Name: Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A w drożdżach. Ta metoda pozwala szybko i tanio analizować wpływ poszczególnych genów na transport RTA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Części tego badania były uprzejmie wspierane przez grant z Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 1027, A6).

UWAGA: Przegląd ogólnego schematu doświadczalnego przedstawiono na Rysunku 1.
Uwaga: RTA jest wysoce toksyczny dla ludzi. Wymagane jest zezwolenie laboratoryjne S2 (odpowiednik poziomu biosafety level 2). Prosimy o noszenie rękawiczek przez cały czas trwania eksperymentu.
1. Heterologiczna ekspresja białka RTA z tagiem His w Escherichia coli
<ol>
	<li>Przeprowadź transformację komórek E. coli plazmidem ekspresyjnym pET24-RTA(His)6 lub pustym wektorem pET24a(+), stosując standardowe protokoły elektroporacji9,10. Komórki zawierające pusty plazmid służą jako kontrola negatywna.</li>
	<li>Po wyselekcjonowaniu pozytywnych klonów na płytkach LB z kanamycyną (10 µg/mL), zaszczep komórki zawierające plazmid ekspresyjny RTA lub pusty wektor w 5 mL pożywki LBkan (pożywka LB z 100 µg/mL kanamycyny) i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 20 rpm przez 24 h.</li>
	<li>Do 1 L pożywki LBkan dodaj 5 mL prekultury i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przy 20 rpm, aż osiągną OD60 na poziomie 0,8-1,0 (około 3-4 h). Następnie obniż temperaturę hodowli do 28 °C i przygotuj 1 M roztwór zapasowy izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) w H2O.</li>
	<li>Indukuj ekspresję RTA w E. coli poprzez dodanie IPTG do stężenia końcowego 1 mM.</li>
	<li>Po 3,5 h w temperaturze 28 °C przy 20 rpm, zbierz komórki przez wirowanie przy 10 0 x g i 4 °C przez 10 min, przemyj osad dwukrotnie 5 mL buforu wiążącego (50 mM NaCl, 10 mM imidazolu i 20 mM KH2PO4, pH = 7,4) przy 10 00 x g i 4 °C przez 10 min, a następnie resuspenduj osad w 5 mL buforu wiążącego. 
	UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać, a komórki można przechowywać w temperaturze 80 °C przez kilka dni.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie RTA z tagiem His za pomocą chromatografii powinowactwa
<ol>
	<li>Poddać komórki sonikacji na lodzie zgodnie z następującym protokołem: impuls 15 s (20 mikronów), przerwa 30 s. Powtórzyć ten krok pięć razy.</li>
	<li>Wirować lizat komórkowy przy 21 0 x g i 4 °C przez 15 min, a następnie przefiltrować nadsącz za pomocą sterylnego systemu filtracji strzykawkowej (rozmiar porów 0,2 µm). 
	UWAGA: Osady komórkowe z poprawnie sonikowanych próbek mają przezroczyste brzegi.</li>
	<li>Użyć zautomatyzowanego systemu oczyszczania wyposażonego w kolumnę powinowactwa opartą na Ni2+ o pojemności 5 mL w celu oczyszczenia frakcji RTA z znacznikiem His z przefiltrowanego sterylnie nadsączu E. coli. Generalnie należy stosować prędkość elucji 1 mL/min i chłodzić cały system oczyszczania, aby zapobiec nieefektywnemu wiązaniu toksyny oraz utracie jej aktywności. 
	UWAGA: Parametry efektywnego oczyszczania RTA wymieniono w Tabeli 1. Więcej informacji znajduje się w pracy Beckera et al9.
	<ol>
		<li>W skrócie: wyrównać kolumnę powinowactwa 20 mL buforu wiążącego, aby usunąć bufor do przechowywania. Nadsącz przefiltrowany sterylnie nanieść na kolumnę powinowactwa za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 25-35 mL buforu wiążącego, aby usunąć z niej niewiążące się białka. Etap przemywania prowadzić do momentu, gdy absorbancja UV przy 280 nm zbliży się do początkowej wartości UV.</li>
		<li>Eluować związaną frakcję RTA w 20-35 mL buforu elucyjnego (50 mM imidazolu, 50 mM NaCl, 20 mM KH2PO4, pH = 7,2) i przechowywać próbkę na lodzie (Rysunek 2A i Rysunek 2B). 
		UWAGA: Elucja frakcji RTA objawia się wzrostem absorpcji UV. Należy zbierać wyłącznie tę frakcję, aby uniknąć zanieczyszczenia niespecyficznie związanymi białkami.</li>
		<li>Wykorzystać 20 µL eluatów do przeprowadzenia barwienia błękitem Coomassie1 lub analizy Western blot12,13 (opcjonalnie). Użyć przeciwciał pierwszorzędowych anty-His (1:1 0) oraz przeciwciał drugorzędowych anty-mouse-IgG-HRP (1:10 0) w celu wykrycia RTA i weryfikacji czystości próbki (Rysunek 3).</li>
		<li>Odsolić eluowaną frakcję RTA na kolumnie odsalającej 5 mL i wyrównać próbkę w 0,8 M sorbitolu.
		<ol>
			<li>Zastąpić kolumnę powinowactwa w systemie oczyszczania kolumną odsalającą, a następnie wyrównać kolumnę 20 mL 0,8 M sorbitolu.</li>
			<li>Nanieść eluowaną frakcję RTA na kolumnę za pomocą strzykawki. Przemyć kolumnę 10 mL 0,8 M sorbitolu i eluować odsoloną frakcję RTA do probówki 15 mL, gdy tylko absorpcja UV zacznie rosnąć (Rysunek 2C).</li>
			<li>Przechowywać eluowaną frakcję RTA w temperaturze 4 °C. 
			UWAGA: Natychmiast przerwać pobieranie frakcji RTA po wzroście przewodności, aby uniknąć zanieczyszczenia solą. Parametry procedury odsalania wymieniono w Tabeli 1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skoncentrować eluowaną frakcję RTA przy 10 0 x g i 4 °C przez 30-180 min przy użyciu kolumny wirówkowej z granicą odcięcia 10 kDa do końcowej objętości 1-2 mL i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez 3-4 tygodnie. 
	Uwaga: Nie zamrażać próbki, ponieważ mrożenie prowadzi do całkowitej utraty aktywności RTA.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie białka za pomocą konwencjonalnego zestawu do oznaczania białek. Stężenie białka powinno mieścić się w zakresie 1-1,5 mg/mL. 
	UWAGA: RTA ma tendencję do wytrącania się, jeśli stężenie białka jest zbyt wysokie (&gt;5 mg/mL).</li>
</ol>
3. Transformacja drożdży i usuwanie ściany komórkowej
<ol>
	<li>Wykonaj transformację szczepu dzikiego lub wybranych mutantów delecyjnych drożdży plazmidem reporterowym GFP pRS315-K28SP-GFP6 przy użyciu standardowych metod transformacji octanem litu14. Inkubuj komórki na płytkach z glukozą z brakiem leucyny (d/o) (2% glukozy, 1,5% agaru, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% Yeast Nitrogen Base (YNB) i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny) w temperaturze 30 °C przez 2-3 dni w celu selekcji pozytywnych klonów.</li>
	<li>Wyselekcjonuj 3 różne klony drożdży z każdej płytki i zaszczep je w 10 mL pożywki z rafinozą z brakiem leucyny (2% rafinozy, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny) przy 20 rpm i 30 °C do osiągnięcia OD60 = 1,0-2,0 (2-4 x 107 komórek/mL). 
	UWAGA: Tempo wzrostu różnych szczepów delecyjnych drożdży jest zróżnicowane. Monitoruj OD60 za pomocą spektrofotometru.</li>
	<li>Aby obliczyć wartości OD60 , rozcieńcz próbki do OD60 = 0,1-0,3 (rozcieńczenia od 1:5 do 1:10) i zmierz OD600 w spektrofotometrze. Jako referencję zastosuj H2O uzupełnioną o odpowiadającą ilość pożywki z rafinozą z brakiem leucyny. Na koniec resuspenduj OD60 = 125 w 5 mL sterylnej wody (5 x 108 komórek/mL).</li>
	<li>Odwiruj komórki w temperaturze 25 °C przez 5 min przy 10 0 x g, przemyj komórki dwukrotnie 5 mL sterylnej wody i resuspenduj komórki w 50 mL buforu do sferoplastowania (0,8 M sorbitolu, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM CaCl2, 2 mM ditiotreitolu (DTT) i 20 µg/mL enzymu litycznego).</li>
	<li>Inkubuj 50 mL hodowli przy 10 rpm i 30 °C przez 90 min. Opcjonalnie: Monitoruj tworzenie sferoplastów co 15 min za pomocą mikroskopii kontrastowej. Pod mikroskopem komórki powinny mieć ciemny, półprzezroczysty szary kolor. Komórki jasne (refrakcyjne) są niedostatecznie strawione, natomiast „duchy” (blado szare komórki z niewielką lub żadną strukturą wewnętrzną) są nadmiernie strawione.</li>
	<li>Sprawdź wydajność preparatyki sferoplastów dla każdej próbki.
	<ol>
		<li>Po zakończeniu kroku 3.5 zmieszaj 4 µL sferoplastowanej hodowli 50 mL z 496 µL buforu do sferoplastowania (około 2 × 106 sferoplastów) i odwiruj przez 10 min przy 40 x g.</li>
		<li>Resuspenduj osad w 10 mL destylowanej H2O, wymieszaj próbkę na wortexie przez 30 s i wysiej 10 µL próbki na płytki z glukozą z brakiem leucyny (2% glukozy, 1,5% agaru, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny).</li>
		<li>Inkubuj komórki przez 3 dni w temperaturze 30 °C. Policz całkowitą liczbę wyrośniętych kolonii komórkowych na płytce. Do ewaluacji danych wykorzystaj tylko próbki o wydajności wyższej niż 98% (całkowita liczba kolonii komórkowych &lt;40 kolonii/płytkę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwiruj komórki z kroku 3.5 przy 40 x g i 4 °C przez 10 min i przemyj komórki dwukrotnie 5 mL stabilizowanej pożywki z rafinozą z brakiem leucyny (0,8 M sorbitolu, 2% rafinozy, 0,5% siarczanu amonu, 0,17% YNB i 0,087% mieszanki d/o bez leucyny). Resuspenduj komórki w 5 mL stabilizowanej pożywki z rafinozą z brakiem leucyny (1 x 108 komórek/mL) i użyj ich bezpośrednio do pomiarów w teście reporterowym GFP (Sekcja 4).</li>
</ol>
4. Pomiar testu reporterowego GFP w płytkach 96-dołkowych
<ol>
	<li>Przenieś sferoplasty komórek drożdży otrzymane w kroku 3.7 do płytek 96-dołkowych (200 µL/well).</li>
	<li>Dodaj 70 µL podłoże z ustabilizowaną leucyną bez rafinozy zawierające kontrolę negatywną (eluat z Ni2+-oczyszczony metodą powinowactwa lizat komórkowy z indukowanych IPTG E. coli komórki wykazujące ekspresję pustego wektora) lub oczyszczone RTA w końcowym stężeniu RTA wynoszącym 5 µM (odpowiadające stężeniu 160 g/L RTA) w każdej dołku.</li>
	<li>Niezwłocznie dodać 30 µL stabilizowany roztwór galaktozy (30% galaktozy, 0,8 M sorbitolu) w celu indukcji ekspresji GFP i następnego rozpoczęcia pomiaru. 
	UWAGA: Należy przeprowadzić co najmniej 3 powtórzenia techniczne dla każdego eksperymentu oraz 3 powtórzenia biologiczne dla każdego szczepu drożdży.</li>
	<li>Po zakończeniu przygotowania próbek (kroki 4.1-4.3), umieść płytkę 96-dołkową w czytniku fluorescencji i rozpocznij pomiar. Użyj zestawu filtrów 475/509 nm wymaganego do detekcji fluorescencji GFP. Wykonaj pomiary przy 30 °Cprzy 120 obr./min i średnicy wstrząsania 1 mm w oknie czasowym 20 h (interwały pomiarowe co 10 min). 
	UWAGA: Zestaw filtrów GFP jest zazwyczaj dostępny we wszystkich systemach odczytu. Temperaturę, okno czasowe, odstępy między pomiarami oraz stężenie RTA można dostosować do własnych potrzeb. Reprezentatywne wyniki przedstawiono w Rysunek 4.</li>
	<li>Opcjonalnie: W celu kontroli jakości w pomiarze można zastosować dodatkowe kontrole wewnętrzne. Kontrolę negatywną przygotowuje się poprzez dodanie 30 µL stabilizowane pożywka leucynowa d/o z rafinozą zamiast 30% galaktozy (brak indukcji GFP). Dodatkowo dodać 70 µL roztworu G418 stabilizowanego 0,8 M sorbitolem (300 µg/mL). Inhibitor translacji białek G418 służy jako kontrola pozytywna hamowania syntezy białek, ponieważ zapobiega on ekspresji GFP w drożdżach.</li>
	<li>Oblicz względną fluorescencję GFP w procentach dla punktu czasowego 20 h zgodnie z poniższym równaniem (patrz Rysunek 4A):  <img alt="Równanie względnej fluorescencji dla analizy próbek w spektroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/56588/56588eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie">   gdzie NC to kontrola negatywna
	<ol>
		<li>Alternatywnie, wyznacz względną fluorescencję GFP dla każdego punktu pomiarowego (w tym przypadku co 10 min, patrz również krok 4.4), korzystając z powyższego równania. Jak pokazano w Rycina 4Bstworzyć wykres, nanosząc natężenia fluorescencji GFP (oś y) w funkcji czasu (oś x).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding-competent+and+folding-defective+forms+of+ricin+A+chain+have+different+fates+after+retrotranslocation+from+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum.</a> Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).</li>
<li>Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+entry+of+Shiga-like+toxin+a+chain+from+the+yeast+endoplasmic+reticulum+requires+catalytically+active+Hrd1p%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p.</a> PLoS One. 7 (7), e41119(2012).</li>
<li>Moreau, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screens+identify+genes+required+for+Ricin+and+PE+intoxications%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications.</a> Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).</li>
<li>Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+toolbox+for+assessing+protein+location+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The fluorescent toolbox for assessing protein location and function.</a> Science. 312 (5771), 217-224 (2006).</li>
<li>Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+an+external+Lys-Asp-Glu-Leu+%28KDEL%29+protein+from+the+plasma+membrane+to+the+endoplasmic+reticulum%3A+studies+with+cholera+toxin+in+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells.</a> J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).</li>
<li>Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Reporter+Assay+to+Identify+Cellular+Components+of+Ricin+Toxin+A+Chain+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking.</a> Toxins (Basel). 8 (12), (2016).</li>
<li>Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+depurination+is+not+sufficient+for+ricin-mediated+cell+death+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae.</a> Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).</li>
<li>Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ricin%3A+structure%2C+mode+of+action%2C+and+some+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Ricin: structure, mode of action, and some current applications.</a> Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).</li>
<li>Becker, B., Schmitt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adapting+yeast+as+model+to+study+ricin+toxin+a+uptake+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking.</a> Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).</li>
<li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24674070">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+estimation+of+polypeptide+chains+by+electrophoresis+in+SDS-polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.</a> Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications.+1979%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979.</a> Biotechnology. 24, 145-149 (1992).</li>
<li>Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+intact+yeast+cells+treated+with+alkali+cations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations.</a> J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).</li>
<li>Vitetta, E. S., Yen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+functional+properties+of+genetically+engineered+ricin+B+chain+lacking+galactose-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity.</a> Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).</li>
<li>Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+an+endoplasmic+reticulum+retrieval+sequence+to+ricin+A+chain+significantly+increases+its+cytotoxicity+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells.</a> J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).</li>
<li>Breslow, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+strategy+enabling+high-resolution+functional+analysis+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome.</a> Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymocin%2C+a+composite+chitinase+and+tRNase+killer+toxin+from+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast.</a> Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).</li>
<li>Jablonowski, D., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+RNA+polymerase+II+is+affected+by+Kluyveromyces+lactis+zymocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin.</a> J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).</li>
<li>Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kluyveromyces+lactis+zymocin+mode+of+action+is+linked+to+RNA+polymerase+II+function+via+Elongator%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator.</a> Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas wykonywania powyższego protokołu zalecamy następujące sugestie, aby osiągnąć pomyślny wynik eksperymentu.
W przypadku ekspresji białek heterologicznych ważne jest, aby nie przekraczać stężenia IPTG wynoszącego 1 mM. Stężenia IPTG >1 mM hamują indukowaną przez promotor ekspresję RTA i prowadzą do obniżenia wydajności toksyn. Ponadto komórki nie powinny być hodowane w temperaturach wyższych niż 28 °C, aby zapobiec tworzeniu się ciał inkluzyjnych, nieefektywnemu fałdowaniu i inaktywacji t...

Pacjenci cierpiący na infekcje wywołane przez bakterie wytwarzające toksyny stanowią poważne obciążenie medyczne i finansowe dla każdego systemu opieki zdrowotnej, zwłaszcza że nadal w dużej mierze brakuje skutecznych metod leczenia. Aby opracować nowe strategie terapeutyczne, należy w pełni zrozumieć złożone mechanizmy zatrucia istotnymi z medycznego punktu widzenia toksynami A/B, takimi jak toksyna, toksyna Shiga lub rycyna, w oparciu o nowe, potężne testy, które muszą zostać wdrożone.
W ostatnich latach kilka badań próbowało analizować transport toksyn A/B w komórkach drożdży i ssaków przy użyciu czasochłonnych i kosztownych metod, takich jak znakowanie toksyn radioaktywnych1,2 oraz podejścia przesiewowe oparte na siRNA3. W niektórych przypadkach transport toksyn został uwidoczniony in vivo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej po chemicznym i/lub genetycznym sprzężeniu poszczególnych podjednostek toksyny z fluoroforami, kropkami kwantowymi lub białkami fluorescencyjnymi4,5. Niestety, takie modyfikacje często prowadzą do nieaktywnych i/lub zmienionych naturalnych właściwości toksyn. Innym eleganckim sposobem pośredniego odpowiadania na różnorodne pytania naukowe jest zastosowanie systemów reporterowych opartych na enzymach takich jak lacZ, lucyferazy lub białka fluorescencyjne (np. GFP lub Discosoma sp. czerwone białko fluorescencyjne (dsRed)).
W tym manuskrypcie opisany jest prosty protokół, który identyfikuje składniki komórkowe niezbędne do wewnątrzkomórkowego transportu pozakomórkowego RTA u S. cerevisiae. W ten sposób plazmid reporterowy fluorescencji zawierający N-końcowy sygnał importu ER, po którym następuje GFP, działa jako czujnik biosyntezy białek, który pośrednio mierzy hamowanie translacji białek za pośrednictwem RTA przez emisję fluorescencji GFP po translacji in vivo6. W przypadku, gdy endocytoza RTA i/lub transport wewnątrzkomórkowy są negatywnie (lub pozytywnie) dotknięte w określonym mutancie delecji drożdży w porównaniu z typem dzikim, można to wykryć poprzez wzrost (lub spadek) emisji fluorescencji GFP6.
Do tej pory wszystkie metody analizujące transport RTA w komórkach drożdży ograniczały się do procesu retrotranslokacji RTA z ER-do cytozolu. W takim sztucznym systemie RTA zawierający sygnał importu ER jest wyrażany z indukowalnego promotora, co skutkuje samobójczym fenotypem1,7. Chociaż w konfiguracji eksperymentalnej opisanej w tym manuskrypcie brakuje również podjednostki B wiążącej komórki, a zatem nie reprezentuje ona w pełni naturalnej sytuacji zatrucia holotoksyną rycyny8, transport toksyny z błony komórkowej przez aparat Golgiego do ER może być ściśle naśladowany w tym nowatorskim teście. Co ciekawe, wstępne wyniki uzyskane w badaniu pilotażowym wskazują, że szlaki przemytu wykorzystywane przez RTA wykazują uderzające podobieństwa do drogi zatrucia holotoksyną rycyny.
Podsumowując, opisana metoda może być użyta do określenia specyficznej roli wybranych białek komórkowych w endocytozie RTA i transporcie drożdży. Co więcej, ten eksperymentalny układ można łatwo dostosować do innych toksyn inaktywujących rybosomy wytwarzanych i wydzielanych z różnych gatunków drożdży i bakterii, takich jak zymocyna lub toksyna Shiga.

<table><tbody><tr><td>Szczepy bakteryjne i drożdżowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL21 DE3(Gold)</td><td>Aligent Technologies</td><td>230130</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742</td><td>Euroscarf</td><td>Y10000</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae BY4742 delecja mutanty</td><td>Dharmacon</td><td>YSC1054</td><td>cała kolekcja</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plazmidy używane w tym protokole</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET24a(+) (Novagen)</td><td>Millipore</td><td>69772-3</td><td></td></tr><tr><td>pET-RTA(His6)</td><td>Becker et al. (2016)3</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyaza 20T</td><td>USBio</td><td>Z1000.250</td><td>enzym lityczny do ściany komórkowej usuwanie</td></tr><tr><td>Pożywki bulionowej LB</td><td>Thermo Scientific 10855021</td><td></td><td>15 g agar został dodany do produkcji płytek</td></tr><tr><td>YNB</td><td>Thermo Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dodatki do mieszanek drożdżowych bez leucyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1376-20G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05040-100G</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>D-rafinoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400-25G</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750-10MG</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>11811031</tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>3899.1</td><td></td></tr><tr><td>PAGE linijka wstępnie barwiona</td><td>Fermentas</td><td>26616</td><td>drabinka białkowa używana do analizy zachodniej</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiał do oczyszczania RTA, odsalania i pomiarów czytnikowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Ultrospec 2100 pro</td><td>Amersham</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soniprep 150</td><td>MSE</td><td></td><td>stary model, dostępne inne modele</td></tr><tr><td>Fluoroskan Ascent</td><td>Thermo Scientific</td><td>5210470</td><td>stary model, już niedostępny</td></tr><tr><td>& Auml; KTAPurifier</td><td>Thermo Scientific 28406266</td><td></td><td>Produkt został wycofany i wymieniony</td></tr><tr><td>Kolumna HisTRAP HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca HiTRAP</td><td>GE Healthcare</td><td>11-0003-29</td><td></td></tr><tr><td>Filtr sterylny Midisart</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td>0,2 i mikro; m Zestaw</td></tr> do <tr><td>oznaczania białek BCA</td><td>Pierce</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania 660 nm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Thermo Scientific</td><td>260860</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Przeciwciała (opcjonalnie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tetra-His</td><td>Qiagen</td><td>34670</td><td>przeciwciało pierwszorzędowe; rozcieńczenie 1:1,000</td></tr><tr>Przeciwciało drugorzędowe<td>Anti-mouse-HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9044-2ML</td><td>, rozcieńczenie 1:10,000</td></tr></tbody></table>

prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej a (rta) w drożdżach

A Simple Fluorescence-based Reporter Assay to Identify Cellular Components Required for Ricin Toxin A Chain (RTA) Trafficking in Yeast

Bakteryjne i roślinne toksyny A/B wykorzystują naturalne szlaki transportowe w komórkach eukariotycznych, aby dotrzeć do swojego wewnątrzkomórkowego celu w cytozolu i ostatecznie zabić. Takie toksyny A/B na ogół składają się z enzymatycznie aktywnej podjednostki A (np. toksyny rycynowej A (RTA)) i jednej lub więcej podjednostek B wiążących komórki, które są odpowiedzialne za wiązanie toksyny z określonymi receptorami na powierzchni komórki. Nasza obecna wiedza na temat tego, w jaki sposób toksyny A/B są zdolne do skutecznego odurzania komórek, pomogła naukowcom zrozumieć podstawowe mechanizmy komórkowe, takie jak endocytoza i wewnątrzkomórkowe sortowanie białek w wyższych komórkach eukariotycznych. Z medycznego punktu widzenia ważne jest również zidentyfikowanie głównych szlaków transportu toksyn w celu znalezienia odpowiednich rozwiązań terapeutycznych dla pacjentów lub ostatecznie opracowania terapeutycznych zastosowań opartych na toksynach w terapii raka.
Ponieważ analizy całego genomu transportu toksyn A/B w komórkach ssaków są skomplikowane, czasochłonne i kosztowne, przeprowadzono kilka badań nad transportem toksyny A/B w modelowym organizmie drożdży Saccharomyces cerevisiae. Pomimo tego, że są mniej złożone, podstawowe procesy komórkowe w drożdżach i wyższych komórkach eukariotycznych są podobne i bardzo często wyniki uzyskane w drożdżach można przenieść na sytuację ssaków.
Tutaj opisujemy szybki i łatwy w użyciu test reporterowy do analizy wewnątrzkomórkowego transportu RTA w drożdżach. Istotną zaletą nowego testu jest możliwość zbadania nie tylko retrotranslokacji RTA z retikulum endoplazmatycznego (ER) do cytozolu, ale także endocytozy i wstecznego transportu toksyn z błony komórkowej do ER. Test wykorzystuje plazmid reporterowy, który umożliwia pośredni pomiar toksyczności RTA poprzez emisję fluorescencyjną białka zielonej fluorescencji (GFP) po translacji in vivo. Ponieważ RTA skutecznie zapobiega inicjacji biosyntezy białek poprzez deprydację 28S rRNA, test ten umożliwia identyfikację białek komórek gospodarza zaangażowanych w wewnątrzkomórkowy transport RTA poprzez wykrywanie zmian w emisji fluorescencji.

Ogólny przebieg protokołu opisanego w niniejszej pracy przedstawiono na Rysunku 1, co w przybliżeniu podsumowuje poszczególne etapy skutecznego oczyszczania RTA oraz następujący po nim eksperyment z wykorzystaniem testu reporterowego GFP. Bardziej szczegółowy opis każdego z etapów znajduje się w protokole. Rysunek 2 ilustruje oczekiwany wynik skutecznego oczyszczania RTA za pomocą chromatografii powinowactwa (<strong class="xfig"...

W manuskrypcie opisujemy użycie testu reporterowego fluorescencji na bazie drożdży do identyfikacji składników komórkowych zaangażowanych w procesy transportu i zabijania podjednostki cytotoksycznej A toksyny roślinnej rycyny (RTA).

Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Bacterial and plant A/B toxins exploit the natural trafficking pathways in eukaryotic cells to reach their intracellular target(s) in the cytosol and to ...

Ogólnym celem tego prostego testu reporterowego opartego na fluorescencji jest badanie przesiewowe składników komórkowych wymaganych do prawidłowego transportu toksyny rycynowej A lub łańcucha RTA w organizmie modelowym drożdży. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące transportu międzykomórkowego rybosomu w aktywacji toksyny B. W naszym przypadku podjednostka cytotoksyczna zwykłej toksyny rycyny z błony plazmatycznej do cytosomu.Główną zaletą tego testu jest możliwość analizy wpływu pojedynczego genu drożdży na transport RTA w szybki i niedrogi sposób. Rozpocznij ten protokół od transformacji komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zaszczepić pięć mililitrów pożywki kanamycyny LB komórkami zawierającymi plazmid ekspresji RTA lub pusty wektor.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min przez 24 godziny. Uzupełnij jeden litr pożywki LB kanamycyny pięcioma mililitrami prekultury. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 220 obr./min, aż komórki osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,8 do 1,0.Następnie zmniejsz temperaturę kultury do 28 stopni Celsjusza. Indukować ekspresję RTA E. Coli poprzez dodan

a-simple-fluorescence-based-reporter-assay-to-identify-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano niezawodną metodę monitorowania transportu organelli do kwaśnego światła wakuoli drożdżowej w celu ich degradacji i recyklingu. Metoda ta opiera się na specyficznym znakowaniu docelowych organelli za pomocą genetycznie kodowanego dwuemisyjnego fluorescencyjnego biosensora pH oraz wizualizacji pojedynczych komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej do monitorowania mitofagii w drożdżach Saccharomyces cerevisiae

Drożdże szczapowe, Schizosaccharomyces pombe, stanowią dobry system modelowy do badania podstawowych procesów komórkowych. W niniejszej pracy opisujemy metodę ilościowej analizy żywych komórek drożdży szczapowych. W tym konkretnym doświadczeniu skupiamy się na organizacji genomu w obrębie jądra komórkowego, jednak metoda ta może być również wykorzystana do badania czynników cytozolowych.

Ilościowa analiza fluorescencyjna żywych komórek drożdży szczepowych przy użyciu mikroskopii

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje indukowalną ekspresję łańcucha A toksyny A (RTA) oznaczonej Hisem w Escherichia coli. Przedstawia etapy selektywnej hodowli bakterii przekształconych plazmidem ekspresyjnym, indukcję ekspresji RTA oznaczoną tagiem His oraz przygotowanie bakterii do dalszej analizy.

Indukowalna ekspresja łańcucha toksyny rycynowej A oznaczonej hastydyną w E. coli

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę szybkiej budowy sztucznych czynników transkrypcyjnych (ATF) z pokrewnymi reporterami GFP oraz ilościowe określenie zdolności ATF do stymulowania ekspresji GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Szybka synteza i badania przesiewowe chemicznie aktywowanych czynników transkrypcyjnych za pomocą reporterów opartych na GFP

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Translokacja efektorowa do komórek gospodarza poprzez system wydzielania typu III jest powszechną strategią wirulencji wśród bakterii Gram-ujemnych. Zastosowano test oparty na fuzji efektorowej beta-laktamazy do ilościowej analizy translokacji. W komórkach zakażonych Yersinia konwersja reportera FRET przez beta-laktamazę jest monitorowana za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej.

Analiza translokacji efektorowej Yersinia enterocolitica do komórek gospodarza za pomocą fuzji efektorów beta-laktamazy

Dokładna kwantyfikacja zdarzeń związanych z transportem pęcherzykowym często dostarcza kluczowych informacji na temat ról poszczególnych białek i skutków mutacji. W pracy przedstawiono metody wykorzystania superekliptycznej pHluoryny, wrażliwego na pH wariantu GFP, jako narzędzia do ilościowego oznaczania zdarzeń endocytarnych w żywych komórkach za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Zastosowania pHluorin do ilościowej, kinetycznej i wysokoprzepustowej analizy endocytozy u pączkujących drożdży

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Śledzenie indywidualnych zdarzeń translacji pozwala na badania kinetyczne w wysokiej rozdzielczości mechanizmów translacji zależnych od czapek. Tutaj demonstrujemy test pojedynczej cząsteczki in vitro oparty na obrazowaniu interakcji między fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami a powstającymi peptydami znakowanymi epitopami. Metoda ta umożliwia jednocząsteczkową charakterystykę kinetyki inicjacji i wydłużania peptydów podczas aktywnej translacji in vitro zależnej od kapu.

Test obrazowania pojedynczych cząsteczek in vitro do analizy kinetyki translacji zależnej od czapeczki

Poznaj test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A w drożdżach. Ta metoda pozwala szybko i tanio analizować wpływ poszczególnych genów na transport RTA.

Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal

Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Przeglądaj więcej filmów