Name: Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Poznaj metodę trójwymiarowej ko-kultury pierwotnych komórek raka piersi z monocytami w ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta technika pozwala badać komunikację wewnątrznowotworową i agresywność guza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez CONACyT FONSEC SSA/IMSS/ISSSTE Projekt nr 233061 dla Ezequiela M. Fuentes-Panana oraz przez Fondo de Apoyo a la Investigación, Hospital Infantil de México Federico Gómez (numer projektu HIM-2014-053). Espinoza-Sánchez NA jest doktorantką w Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) i otrzymała stypendium 231663 CONACYT. E-S NA, dziękuje również za wsparcie finansowe udzielone przez Meksykański Instytut Zabezpieczenia Społecznego (IMSS).

<ol><li>Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+understanding+tumor+hierarchy+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity.</a> Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tumor+microenvironment+in+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of tumor microenvironment in tumorigenesis.</a> J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Sica, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in tumour progression.</a> Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li>
<li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).</li>
<li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li>
<li>Debnath, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+apoptosis+in+creating+and+maintaining+luminal+space+within+normal+and+oncogene-expressing+mammary+acini%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini.</a> Cell. 111 (1), 29-40 (2002).</li>
<li>Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11533657">ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini.</a> Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).</li>
<li>Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+proteolysis%3A+stromal+and+inflammatory+cells+increase+tumor+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis.</a> Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).</li>
<li>Sameni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAME+models+for+4D+live-cell+imaging+of+tumor%3A+microenvironment+interactions+that+impact+malignant+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li>
<li>Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+protease+activity+in+living+cells%3A+from+two+dimensions+to+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions.</a> Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20(2008).</li>
<li>Chimal-Ramirez, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP1%2C+MMP9%2C+and+COX2+expressions+in+promonocytes+are+induced+by+breast+cancer+cells+and+correlate+with+collagen+degradation%2C+transformation-like+morphological+changes+in+MCF-10A+acini%2C+and+tumor+aggressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness.</a> Biomed Res Int. 2013, 279505(2013).</li>
<li>Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta%2C+IL-8%2C+and+Matrix+Metalloproteinases-1%2C+-2%2C+and+-10+Are+Enriched+upon+Monocyte-Breast+Cancer+Cell+Cocultivation+in+a+Matrigel-Based+Three-Dimensional+System%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System.</a> Front Immunol. 8, 205(2017).</li>
<li>Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+promotes+stemness+and+invasiveness+of+colon+cancer+cells+through+Zeb1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation.</a> Mol Cancer. 11, 87(2012).</li>
<li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblotting+and+immunodetection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18(2008).</li>
<li>Troeberg, L., Nagase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+of+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Zymography of metalloproteinases.</a> Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15(2004).</li>
<li>Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+CagA+and+IL-1beta+Promote+the+Epithelial-to-Mesenchymal+Transition+in+a+Nontransformed+Epithelial+Cell+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Res+Pract%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model.</a> Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163(2016).</li>
<li>Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta+and+fibroblast+growth+factor+receptor+1+cooperate+to+induce+cyclooxygenase-2+during+early+mammary+tumourigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis.</a> Breast Cancer Res. 11 (2), 21(2009).</li>
<li>Ma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+%28EGF%29+and+interleukin+%28IL%29-1beta+synergistically+promote+ERK1%2F2-mediated+invasive+breast+ductal+cancer+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion.</a> Mol Cancer. 11, 79(2012).</li>
<li>Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tonic+B-cell+and+viral+ITAM+signaling%3A+context+is+everything%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything.</a> Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).</li>
<li>Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+from+discovery+and+ECM+mimicry+to+assays+and+models+for+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research.</a> Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).</li>
<li>Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+Hydrogels+-+Versatile+Matrices+for+3D+Cell+Culture+in+Cancer+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine.</a> Front Oncol. 5, 92(2015).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Pompaiah, M., Bartfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+Organoids%3A+An+Emerging+Model+System+to+Study+Helicobacter+pylori+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).</li>
<li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directing+human+embryonic+stem+cell+differentiation+towards+a+renal+lineage+generates+a+self-organizing+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie ma dla nich konfliktu interesów.

Komórki nabłonkowe rosną w konformacji przestrzennej 3D, a ich interakcja z białkami ECM ma kluczowe znaczenie dla homeostazy tkanek. Wiele badań nad rakiem opierało się na komórkach hodowanych w monowarstwach (2D) i chociaż miały one kluczowe znaczenie dla zrozumienia wielu aspektów powstawania i progresji guza, monowarstwy nie podsumowują cech, które ECM narzuca komórkom, na przykład: ograniczenie proliferacji, przeżycie komórek zależne od adhezji, polaryzacja wierzchołkowo-boczna, przebudowa ECM, różnicowanie komórek ...

Biologia nowotworów jest o wiele bardziej skomplikowana, niż wcześniej sądzono. Coraz więcej dowodów pokazuje, że komórki nowotworowe to coś więcej niż zwykła masa niekontrolowanych rozchodzących się komórek; Wydaje się raczej, że różne komórki nowotworowe pełnią różne funkcje, wykazując wysoką organizację i hierarchię w obrębie nowotworu1. Komórki nowotworowe są również w ścisłej komunikacji z komórkami nieprzekształconymi: makrofagi, fibroblasty, limfocyty, adipocyty, komórki śródbłonka i inne komórki są zanurzone w białkach rusztowania i polisacharydach, które tworzą ECM. Między przekształconymi i nieprzekształconymi komórkami oraz z ECM ustanawiane są liczne bezpośrednie i pośrednie interakcje, które wywierają silny wpływ na wynik choroby2,3. W konkretnym przypadku BrC szczególnie ważne jest przeanalizowanie komunikacji komórek BrC z TAM, biorąc pod uwagę, że stwierdzono, że TAM odgrywają kluczową rolę w ewolucji guza, zwiększając ryzyko przerzutów i nawrotu choroby4,5.
Aby przeanalizować interakcje wewnątrznowotworowe i ich możliwe wyniki, opracowano nowe podejścia 3D in vitro oparte na użyciu ekstraktów ECM, które zapewniają znacznie bardziej złożone mikrośrodowisko, bliższe rzeczywistości biologii nowotworu, w porównaniu do konwencjonalnych jednowarstwowych hodowli komórkowych, w których komórki rosną przyczepione do plastiku. Petersen i Bissell6 dostarczyli pierwszy model niezłośliwych i złośliwych komórek nabłonka sutka hodowanych na błonie podstawnej bogatej w lamininę i jako pierwsi opisali struktury organotypowe 3D, które odróżniają niezłośliwe ludzkie komórki nabłonkowe piersi od ich złośliwych odpowiedników. Dziesięć lat później model opracowany przez Debnatha, Muthuswamy'ego i Brugge7,8,9 dostarczył cennego narzędzia do wyjaśnienia szlaków biologicznych naruszonych podczas złośliwej transformacji gruczołów acini, takich jak powstawanie dużych acini w wyniku niekontrolowanej proliferacji, delokalizacja białek połączeń ścisłych jako dowód upośledzonej polaryzacji komórek oraz utrata światła acini w wyniku oporności komórek do anoikis, rodzaju zaprogramowanej śmierci komórki, która zachodzi w komórkach zależnych od zakotwiczenia, gdy odłączają się od otaczającego ECM. Modele Sameni, Jedeszko i Sloane skupiły się na obrazowaniu aktywności proteolitycznej komórek, która jest ściśle związana z inwazyjnością, kolejną kluczową cechą nowotworu złośliwego10,11,12. Modele te opierają się na matrycach białkowych zmieszanych z różnymi substratami białkowymi wygaszanymi fluorescencją (DQ-żelatyna, DQ-kolagen I i DQ-kolagen IV), w których sygnały fluorescencyjne wskazują na proteolityczną degradację kolagenu. Modele 3D są również wykorzystywane do badania właściwości komórek macierzystych zarówno komórek nietransformowanych, jak i nowotworowych, w których agregaty komórkowe, zwane również sferoidami, mogą być hodowane w zawiesinie lub w białkach podobnych do ECM, badając mechanizmy różnicowania komórek, asymetryczny podział komórek, przyleganie między komórkami i ruchliwość komórek13,14. Testy inwazji umożliwiają badanie wewnętrznej agresywności guza i identyfikację cząsteczek, które służą jako chemoatraktanty podczas procesu inwazyjnego15. Ogólnie rzecz biorąc, modele 3D stanowią przystępną cenowo dywersyfikację hodowli komórkowych in vitro, która lepiej odzwierciedla normalną i onkogenną morfogenezę tkanek.
Zaprojektowaliśmy system 3D do wspólnej hodowli komórek oparty na wyżej wymienionych modelach7,10,11, używając zarówno ludzkich komercyjnych linii komórkowych BrC o znanym potencjale agresywnym (typy luminalne i potrójnie ujemne), jak i komórek pierwotnych eksplantowanych od pacjentów z BrC. Najpierw opracowaliśmy model, w którym nieagresywne (MCF-7) lub agresywne (MDA-MB-231) komórki BrC były hodowane wspólnie z monocytami U937 w systemie 3D opartym na ekstrakcie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME), który umożliwiał bezpośrednie interakcje komórka-komórka. Te kokultury wykorzystano do określenia, w jaki sposób komunikacja między tymi dwiema liniami komórkowymi wpłynęła na transkrypcję zestawu genów związanych z agresywnym zachowaniem raka. Zaobserwowano znaczny wzrost transkryptu cyklooksygenazy-2 (COX-2), który zbiegł się ze zwiększoną produkcją jednego z jej produktów, prostaglandyny E2 (PGE2), co podkreśliło rolę stanu zapalnego w progresji raka. Zaobserwowano również zwiększoną transkrypcję MMP, która korelowała z większą proteolizą kolagenu, gdy agresywne komórki MDA-MB-231 były hodowane wspólnie z monocytami U937 w kulturach zawierających DQ-Collagen IV. Warto zauważyć, że nasze kohodowle nie potwierdziły założenia, że mechanizmy interakcji komórka-komórka są potrzebne do degradacji kolagenu. Sugerowało to raczej, że komunikacja między dwiema liniami komórkowymi była pośredniczona przez wydzielane cząsteczki. Co więcej, supernatanty zebrane z tych testów kokulturowych zawierały rozpuszczalne czynniki, które deorganizowały ziarniaki gruczołowe utworzone przez nieprzekształcone komórki MCF-10A13. Stwierdzono, że agresywne i pierwotne komórki BrC wydzielały podwyższony poziom cząsteczek chemotaktycznych monocytów MCP-1, GM-CSF i RANTES. W związku z tym nakreśliliśmy hodowlę 3D, w której komórki zostały oddzielone we wkładkach do hodowli komórkowych, aby zapobiec interakcjom komórka-komórka. Kultury te wykorzystano do rozwiązania problemu pośredniej komunikacji między komórkami BrC a monocytami. Do tych testów wykorzystano nieagresywne i agresywne komercyjne linie komórkowe BrC i pierwotne komórki BrC oraz trzy różne typy ludzkich monocytów: komercyjne komórki U937 i THP-1 oraz pierwotne monocyty (PM) wyizolowane z krwi obwodowej zdrowych dawców (wszystkie monocyty były używane w stanie nieaktywowanym). Zaobserwowano, że zwiększone stężenia cytokin zapalnych IL-1β i IL-8 są wzbogacone w kokulturze. Podobnie stwierdzono, że MMP-1, MMP-2 i MMP-10 były również zwiększone w kokulturach komórek BrC i monocytów, wzmacniając w ten sposób wcześniejsze ustalenia14. W niniejszym manuskrypcie przedstawiono przebieg procesu izolacji i testowania pierwotnych komórek BrC w kulturach 3D punkt po punkcie wraz z reprezentatywnymi wynikami. Praca ta stanowi dobry przykład ogromnego potencjału, jaki dają systemy komórkowe 3D in vitro do badania określonych aspektów biologii nowotworu.

<table><tbody><tr><td>U937</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>CRL-1593.2</td><td>Linia komórek monocytowych/chłoniak histiocytarny&nbsp;</td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Kolekcja Kultur Typu Amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>TIB-202</td><td>Monocytowa linia komórkowa/ostra białaczka monocytowa&nbsp;</td></tr><tr><td>MCF-10A</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>CRL-10317</td><td>Nietransformowana linia komórek piersi</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>HTB-22</td><td>Linia komórkowa raka piersi</td></tr><tr><td>T47D</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>HTB-133</td><td>Linia komórkowa raka piersi</td></tr><tr><td>HS578T</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>HTB-126</td><td>Linia komórkowa raka piersi</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego ATCC&nbsp;</td><td>HTB-26</td><td>Linia komórkowa raka piersi</td></tr><tr><td>RPMI 1640 średnia</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Wysoka zawartość glukozy&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11964-092</td><td>4,5 g/L</td></tr><tr><td>glukozy DMEM/F12</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/Antybiotyk Przeciwgrzybicze</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>100 U/ml penicylina, 100 &mikro; g/ml streptomycyny oraz 0,25 &mikro; g/mL</td></tr><tr><td>Fungizone Płodowa surowica bydlęca</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska&nbsp;</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>16050114</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna-EDTA 1X</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X (sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>GIBCO BRL Life Technologies</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15 (1,00 mg)</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I1882-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H088-5G</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna Vibrio cholerae</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>Corning Inc</td><td>356237</td><td>mięsak myszy Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), ekstrakt z macierzy zewnątrzkomórkowej, Przechowywać w temperaturze -20&deg; C do użycia w temperaturze 4&deg; C</td></tr><tr><td>GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-03</td><td></td></tr><tr><td>MCP-1</td><td>PeproTech</td><td>300-04</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>PeproTech</td><td>300-06</td><td></td></tr><tr><td>IL-8</td><td>PeproTech</td><td>200-08</td><td></td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>PeproTech</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>Hycel Kryształowo-fioletowy</td><td>M&eacute; xico</td><td>541</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Przepuszczalne wsporniki (wkładki) TranswellCorning</td> <td>Inc</td><td>3422</td><td>Średnica 6,5 mm, 8 i mikro; m wielkość porów/płytki 24-dołkowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Przepuszczalne wsporniki (wkłady)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>140620</td><td>średnica 6,5 mm, 0,4 i mikro; m wielkość porów/płytki 24-dołkowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji monocytów II Human&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-153</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw paneli magnetycznych z ludzką cytokiną / chemokiną 96-dołkowy test płytki</td><td>EMD Millipore</td><td>HCYTOMAG-60K</td><td></td></tr><tr><td>Magpix z oprogramowaniem xPonent (laserowe fluorescencyjne oprzyrządowanie do testów analitycznych)</td><td>Luminex Corporation</td><td>40-072</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko studzienne Lab-Tek z pokrywą (8 dobrze)</td><td>Nalge Nunc International</td><td>177402</td><td></td></tr><tr><td>Szklane dno mikrostudzienka 35mm petri&nbsp; naczynia</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ecme)

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), normalne i nowotworowe komórki nabłonkowe ściśle komunikują się z komórkami krwiotwórczymi i niekrwiotwórczymi, co znacznie wpływa na normalną homeostazę tkanek i wynik choroby. W raku piersi makrofagi związane z nowotworem (TAM) odgrywają kluczową rolę w progresji choroby, przerzutach i nawrocie; Dlatego zrozumienie mechanizmów chemoprzyciągania monocytów do mikrośrodowiska guza i ich interakcji z komórkami nowotworowymi jest ważne dla kontrolowania choroby. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis trójwymiarowego (3D) systemu kohodowli ludzkich komórek raka piersi (BrC) i ludzkich monocytów. Komórki BrC wytwarzały wysokie podstawowe poziomy regulowanej aktywacji, normalnej ekspresji i wydzielania limfocytów T (RANTES), białka chemoatraktantu monocytów-1 (MCP-1) i czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (G-CSF), podczas gdy w kohodowli z monocytami cytokiny prozapalne Interleukina (IL)-1 beta (IL-1β) i IL-8 zostały wzbogacone o metaloproteinazy macierzy (MMP)-1, MMP-2 i MMP-10. To mikrośrodowisko zrębu guza sprzyjało oporności na anoikis w strukturach podobnych do MCF-10A 3D acini, chemoprzyciąganiu monocytów i inwazji agresywnych komórek BrC. Przedstawione tutaj protokoły stanowią przystępną cenowo alternatywę dla badania komunikacji wewnątrz guza i są przykładem ogromnego potencjału, jaki zapewniają systemy komórkowe 3D in vitro do badania specyficznych cech biologii guza związanych z agresją guza.

Analiza morfologiczna komórek BrC w hodowlach 3D:
Morfologię pierwotnych komórek BrC hodowanych w kulturach 3D przy niskiej i wysokiej gęstości badano przez 5 dni. W ciągu pierwszych 48 h komórki przylegają do ECME i utrzymują niską gęstość. W tym punkcie czasowym można wyraźnie zauważyć, że komórki mają wydłużony kształt wrzecionowaty, niektóre z dwiema lub więcej długimi wypustkami cytoplazmatycznymi, i nie wy...

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie bezpośredniej i pośredniej komunikacji między pierwotnymi komórkami raka piersi a monocytami w trójwymiarowym systemie kohodowli. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące mikrośrodowiska zapalnego raka piersi, takie jak to, w jaki sposób komórki odpornościowe są klasyfikowane i aktywowane, w jaki sposób komórki te pomagają w utrzymaniu mikrośrodowiska zapalnego guza i jak to mikrośrodowisko ułatwia inwazję komórek nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona przystępną cenowo alternatywę dla badania komunikacji wewnątrz guza i ilustruje potencjał trójwymiarowych systemów komórkowych in vitro do badania określonych cech biologii nowotworu.Szczególnie te związane z agresją nowotworową. Na początek hoduj dwa razy od 10 do szóstego monocytów U937 i THP1 w 10 mililitrach pożywki RPMI1640, uzupełnionej 10 procentami FBS i jednym procentem antybiotyku przeciwgrzybiczego. Uprawiaj również świeże PM w uzupełnionym podłożu DMEMF12.Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla. Płytka cztery razy od 10 do piątych monocytów w jednym mililitrze na studzienkę odpowiadającego im podłoża. Umieścić wkładkę w każdym dołku i dodać 900 mikrolitrów czterokrotnie 10 do piątej zawiesiny komórek BrC w odpowiednim podłożu.Inkubuj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez pięć dni i odzyskaj supernatanty. Odzyskaj komórki przez trypsynizację, jeśli przeprowadzana jest późniejsza analiza. Uwzględnij kontrole poszczególnych kultur komórkowych za pomocą odpowiednich pożywek.Aby oznaczyć komórki BrC i monocyty dostępną w handlu kumeryną i rodaminą przed hodowlą komórkową, należy przygotować monowarstwę dwa razy 10 do szóstych komórek BrC będących przedmiotem zainteresowania i zastąpić wzorcową pożywkę wystarczającą, wstępnie podgrzanym roztworem roboczym barwnika fluorescencyjnego. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut. Następnie odessaj roztwór barwnika i użyj wystarczającej ilości XPBS, aby delikatnie przepłukać komórki.Odessać PBS i dodać pożywkę wzorcową. Aby trypsynizować komórki, dodaj dwa mililitry 05-procentowej trypsyny i 0,48 milimolowego EDTA do kolby i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut. Dodaj 200 mikrolitrów FBS, aby zatrzymać trypsynizację i siedem mililitrów odpowiedniej pożywki bez suplementów.Ponownie zawiesić komórki przez pipetowanie, a następnie przenieść 10 mikrolitrów komórek do komory Nuebauera i policzyć je. Następnie osadzaj komórki w temperaturze 430 razy g i temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie wyrzuć supernatant i użyj trzech mililitrów wstępnie podgrzanego roztworu roboczego barwnika fluorescencyjnego, aby ponownie zawiesić ogniwa. Inkubuj zawiesinę komórkową w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 30 minut.Po ponownym granulowaniu komórek wyrzuć roztwór roboczy barwnika i użyj od pięciu do siedmiu mililitrów jednego XPBS, aby delikatnie ponownie zawiesić ogniwa. Następnie, po ponownym granulowaniu komórek i wyrzuceniu PBS, ponownie zawiesić komórki w pięciu do siedmiu mililitrach standardowego podłoża. Policz 10 mikrolitrów zawiesiny komórek.Stwórz kokulturę, rozprowadzając wystarczającą ilość ECME na dnie studzienki, aby utworzyć równą warstwę w każdym dołku systemu szkiełek czterostudniowych. Płytka 20 mikrolitrów zawiesiny pojedynczej komórki zawierającej pięć razy od 10 do piątej znakowanych komórek BrC na dołek. Po 15 do 20 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj zawiesinę 2,5 razy 10 do piątych znakowanych monocytów w 80 mikrolitrach pożywki testowej uzupełnionej 60 procentami ECME.Pozwól ECME zestalać się w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 do 20 minut. Teraz dodaj jeden mililitr mieszaniny jeden do jednego komórek BrC i pożywki do hodowli monocytów. Inkubuj kokultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym środowisku z pięcioprocentowym dwutlenkiem węgla przez 24 godziny, 48 godzin lub pięć dni, aby śledzić zmiany w różnych punktach czasowych.Aby zdegradować białka ECM i odzyskać komórki z hodowli, odessać i wyrzucić pożywkę, a następnie dodać 0,5 mililitra jednego XPBS z 0,1 procent trypsyny i 0,25 procent EDTA do hodowli. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny. Po inkubacji dodaj 0,5 mililitra jednego XPBS z 10-procentowym FBS, aby zneutralizować trypsynę i ponownie zawiesić komórki poprzez energiczne pipetowanie, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.Po zagnieżdżeniu komórek wyrzuć supernatant i ponownie zawieś ogniwa w pięciu mililitrach jednego XPBS z 10 procentami FBS. Powtórz ten krok raz. Poddać zawieszenie komórki faksowi za pomocą odpowiedniego przyrządu.Upewnij się, że końcowe populacje są czyste w co najmniej 95 procentach. W każdym dołku systemu szkiełek z ośmioma dołkami rozprowadź 40 mikrolitrową bazę ECME i pozwól jej zastygnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Wysiewać 800 komórek MCF10 A na studzienkę w 400 mikrolitrach uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM F12 zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie dodać 400 mikrolitrów kondycjonowanej pożywki lub uzupełnionej pożywki hodowlanej DMEM F12 z 20 nanogramami na mililitr ludzkiej rekombinowanej IL1 beta. Umieść szkiełko komory w szklanej szalce Petriego zawierającej 35-mililitrową szalkę Petriego wypełnioną dwoma mililitrami PBS. Komórki MCF 10A należy wysiewać w każdym dołku bardzo powoli, aby uniknąć uszkodzenia podstawy ECME i zapobiec osiadaniu komórek i tworzeniu monolii.Za pomocą mikroskopu optycznego rejestruj tworzenie się gruczołów acini co 24 godziny przez 14 dni. Po 14 dniach hodowli dodać 100 mikrolitrów 100 nanomolowych dapy do jednego XPBS i inkubować próbki w temperaturze pokojowej, ciągle mieszając przez 25 minut. Przepłukać próbki jednym XPBS w temperaturze pokojowej, trzy razy przez pięć minut, z których każdy ciągle mieszając.Do montażu preparatów należy użyć podłoża montażowego przeznaczonego do barwienia fluorescencyjnego. Następnie zapieczętuj zamontowane próbki przezroczystym pastą i utrzymuj szkiełka w stanie chronionym przed światłem w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Procedurę w mikroskopie konfokalnym zademonstruje Vadim Perez, badacz z The National Laboratory of Advanced Microscoping.Analizuj acini za pomocą mikroskopu konfokalnego, wykonując obrazy poprzecznych stosów na różnych głębokościach acini. Wizualizuj różne białka komórkowe w acini za pomocą odpowiednich protokołów barwienia. Na przykład kaheren został tutaj wybarwiony, aby ocenić adhezję między komórkami, polaryzację komórek i tworzenie oralimen.Morfologię pierwotnych komórek BrC rosnących w kulturach 3D o niskiej i wysokiej gęstości badano przez pięć dni. W ciągu pierwszych 48 godzin komórki przylegają do ECME o wydłużonym kształcie wrzeciona i po pięciu dniach tworzą struktury przypominające dzianiny. Po pięciu dniach w kokulturach 3D zarówno komercyjne komórki BrC MCF7, jak i MDA-MB-231 utworzyły zdezorganizowane agregaty.Jednak agresywne ogniwa MDA-MB-231 dla agregatów o wydłużonych formach, natomiast nieagresywne ogniwa MCF7 dla agregatów o zaokrąglonych kształtach, które są gęściej zagęszczone niż ogniwa MDA-MB-231. Zebrano supernatanty z interakcji, w oddziaływaniach pośrednich 3D, pierwotnych kultur BrC i ich pięciodniowych kokultur z pierwotnymi monocytami. Istotnie podwyższone poziomy IL1 beta i IL8 zaobserwowano w pierwotnych kokulturach monocytów komórek BrC.Zarówno kluczowe, jak i zapalne cytokiny, które wcześniej były związane z progresją nowotworu. Komórki MCF10A hodowano z dwoma różnymi supernatantami z dwóch pierwotnych linii komórkowych BrC, aby obserwować tworzenie światła jako miarę odporności na anoykis. W przeciwieństwie do komórek MCF10A hodowanych w standardowych warunkach, mikroskopia dwukonfokalna w 14 dniu, poprzeczne cięcia sferoid pokazują, że komórki MCF10A uniknęły anoykis, mierzone przez zliczenie liczby komórek centralnych w acini.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza medyczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania. Przetestuj szlaki sygnałowe w obu migracjach nowotworów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrośrodowiskami nowotworowymi do zbadania komunikacji komórek raka piersi z komórkami masowymi, fibroblastami, neutrofilami, a nawet różnymi klonami komórek nowotworowych w systemach kohodowli 3D.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustanowić system hodowli 3D do modelowania mikrośrodowiska guza.

analyzing-communication-between-monocytes-primary-breast-cancer-cells

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Opracowaliśmy trójwymiarowe modele kokultury do obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym, aby badać oddziaływania między komórkami guza piersi a innymi komórkami ich mikrośrodowiska, które wpływają na progresję w kierunku fenotypu inwazyjnego. Modele te mogą służyć jako przesiewy przedkliniczne dla leków ukierunkowanych na indukowane parakrynnie szlaki proteolityczne, szlaki chemokin/cytokin oraz kinaz zaangażowane w inwazyjność.

Modele MAME do obrazowania 4D żywych komórek w celu badania oddziaływań guza z mikrośrodowiskiem wpływających na progresję złośliwą

Opisano prostą metodę analizy wpływu fibroblastów tkankowych na powiązane z nimi komórki nabłonkowe. Połączenie tej metody z trójwymiarową hodowlą tkankową może ułatwić analizę komórek po ich izolacji z układu 3D. Technika ta jest możliwa do zastosowania w przypadku komórek o różnym potencjale złośliwości, co pozwala na systematyczne badanie wpływu ziówna związanego z nowotworem na komórki nowotworowe.

Izolacja komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego z trójwymiarowej mieszanej kokultury sferoidów komórkowych

Ten film opisuje 3D kokulturę komórek raka piersi z monocytami w celu zbadania ich interakcji w środowisku opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME). Ta metoda pomaga w badaniu określonych cech, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych i inwazja komórek.

Współkultura 3D z bezpośrednią interakcją: współhodowla komórek rakowych z monocytami w celu zbadania ich interakcji

W standardowych metodach hodowli komórki są wyjmowane ze swojego fizjologicznego środowiska i hodowane na plastikowej powierzchni naczynia. Aby zbadać zachowanie pierwotnych komórek ludzkiego szpiku kostnego, stworzyliśmy system hodowli 3D, w którym komórki są hodowane w warunkach rekapitulujących natywne mikrośrodowisko tkanki.

Trójwymiarowy model hodowli tkankowej do badania pierwotnego ludzkiego szpiku kostnego i jego nowotworów złośliwych

Ten artykuł zawiera szczegółowe metodologie wykorzystania testów trójwymiarowych (3D) do ilościowego określenia inwazji komórek raka piersi. W szczególności omawiamy procedury wymagane do skonfigurowania, takie jak testy, kwantyfikacja i analiza danych, a także metody badania utraty integralności błony, która ma miejsce podczas inwazji komórek.

Kwantyfikacja inwazyjności komórek raka piersi za pomocą modelu trójwymiarowego (3D)

Pokazujemy metodę generowania 3D surogatek raka piersi, które mogą być hodowane za pomocą systemu bioreaktora perfuzyjnego do dostarczania tlenu i składników odżywczych. Po wzroście surogaty są utrwalane i przetwarzane na parafinę w celu oceny parametrów będących przedmiotem zainteresowania. Wyjaśniono ocenę jednego z takich parametrów, gęstości komórek.

Przygotowanie i analiza trójwymiarowych substytutów raka piersi in vitro

Dostosowaliśmy przepuszczalną mikroporowatą wkładkę membranową do naśladowania mikrośrodowiska guza (TME). Model składa się z mieszanej hodowli komórek, pozwala na uproszczone generowanie wysoce wzbogaconych pojedynczych populacji komórek bez użycia znakowania fluorescencyjnego lub sortowania komórek oraz pozwala na badanie komunikacji międzykomórkowej w obrębie TME w warunkach normalnych lub stresowych.

Naśladownictwo mikrośrodowiska guza: prosta metoda generowania wzbogaconych populacji komórek i badania komunikacji międzykomórkowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Ten protokół opisuje budowę mikrofizjologicznego systemu do badania raka piersi in vitro przy użyciu pierwotnej ludzkiej tkanki piersi z gotowych materiałów.

Modelowanie raka piersi w tkance piersi u ludzi za pomocą systemu mikrofizjologicznego

Poznaj metodę trójwymiarowej ko-kultury pierwotnych komórek raka piersi z monocytami w ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta technika pozwala badać komunikację wewnątrznowotworową i agresywność guza.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME) (Wideo) | JoVE Journal

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Przeglądaj więcej filmów