Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie bezpośredniej i pośredniej komunikacji między pierwotnymi komórkami raka piersi a monocytami w trójwymiarowym systemie kohodowli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mikrośrodowiska zapalnego raka piersi, takie jak to, w jaki sposób komórki odpornościowe są klasyfikowane i aktywowane, w jaki sposób komórki te pomagają w utrzymaniu mikrośrodowiska zapalnego guza i jak to mikrośrodowisko ułatwia inwazję komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona przystępną cenowo alternatywę dla badania komunikacji wewnątrz guza i ilustruje potencjał trójwymiarowych systemów komórkowych in vitro do badania określonych cech biologii nowotworu.

Szczególnie te związane z agresją nowotworową. Na początek hoduj dwa razy od 10 do szóstego monocytów U937 i THP1 w 10 mililitrach pożywki RPMI1640, uzupełnionej 10 procentami FBS i jednym procentem antybiotyku przeciwgrzybiczego. Uprawiaj również świeże PM w uzupełnionym podłożu DMEMF12.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Płytka cztery razy od 10 do piątych monocytów w jednym mililitrze na studzienkę odpowiadającego im podłoża. Umieścić wkładkę w każdym dołku i dodać 900 mikrolitrów czterokrotnie 10 do piątej zawiesiny komórek BrC w odpowiednim podłożu.

Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez pięć dni i odzyskaj supernatanty. Odzyskaj komórki przez trypsynizację, jeśli przeprowadzana jest późniejsza analiza. Uwzględnij kontrole poszczególnych kultur komórkowych za pomocą odpowiednich pożywek.

Aby oznaczyć komórki BrC i monocyty dostępną w handlu kumeryną i rodaminą przed hodowlą komórkową, należy przygotować monowarstwę dwa razy 10 do szóstych komórek BrC będących przedmiotem zainteresowania i zastąpić wzorcową pożywkę wystarczającą, wstępnie podgrzanym roztworem roboczym barwnika fluorescencyjnego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie odessaj roztwór barwnika i użyj wystarczającej ilości XPBS, aby delikatnie przepłukać komórki.

Odessać PBS i dodać pożywkę wzorcową. Aby trypsynizować komórki, dodaj dwa mililitry 05-procentowej trypsyny i 0,48 milimolowego EDTA do kolby i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Dodaj 200 mikrolitrów FBS, aby zatrzymać trypsynizację i siedem mililitrów odpowiedniej pożywki bez suplementów.

Ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie, a następnie przenieść 10 mikrolitrów komórek do komory Nuebauera i policzyć je. Następnie osadzaj komórki w temperaturze 430 razy g i temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie wyrzuć supernatant i użyj trzech mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego, aby ponownie zawiesić ogniwa. Inkubuj zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut.

Po ponownym granulowaniu komórek wyrzuć roztwór roboczy barwnika i użyj od pięciu do siedmiu mililitrów jednego XPBS, aby delikatnie ponownie zawiesić ogniwa. Następnie, po ponownym granulowaniu komórek i wyrzuceniu PBS, ponownie zawiesić komórki w pięciu do siedmiu mililitrach standardowego podłoża. Policz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek.

Stwórz kokulturę, rozprowadzając wystarczającą ilość ECME na dnie studzienki, aby utworzyć równą warstwę w każdym dołku systemu szkiełek czterostudniowych. Płytka 20 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki zawierającej pięć razy od 10 do piątej znakowanych komórek BrC na dołek. Po 15 do 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj zawiesinę 2,5 razy 10 do piątych znakowanych monocytów w 80 mikrolitrach pożywki testowej uzupełnionej 60 procentami ECME.

Pozwól ECME zestalać się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Teraz dodaj jeden mililitr mieszaniny jeden do jednego komórek BrC i pożywki do hodowli monocytów. Inkubuj kokultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 24 godziny, 48 godzin lub pięć dni, aby śledzić zmiany w różnych punktach czasowych.

Aby zdegradować białka ECM i odzyskać komórki z hodowli, odessać i wyrzucić pożywkę, a następnie dodać 0,5 mililitra jednego XPBS z 0,1 procent trypsyny i 0,25 procent EDTA do hodowli. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji dodaj 0,5 mililitra jednego XPBS z 10-procentowym FBS, aby zneutralizować trypsynę i ponownie zawiesić komórki poprzez energiczne pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Po zagnieżdżeniu komórek wyrzuć supernatant i ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach jednego XPBS z 10 procentami FBS. Powtórz ten krok raz. Poddać zawieszenie komórki faksowi za pomocą odpowiedniego przyrządu.

Upewnij się, że końcowe populacje są czyste w co najmniej 95 procentach. W każdym dołku systemu szkiełek z ośmioma dołkami rozprowadź 40 mikrolitrową bazę ECME i pozwól jej zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wysiewać 800 komórek MCF10 A na studzienkę w 400 mikrolitrach uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM F12 zgodnie z protokołem tekstowym.

Następnie dodać 400 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki lub uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM F12 z 20 nanogramami na mililitr ludzkiej rekombinowanej IL1 beta. Umieść szkiełko komory w szklanej szalce Petriego zawierającej 35-mililitrową szalkę Petriego wypełnioną dwoma mililitrami PBS. Komórki MCF 10A należy wysiewać w każdym dołku bardzo powoli, aby uniknąć uszkodzenia podstawy ECME i zapobiec osiadaniu komórek i tworzeniu monolii.

Za pomocą mikroskopu optycznego rejestruj tworzenie się gruczołów acini co 24 godziny przez 14 dni. Po 14 dniach hodowli dodać 100 mikrolitrów 100 nanomolowych dapy do jednego XPBS i inkubować próbki w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając przez 25 minut. Przepłukać próbki jednym XPBS w temperaturze pokojowej, trzy razy przez pięć minut, z których każdy ciągle mieszając.

Do montażu preparatów należy użyć podłoża montażowego przeznaczonego do barwienia fluorescencyjnego. Następnie zapieczętuj zamontowane próbki przezroczystym pastą i utrzymuj szkiełka w stanie chronionym przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Procedurę w mikroskopie konfokalnym zademonstruje Vadim Perez, badacz z The National Laboratory of Advanced Microscoping.

Analizuj acini za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykonując obrazy poprzecznych stosów na różnych głębokościach acini. Wizualizuj różne białka komórkowe w acini za pomocą odpowiednich protokołów barwienia. Na przykład kaheren został tutaj wybarwiony, aby ocenić adhezję między komórkami, polaryzację komórek i tworzenie oralimen.

Morfologię pierwotnych komórek BrC rosnących w kulturach 3D o niskiej i wysokiej gęstości badano przez pięć dni. W ciągu pierwszych 48 godzin komórki przylegają do ECME o wydłużonym kształcie wrzeciona i po pięciu dniach tworzą struktury przypominające dzianiny. Po pięciu dniach w kokulturach 3D zarówno komercyjne komórki BrC MCF7, jak i MDA-MB-231 utworzyły zdezorganizowane agregaty.

Jednak agresywne ogniwa MDA-MB-231 dla agregatów o wydłużonych formach, natomiast nieagresywne ogniwa MCF7 dla agregatów o zaokrąglonych kształtach, które są gęściej zagęszczone niż ogniwa MDA-MB-231. Zebrano supernatanty z interakcji, w oddziaływaniach pośrednich 3D, pierwotnych kultur BrC i ich pięciodniowych kokultur z pierwotnymi monocytami. Istotnie podwyższone poziomy IL1 beta i IL8 zaobserwowano w pierwotnych kokulturach monocytów komórek BrC.

Zarówno kluczowe, jak i zapalne cytokiny, które wcześniej były związane z progresją nowotworu. Komórki MCF10A hodowano z dwoma różnymi supernatantami z dwóch pierwotnych linii komórkowych BrC, aby obserwować tworzenie światła jako miarę odporności na anoykis. W przeciwieństwie do komórek MCF10A hodowanych w standardowych warunkach, mikroskopia dwukonfokalna w 14 dniu, poprzeczne cięcia sferoid pokazują, że komórki MCF10A uniknęły anoykis, mierzone przez zliczenie liczby komórek centralnych w acini.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza medyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Przetestuj szlaki sygnałowe w obu migracjach nowotworów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrośrodowiskami nowotworowymi do zbadania komunikacji komórek raka piersi z komórkami masowymi, fibroblastami, neutrofilami, a nawet różnymi klonami komórek nowotworowych w systemach kohodowli 3D.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustanowić system hodowli 3D do modelowania mikrośrodowiska guza.