Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Ogólnym celem tego prostego testu reporterowego opartego na fluorescencji jest badanie przesiewowe składników komórkowych wymaganych do prawidłowego transportu toksyny rycynowej A lub łańcucha RTA w organizmie modelowym drożdży. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące transportu międzykomórkowego rybosomu w aktywacji toksyny B. W naszym przypadku podjednostka cytotoksyczna zwykłej toksyny rycyny z błony plazmatycznej do cytosomu.

Główną zaletą tego testu jest możliwość analizy wpływu pojedynczego genu drożdży na transport RTA w szybki i niedrogi sposób. Rozpocznij ten protokół od transformacji komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zaszczepić pięć mililitrów pożywki kanamycyny LB komórkami zawierającymi plazmid ekspresji RTA lub pusty wektor.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min przez 24 godziny. Uzupełnij jeden litr pożywki LB kanamycyny pięcioma mililitrami prekultury. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,8 do 1,0.

Następnie zmniejsz temperaturę kultury do 28 stopni Celsjusza. Indukować ekspresję RTA E. Coli poprzez dodanie IPTG do końcowego stężenia jednego milimola. Po 3,5 godziny w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 220 obr./min zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.

Następnie przemyj osad pięcioma mililitrami bufora wiążącego i osadu w temperaturze 10 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po jednokrotnym powtórzeniu prania ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach buforu wiążącego. Sonikuj komórki na lodzie za pomocą pięciu cykli 15-sekundowego impulsu i 30-sekundowej przerwy.

Po odwirowaniu likowatu komórkowego w temperaturze 21 000 g i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut, przefiltrować supernatant za pomocą sterylnego systemu filtrów strzykawkowych. Użyj zautomatyzowanego systemu oczyszczania, wyposażonego w pięciomililitrową kolumnę powinowactwa na bazie niklu, aby oczyścić frakcję RTA znakowaną przez HIS ze sterylnego, przefiltrowanego supernatantu E.Coli. Ogólnie rzecz biorąc, należy stosować prędkość względną jednego mililitra na minutę i schłodzić cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyn i utracie aktywności toksyn.

Na krótko zrównoważ kolumnę powinowactwa z 20 mililitrami buforu wiążącego, aby usunąć bufor magazynu. Następnie nanieść sterylny, przefiltrowany supernatant na kolumnę powinowactwa za pomocą strzykawki. Przemyć kolumnę 25 do 35 mililitrami buforu wiążącego w celu usunięcia niezwiązanych białek z kolumny.

Wykonuj etap prania, aż absorbenty UV o długości 280 nanometrów będą zbliżone do początkowej wartości UV. Następnie eluować związaną frakcję RTA za pomocą 20 do 35 mililitrów buforu elucyjnego i utrzymywać próbkę na lodzie. Ważne jest, aby rozpocząć pobieranie próbek frakcji RTA wkrótce po wzroście wartości UV, 280 i zatrzymać pobieranie próbek frakcji RTA, gdy ponownie osiągnie pierwotną linię bazową.

Aby odsolić utraconą frakcję RTA, zastąp kolumnę powinowactwa systemu oczyszczania kolumną odsalającą i zrównoważ kolumnę z 20 mililitrami 0,8 molowego sorbitolu. Nanieść utraconą frakcję RTA do kolumny za pomocą strzykawki. Przemyj kolumnę 100 mililitrami 0,8 molowego sorbitolu i rozcieńcz odsoloną frakcję RTA w 15-mililitrowej probówce, gdy tylko absorpcja UV zacznie wzrastać.

Aby uniknąć zanieczyszczenia solą, należy zatrzymać się przy pobieraniu próbek frakcji bezpośrednio wtedy, gdy przewodność wzrasta. Przechowuj frakcję RTA wymykającą się w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po przekształceniu drożdży zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wybierz trzy różne klony drożdży z każdej płytki.

Zaszczepić klony w 100 mililitrach pożywki rafinozowej lucine dropout przy 220 obr./min i 30 stopniach Celsjusza do gęstości optycznej przy 600 nanometrach od 1,0 do 2,0. Odwirować komórki w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez pięć minut w temperaturze 10 000 g. Po dwukrotnym umyciu komórek pięcioma mililitrami sterylnej wody, ponownie zawiesić komórki w 50 mililitrach buforu sferoplastycznego.

Inkubuj 50-mililitrową kulturę przy 100 obr./min i 30 stopniach Celsjusza przez 90 minut. Po odwirowaniu w temperaturze 400 g i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, umyj komórki dwukrotnie pięciomililitrami stabilizowanej pożywki z rafinozy. Następnie ponownie zawiesić komórki w pięciu mililitrach tego samego podłoża, aby użyć komórek bezpośrednio do pomiarów reporterowych GFP.

Wysiewaj sferoplasty komórek drożdży do 96-dołkowych płytek. Do każdego dołka dodać 70 mikrolitrów stabilizowanej pożywki rafinozowej lucyny, zawierającej kontrolę ujemną, wyrażającą pusty wektor lub oczyszczony RTA w końcowym stężeniu RTA wynoszącym pięć mikromolów. Dodaj 70 mikrolitrów stabilizowanej pożywki lucynowej do każdego z pozostałych dołków, aby zwiększyć ich całkowitą objętość do 270 mikrolitrów.

Aby uzyskać pozytywną kontrolę hamowania białka, dodaj 70 mikrolitrów 0,8-molowego roztworu stabilizowanego sorbitolem G418, ponieważ G418 zapobiega ekspresji GFP w drożdżach. Natychmiast dodać 30 mikrolitrów stabilizowanego roztworu galaktozy w celu wywołania ekspresji GFP. Przygotuj dodatkową kontrolę ujemną, dodając 30 mikrolitrów stabilizowanej pożywki z rafinozy lucyny zamiast 30% galaktozy.

Po zakończeniu przygotowywania próbki umieść 96-dołkową płytkę w czytniku fluorescencji i przygotuj się do pomiaru przy użyciu zestawu filtrów 475, 509 nanometrów wymaganych do wykrywania fluorescencji GFP. Wykonuj pomiary w temperaturze 30 stopni Celsjusza, 120 obr./min i średnicy wstrząsu wynoszącej jeden milimetr w oknie czasowym 20 godzin z odstępami między pomiarami wynoszącymi 10 minut. Pokazano tutaj reprezentatywny wykres oczyszczania chromatografii powinowactwa RTA i kontroli pustego wektora.

Niebieski pik w czarnym polu reprezentuje związaną frakcję RTA. Jak pokazano w czarnej ramce, z kolumny w kontroli ujemnej nie wydostaje się żadne białka. Pokazano tutaj schemat odsalania frakcji RTA oczyszczonej z powinowactwa.

Wykres przedstawia oddzielenie frakcji białka RTA od frakcji soli. Wyniki barwienia Coomassie po udanym oczyszczeniu i odsaleniu pokazują lizat komórkowy lub oczyszczone próbki różnych wariantów RTA. W tym badaniu zastosowano niezmodyfikowany RTA.

Aby zwalidować test reporterowy z odstępami między fluorescencją, zmierzono względną fluorescencję GFP sferoplastów drożdży typu dzikiego w warunkach indukowanych i nieindukowanych po 20 godzinach indukcji GFP. Analizowano również względną fluorescencję GFP w obecności RTA, G418 lub kontroli ujemnej. Zmierzono również względną fluorescencję GFP dla wybranych mutantów, o których wiadomo, że odpowiednie białka są zaangażowane i nie są zaangażowane w transport RTA w drożdżach.

Przerywana linia reprezentowała próg istotności. Po opanowaniu ekspresji i oczyszczania RTA, wyniki testu raportu fluorescencji można otrzymać w ciągu jednego dnia. Ponadto metoda ta toruje drogę naukowcom zajmującym się inaktywacją toksyn B przez rybosomy do badania ich korzeni odurzających w eukariotycznych drożdżach modelowych.