Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)
8 stycznia 2018
Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.
Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie bezpośredniej i pośredniej komunikacji między pierwotnymi komórkami raka piersi a monocytami w trójwymiarowym systemie kohodowli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mikrośrodowiska zapalnego raka piersi, takie jak to, w jaki sposób komórki odpornościowe są klasyfikowane i aktywowane, w jaki sposób komórki te pomagają w utrzymaniu mikrośrodowiska zapalnego guza i jak to mikrośrodowisko ułatwia inwazję komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona przystępną cenowo alternatywę dla badania komunikacji wewnątrz guza i ilustruje potencjał trójwymiarowych systemów komórkowych in vitro do badania określonych cech biologii nowotworu.
Szczególnie te związane z agresją nowotworową. Na początek hoduj dwa razy od 10 do szóstego monocytów U937 i THP1 w 10 mililitrach pożywki RPMI1640, uzupełnionej 10 procentami FBS i jednym procentem antybiotyku przeciwgrzybiczego. Uprawiaj również świeże PM w uzupełnionym podłożu DMEMF12.
Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Płytka cztery razy od 10 do piątych monocytów w jednym mililitrze na studzienkę odpowiadającego im podłoża. Umieścić wkładkę w każdym dołku i dodać 900 mikrolitrów czterokrotnie 10 do piątej zawiesiny komórek BrC w odpowiednim podłożu.
Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez pięć dni i odzyskaj supernatanty. Odzyskaj komórki przez trypsynizację, jeśli przeprowadzana jest późniejsza analiza. Uwzględnij kontrole poszczególnych kultur komórkowych za pomocą odpowiednich pożywek.
Aby oznaczyć komórki BrC i monocyty dostępną w handlu kumeryną i rodaminą przed hodowlą komórkową, należy przygotować monowarstwę dwa razy 10 do szóstych komórek BrC będących przedmiotem zainteresowania i zastąpić wzorcową pożywkę wystarczającą, wstępnie podgrzanym roztworem roboczym barwnika fluorescencyjnego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie odessaj roztwór barwnika i użyj wystarczającej ilości XPBS, aby delikatnie przepłukać komórki.
Odessać PBS i dodać pożywkę wzorcową. Aby trypsynizować komórki, dodaj dwa mililitry 05-procentowej trypsyny i 0,48 milimolowego EDTA do kolby i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Dodaj 200 mikrolitrów FBS, aby zatrzymać trypsynizację i siedem mililitrów odpowiedniej pożywki bez suplementów.
Ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie, a następnie przenieść 10 mikrolitrów komórek do komory Nuebauera i policzyć je. Następnie osadzaj komórki w temperaturze 430 razy g i temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie wyrzuć supernatant i użyj trzech mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego, aby ponownie zawiesić ogniwa. Inkubuj zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut.
Po ponownym granulowaniu komórek wyrzuć roztwór roboczy barwnika i użyj od pięciu do siedmiu mililitrów jednego XPBS, aby delikatnie ponownie zawiesić ogniwa. Następnie, po ponownym granulowaniu komórek i wyrzuceniu PBS, ponownie zawiesić komórki w pięciu do siedmiu mililitrach standardowego podłoża. Policz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek.
Stwórz kokulturę, rozprowadzając wystarczającą ilość ECME na dnie studzienki, aby utworzyć równą warstwę w każdym dołku systemu szkiełek czterostudniowych. Płytka 20 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki zawierającej pięć razy od 10 do piątej znakowanych komórek BrC na dołek. Po 15 do 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj zawiesinę 2,5 razy 10 do piątych znakowanych monocytów w 80 mikrolitrach pożywki testowej uzupełnionej 60 procentami ECME.
Pozwól ECME zestalać się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Teraz dodaj jeden mililitr mieszaniny jeden do jednego komórek BrC i pożywki do hodowli monocytów. Inkubuj kokultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 24 godziny, 48 godzin lub pięć dni, aby śledzić zmiany w różnych punktach czasowych.
Aby zdegradować białka ECM i odzyskać komórki z hodowli, odessać i wyrzucić pożywkę, a następnie dodać 0,5 mililitra jednego XPBS z 0,1 procent trypsyny i 0,25 procent EDTA do hodowli. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji dodaj 0,5 mililitra jednego XPBS z 10-procentowym FBS, aby zneutralizować trypsynę i ponownie zawiesić komórki poprzez energiczne pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
Po zagnieżdżeniu komórek wyrzuć supernatant i ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach jednego XPBS z 10 procentami FBS. Powtórz ten krok raz. Poddać zawieszenie komórki faksowi za pomocą odpowiedniego przyrządu.
Upewnij się, że końcowe populacje są czyste w co najmniej 95 procentach. W każdym dołku systemu szkiełek z ośmioma dołkami rozprowadź 40 mikrolitrową bazę ECME i pozwól jej zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wysiewać 800 komórek MCF10 A na studzienkę w 400 mikrolitrach uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM F12 zgodnie z protokołem tekstowym.
Następnie dodać 400 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki lub uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM F12 z 20 nanogramami na mililitr ludzkiej rekombinowanej IL1 beta. Umieść szkiełko komory w szklanej szalce Petriego zawierającej 35-mililitrową szalkę Petriego wypełnioną dwoma mililitrami PBS. Komórki MCF 10A należy wysiewać w każdym dołku bardzo powoli, aby uniknąć uszkodzenia podstawy ECME i zapobiec osiadaniu komórek i tworzeniu monolii.
Za pomocą mikroskopu optycznego rejestruj tworzenie się gruczołów acini co 24 godziny przez 14 dni. Po 14 dniach hodowli dodać 100 mikrolitrów 100 nanomolowych dapy do jednego XPBS i inkubować próbki w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając przez 25 minut. Przepłukać próbki jednym XPBS w temperaturze pokojowej, trzy razy przez pięć minut, z których każdy ciągle mieszając.
Do montażu preparatów należy użyć podłoża montażowego przeznaczonego do barwienia fluorescencyjnego. Następnie zapieczętuj zamontowane próbki przezroczystym pastą i utrzymuj szkiełka w stanie chronionym przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Procedurę w mikroskopie konfokalnym zademonstruje Vadim Perez, badacz z The National Laboratory of Advanced Microscoping.
Analizuj acini za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykonując obrazy poprzecznych stosów na różnych głębokościach acini. Wizualizuj różne białka komórkowe w acini za pomocą odpowiednich protokołów barwienia. Na przykład kaheren został tutaj wybarwiony, aby ocenić adhezję między komórkami, polaryzację komórek i tworzenie oralimen.
Morfologię pierwotnych komórek BrC rosnących w kulturach 3D o niskiej i wysokiej gęstości badano przez pięć dni. W ciągu pierwszych 48 godzin komórki przylegają do ECME o wydłużonym kształcie wrzeciona i po pięciu dniach tworzą struktury przypominające dzianiny. Po pięciu dniach w kokulturach 3D zarówno komercyjne komórki BrC MCF7, jak i MDA-MB-231 utworzyły zdezorganizowane agregaty.
Jednak agresywne ogniwa MDA-MB-231 dla agregatów o wydłużonych formach, natomiast nieagresywne ogniwa MCF7 dla agregatów o zaokrąglonych kształtach, które są gęściej zagęszczone niż ogniwa MDA-MB-231. Zebrano supernatanty z interakcji, w oddziaływaniach pośrednich 3D, pierwotnych kultur BrC i ich pięciodniowych kokultur z pierwotnymi monocytami. Istotnie podwyższone poziomy IL1 beta i IL8 zaobserwowano w pierwotnych kokulturach monocytów komórek BrC.
Zarówno kluczowe, jak i zapalne cytokiny, które wcześniej były związane z progresją nowotworu. Komórki MCF10A hodowano z dwoma różnymi supernatantami z dwóch pierwotnych linii komórkowych BrC, aby obserwować tworzenie światła jako miarę odporności na anoykis. W przeciwieństwie do komórek MCF10A hodowanych w standardowych warunkach, mikroskopia dwukonfokalna w 14 dniu, poprzeczne cięcia sferoid pokazują, że komórki MCF10A uniknęły anoykis, mierzone przez zliczenie liczby komórek centralnych w acini.
Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza medyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Przetestuj szlaki sygnałowe w obu migracjach nowotworów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrośrodowiskami nowotworowymi do zbadania komunikacji komórek raka piersi z komórkami masowymi, fibroblastami, neutrofilami, a nawet różnymi klonami komórek nowotworowych w systemach kohodowli 3D.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustanowić system hodowli 3D do modelowania mikrośrodowiska guza.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje trójwymiarową metodę hodowli służącą do analizy morfologii pierwotnych komórek raka piersi oraz ich oddziaływań z monocytami. Badanie koncentruje się na takich wynikach jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórkowa oraz promowanie stanu zapalnego związanego z nowotworem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad rakiem piersi
- Biologia komórki
- Immunologia
Wstęp
- Zrozumienie mikrośrodowiska guza jest kluczowe dla badań nad rakiem.
- Monocyty odgrywają istotną rolę w odpowiedzi zapalnej związanej z nowotworami.
- Trójwymiarowe systemy hodowli mogą lepiej naśladować warunki in vivo w porównaniu do tradycyjnych hodowli dwuwymiarowych.
- Celem niniejszego badania jest wyjaśnienie interakcji między komórkami nowotworowymi a komórkami odpornościowymi.
Cel badania
- Zbadanie bezpośredniej i pośredniej komunikacji pomiędzy pierwotnymi komórkami raka piersi a monocytami.
- Zbadanie mechanizmów aktywacji komórek odpornościowych oraz sposobu, w jaki podtrzymują one zapalny mikrośrodowisko guza.
- Ocena wpływu tego mikrośrodowiska na inwazyjność komórek nowotworowych.
Zastosowane metody
- Trójwymiarowy system kokultury dla pierwotnych komórek raka piersi i monocytów.
- Wykorzystanie monocytów U937 i THP1 hodowanych w medium RPMI1640.
- Świeże pierwotne monocyty hodowane w uzupełnionym medium DMEMF12.
- Analiza degradacji kolagenu i rekrutacji komórek odpornościowych.
Główne wyniki
- Wykazano oddziaływania między komórkami raka piersi a monocytami.
- Pokazano, w jaki sposób oddziaływania te przyczyniają się do agresywności nowotworu.
- Podkreślono rolę zapalnego mikrośrodowiska w progresji raka.
- Przedstawiono informacje na temat potencjalnych celów terapeutycznych w leczeniu raka piersi.
Wnioski
- Metoda hodowli trójwymiarowej jest skutecznym narzędziem do badania oddziaływań między komórkami nowotworowymi a komórkami układu odpornościowego.
- Podejście to zapewnia dokładniejszą reprezentację mikrośrodowiska nowotworu.
- Uzyskane wyniki mogą doprowadzić do opracowania lepszych strategii celowanych w raka piersi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Modelowanie komunikacji między guzem a zrębem w zdefiniowanym systemie 3D umożliwia mechanistyczną weryfikację hipotez terapeutycznych w raku piersi poprzez wykazanie, w jaki sposób sygnały pochodzenia monocytarnego modulują zachowanie komórek nowotworowych. Podejście to wspiera walidację celów terapeutycznych poprzez kwantyfikację wydzielanych cytokin i proteaz napędzających inwazję oraz oporność na anoikis, co pozwala na wczesne podejmowanie decyzji go/no-go w procesach rozwoju immunoonkologicznych. System ten stanowi skalowalną i powtarzalną platformę do opracowywania modeli przedklinicznych, zgodnych z istotnymi dla przebiegu choroby oddziaływaniami ze zrębem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju bioprofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez pomiar indukowanego przez monocyty wzbogacenia przeciwzapalnych cytokin IL-1β i IL-8 oraz metaloproteinaz MMP w nadsączach z kokultur.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez kwantyfikację wydzielania chemokin (RANTES, MCP-1, G-CSF) przez komórki raka piersi jako biomarkerów chemoatrakcji monocytów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez powiązanie specyficznych interakcji stromalne z fenotypami agresywności nowotworu oraz opornością na anoikis w modelach cewek mlekowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów kokultur 3D do dalszego przesiewu modulatorów wpływających na rekrutację monocytów lub inwazję komórek nowotworowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja warunków analizy z wykorzystaniem ekstraktu ECM w celu zapewnienia powtarzalnych wyników pomiarów cytokin i proteaz w powtórzeniach doświadczalnych.
- Skalowalność: Możliwość oceny wpływu związków na komunikację między guzem a zrąbem w fizjologicznie istotnej macierzy przy średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście choroby: Modeluje oddziaływania między rakiem piersi a zrąbem u ludzi z wykorzystaniem pierwotnych komórek oraz ECM istotnej klinicznie dla pacjenta, aby usprawnić dopasowanie biomarkerów translacyjnych.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez utrzymywanie pronowotworowego, zapalnego mikrośrodowiska przez wydłużone okresy hodowli.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia mechaniczną redukcję ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych poprzez wykazanie, w jaki sposób ko-hodowla z monocytami zmienia morfologię guza w kierunku inwazyjnych, niezorganizowanych agregatów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania leków, od testowania hipotez dotyczących celu po optymalizację wiodących związków, dostarczając ilościowych odczytów komunikacji stromy, które pozwalają na biologiczną redukcję ryzyka przed inwestycjami w fazie przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących dwukierunkowego sygnałowania między monocytami a komórkami nowotworowymi poprzez mierzalne zmiany w profilach cytokin oraz aktywność przebudowy macierzy.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki standaryzowanej kokulturze opartej na ECM, która pozwala na uzyskanie mierzalnych wyników, takich jak poziomy IL-1β, IL-8 i MMP, na potrzeby kampanii przesiewowych związków.
- Analityka: Umożliwia analizę porównawczą warunków poprzez standaryzowane odzyskiwanie i analizę supernatantów z kokultur pod kątem markerów zapalnych i proteolitycznych.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi poprzez utrzymanie istotnych dla przebiegu choroby oddziaływań stromalnych, które wpływają na morfologię komórek nowotworowych i szlaki przeżycia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badania komunikacji między układem odpornościowym a nowotworem, którą można zastosować w różnych podtypach raka piersi i typach komórek stromy.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach komunikacji między guzem a zrębem.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanej enkapsulacji w ECM i określonym stosunkom kokultury, co minimalizuje zmienność w pomiarach cytokin.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną identyfikację mechanizmów zależnych od zrębu, które mogą nie ujawnić się w prostszych modelach.
- Wpływ na portfolio: Pozwala na priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka poprzez ujawnienie, które sygnały napędzane przez monocyty korelują z agresywnymi fenotypami nowotworowymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji pierwotnych komórek, technikach hodowli 3D oraz pracy z ECM w celu zapewnienia spójnej architektury zrębu.
- Zależne od dostępu do ekstraktu macierzy zewnątrzkomórkowej z kontrolowaną jakością oraz infrastruktury do znakowania fluorescencyjnego w celu śledzenia kokultur.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej czasu zbierania supernatantu oraz protokołów analiz cytokin dla wiarygodnej interpretacji danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania systemu przy rozszerzaniu go na inne typy komórek odpornościowych lub modele nowotworowe poza monocyty i raka piersi.
- Ograniczone przez półzdefiniowany charakter ekstraktu ECM, co może wprowadzać zmienność między partiami, wymagającą walidacji w badaniach podłużnych.
Często zadawane pytania dotyczące Biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Establishing 3D Co-cultures with Indirect Interaction
2:13
3D Co-cultures with Direct Interaction
6:14
Characterization of the Effects of Supernatants from Primary BrC Cells on Acini Formation and Acini Structure
8:28
Results: Communication between Monocytes and Primary BrC Cells in an ECME-3D System
10:01
Conclusion
