonstruowanie szybkiego narzędzia, które może wykrywać V. parahaemolyticus z wysoką selektywnością, czułością i praktycznością, w oparciu o specyficzność sekwencji DNA podczas hybrydyzacji. Strategie identyfikacji obejmują połączenie nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym (PLA-AuNPs)30 i elektrod węglowych z sitodrukiem (SPCE) w obecności wskaźnika hybrydyzacji, błękitu metylenowego (MB). Potencjał opracowanego konstruktu detekcyjnego jest dalej badany przy użyciu bakterii, lizatu DNA i świeżych próbek sercówek.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Merck</td><td>100056</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>Diaminoetan Kwas tetraoctowy</td><td>Promega</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Dwuzasadowy fosforan sodu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255793</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trójwodny chlorek złota (III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>520918</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Merck</td><td>100317</td><td></td></tr><tr><td>Błękit metylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M44907</td><td></td></tr><tr><td>Jednozasadowy fosforan sodu, monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3522</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5119</td><td></td></tr><tr><td>Żywica poli(kwasu mlekowego), klasa handlowa 4042D</td><td>NatureWorks</td><td>4042D</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>R& M Chemicals</td><td>59435</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Heksacyjanożelazian potasu III</td><td>R& M Chemicals</td><td>208019</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu sól bezwodna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Fisher Scientific</td><td>T395-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Master Mix z podwójnym barwnikiem</td><td>Norgen Biotek</td><td>28240</td><td></td></tr><tr><td>Żel agarozowy</td><td>Merck</td><td>101236</td><td></td></tr><tr><td>Bolton Agar</td><td>Merck</td><td>100079</td> Bolton Bulion Merck 100079 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHROMagar Vibrio</td><td>CHROMagar</td><td>VB910</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0581</td><td></td></tr><tr><td>Agar błękit metylenowy eozyny&nbsp;</td><td>Merck</td><td>101347</td><td></td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Biotium</td><td>41001</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Merck</td><td>104092</td><td></td></tr><tr><td>Go Taq Buffer</td><td>Promega</td><td>M7911</td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie barwnika 100 pz Drabinka DNA</td><td>Promega</td><td>G2101</td><td></td></tr><tr><td>Ładowanie barwnika 1kb Drabinka DNA</td><td>Promega</td><td>G5711</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Promega</td><td>91176</td><td></td></tr><tr><td>Agar polimyksynowy z żółtkiem jaja mannitolu</td><td>Merck</td><td>105267</td><td></td></tr><tr><td>McConkey Agar</td><td>Merck</td><td>105465</td><td></td></tr><tr><td>Bulion odżywczy</td><td>Merck</td><td>105443</td><td></td></tr><tr><td>polimeraza Taq</td><td>Merck</td><td>71003</td><td></td></tr><tr><td>Tryptykaza Rosół sojowy</td><td>Merck</td><td>105459</td><td></td></tr><tr><td>Tryptykaza Agar sojowy</td><td>Merck</td><td>105458</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie elektrochemicznego biosensora dna do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Development of an Electrochemical DNA Biosensor to Detect a Foodborne Pathogen

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) jest powszechnym patogenem przenoszonym przez żywność, który przyczynia się do dużej części problemów zdrowia publicznego na całym świecie, znacząco wpływając na wskaźnik śmiertelności i zachorowalności ludzi. Konwencjonalne metody wykrywania V. parahaemolyticus, takie jak metody oparte na hodowlach, testy immunologiczne i metody molekularne, wymagają skomplikowanej obsługi próbki i są czasochłonne, żmudne i kosztowne. Ostatnio bioczujniki okazały się obiecującą i kompleksową metodą wykrywania, której zaletą jest szybkie wykrywanie, opłacalność i praktyczność. Badania te koncentrują się na opracowaniu szybkiej metody wykrywania V. parahaemolyticus o wysokiej selektywności i czułości z wykorzystaniem zasad hybrydyzacji DNA. W pracy scharakteryzowano zsyntetyzowane nanocząstki złota stabilizowane kwasem polimlekowym (PLA-AuNPs) za pomocą dyfrakcji rentgenowskiej (XRD), spektroskopii ultrafioletowo-widzialnej (UV-Vis), transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), skaningowej mikroskopii elektronowej z emisją polową (FESEM) i woltamperometrii cyklicznej (CV). Przeprowadziliśmy również dalsze testy stabilności, czułości i odtwarzalności PLA-AuNPs. Stwierdziliśmy, że PLA-AuNP utworzyły solidną strukturę stabilizowanych nanocząstek w roztworze wodnym. Zaobserwowaliśmy również, że czułość poprawiła się w wyniku mniejszej wartości rezystancji przenoszenia ładunku (Rct) i zwiększenia powierzchni czynnej (0,41cm2). Opracowanie naszego biosensora DNA opierało się na modyfikacji elektrody węglowej z sitodrukiem (SPCE) z PLA-AuNPs i wykorzystaniu błękitu metylenowego (MB) jako wskaźnika redoks. Oceniliśmy zdarzenia unieruchomienia i hybrydyzacji za pomocą woltamperometrii impulsowej różnicowej (DPV). Odkryliśmy, że komplementarne, niekomplementarne i niedopasowane oligonukleotydy zostały specjalnie rozróżnione przez wytworzony biosensor. Wykazano również niezawodnie czułe wykrywanie w badaniach reaktywności krzyżowej przeciwko różnym patogenom przenoszonym przez żywność oraz w identyfikacji V. parahaemolyticus w świeżych sercówkach.

Powstanie AuNP ujawniono poprzez zmianę barwy roztworu wodnego w obecności cytrynianu sodu. Spowodowało to zmianę koloru z jasnożółtego na głęboki rubinowy czerwony. Powstanie PLA-AuNP potwierdzono na podstawie widm UV-vis (Rysunek 1), w których odnotowano wzrost piku rezonansu plazmonowego powierzchni (SPR) w okolicach 540 nm. Formowanie i obecność PLA-AuNP wskazano w zakresach długości fali 500-600 nm, w zależności od wielkości cząstek37</...

Przedstawiono protokół rozwoju elektrochemicznego biosensora DNA, składającego się z stabilizowanej kwasem polimlekowym, modyfikowanej nanocząstkami złota, sitodrukowanej elektrody węglowej do wykrywania Vibrio parahaemolyticus.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Vibrio parahaemolyticus (V. parahaemolyticus) is a common foodborne pathogen that contributes to a large proportion of public health problems globally, ...

Patogeny przenoszone przez żywność przyczyniają się do dużej części problemów zdrowia publicznego na całym świecie, które znacząco wpływają na śmiertelność i zachorowalność ludzi. Konwencjonalne metody wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność wymagają skomplikowanej obsługi próbek i są czasochłonne. Ostatnio bioczujniki okazały się obiecującą i kompleksową metodą wykrywania, której zaletą jest szybkie wykrywanie i praktyczność.Rozwój biosensorów opiera się na zmodyfikowanej elektrodzie z nanocząstkami złota stabilizowanymi kwasem polimlekowym. Elektroda węglowa z sitodrukiem została zmodyfikowana w celu zwiększenia powierzchni czynnej elektrody roboczej. Błękit metylenowy stosowany jako kompleks redoks ma silne wiązanie z jednoniciowym DNA unieruchomionego DNA sondy.Ta zależność wysokiej finezji jest reprezentowana przez wysoki prąd szczytowy. Hybrydyzacja jednoniciowego DNA z jego komplementarną sekwencją zastępuje związane cząsteczki błękitu metylenowego, co zmniejsza prąd różnicowej woltamperometrii impulsowej. Mogło to być spowodowane mniejszą ilością błękitu metylenowego zgromadzonego na powierzchni zmodyfikowanej elektrody z komplementarnym dwuniciowym DNA, co było sp

development-an-electrochemical-dna-biosensor-to-detect-foodborne

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Przedstawiono protokół wykrywania trichotecenów (mykotoksyn stanowiących zagrożenie dla zdrowia ludzi) z wykorzystaniem nowo opracowanej metody przesiewowej, opartej na konkurencyjnej metodzie immunochemicznej oraz końcowej detekcji elektrochemicznej.

Metoda ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Electrochemical) do wykrywania mikotoksyn

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału...

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Opisujemy metodę testową z wykorzystaniem czujnika elektrochemicznego do szybkiego wykrywania i identyfikacji bakterii. Badanie wykorzystuje macierz czujników z funkcjonalizowanymi sondami wychwytującymi w postaci oligonukleotydów DNA dla sekwencji specyficznych dla gatunku rybosomalnego RNA (rRNA). Hybrydyzacja typu kanapkowego docelowego rRNA z sondą wychwytującą oraz sondą detekcyjną w postaci oligonukleotydu DNA sprzężonego z peroksydazą chrzanową generuje mierzalny prąd amperometryczny.

Wykrywanie i identyfikacja bakterii z wykorzystaniem czujników elektrochemicznych

Źródło: Barber, A. E., et al. Przygotowanie i zastosowanie nowego biosensora bakteryjnego do przypuszczalnego wykrywania pozostałości po postrzałach z broni palnej. J. Vis. Exp. (2019).Ten film pokazuje wykrywanie określonych analitów za pomocą biosensora bakteryjnego. Pobiera się kulturę bakteryjną zawierającą plazmid z genem białka czerwonej fluorescencji (RFP) pod promotorem wrażliwym na analit. Po dokładnym wytarciu powierzchni testowej niewielką część chusteczki zanurza się w kulturze i...

Wykrywanie docelowego analitu za pomocą biosensora bakteryjnego

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Wprowadzono bezetykietowy optyczny biosensor do szybkiego wykrywania bakterii. Bioczujnik oparty jest na nanostrukturalnym porowatym krzemie, który został zaprojektowany tak, aby bezpośrednio wychwytywać docelowe komórki bakteryjne na swojej powierzchni. Używamy przeciwciał monoklonalnych, unieruchomionych na porowatym przetworniku, jako sond wychwytujących. Nasze badania pokazują możliwość zastosowania tych bioczujników do wykrywania niskich stężeń bakterii w ciągu kilku minut bez...

Optyczne wykrywanie bakterii E. coli za pomocą mezoporowatych biosensorów krzemowych

Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Salmonella spp./Shigella spp. są częstymi patogenami przypisywanymi biegunce. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową platformę do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp. przy użyciu PCR w czasie rzeczywistym w połączeniu z hodowlą sterowaną.

Wysokoprzepustowa platforma do badań przesiewowych w kierunku Salmonella spp./Shigella spp.

Cyfrowy mikrofluidyk oparty na elektrozwilżaniu to technika, która wykorzystuje sterowaną napięciem zmianę pozornego kąta zwilżania kropli o objętości mikrolitra, aby ułatwić jej manipulację. Połączenie tego z funkcjonalizowanymi kulkami magnetycznymi umożliwia integrację wielu operacji laboratoryjnych w celu przygotowania próbki i identyfikacji patogenów za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Cyfrowa platforma mikroprzepływowa oparta na elektrozwilżaniu do zautomatyzowanego testu immunoenzymatycznego

Poznaj metodę opracowania elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania Vibrio parahaemolyticus przy użyciu nanocząstek złota stabilizowanych kwasem polimlekowym. Ta technika zwiększa czułość detekcji patogenów przenoszonych przez żywność.

Opracowanie elektrochemicznego biosensora DNA do wykrywania patogenów przenoszonych przez żywność

Przeglądaj więcej filmów