Metoda znakowania transkryptów w poszczególnych komórkach Escherichia coli do eksperymentów hybrydyzacji fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ
21 grudnia 2017
Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania pojedynczych transkryptów informacyjnego RNA (mRNA) za pomocą fluorescencyjnie znakowanych sond DNA, do wykorzystania w eksperymentach z hybrydyzacją fluorescencji pojedynczej cząsteczki in situ (smFISH) u E. coli. smFISH to metoda wizualizacji, która pozwala na jednoczesne wykrywanie, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w utrwalonych pojedynczych komórkach.
Ogólnym celem tego protokołu jest znakowanie pojedynczych transkryptów w E.Coli dla znakowanych fluorescencyjnie sond DNA w celu wizualizacji w eksperymentach FiSH na pojedynczych cząsteczkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemów, takie jak charakterystyka transkryptów zdolność do interakcji między komórkami w polu zainteresowania. A także transkrypcje lokalizacji ściany komórkowej.
Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza ona dużej ilości informacji na temat statystyk procesów transkrypcyjnych. Aby rozpocząć protokół, hoduj E.Coli MG1655 w pożywce LB przez noc w wytrząsarce orbitalnej, przy 260 obr./min i 37 stopniach Celsjusza. Następnego dnia rozcieńczyć nocną kulturę w stosunku jeden do 100 w świeżej pożywce i zmierzyć jej gęstość optyczną w spektrofotometrze, do wartości od 0,2 do 0,4.
Następnie granulować komórki przez odwirowywanie przez pięć minut w temperaturze 4,500 G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Usunąć supernatant ze wszystkich probówek. Dodaj jeden mililitr 1XPBS do każdej probówki i ponownie zawieś osad, aby zminimalizować agregację między komórkami.
Następnie dodaj cztery mililitry buforu utrwalającego i delikatnie zwiruj probówkę. Inkubować próbki w wytrząsarce orbitalnej. Ponownie zawiesić osad w celu zminimalizowania agregacji między komórkami, co może zakłócać obrazowanie komórek.
Po inkubacji osadzać komórki, usuwać supernatant i dodawać jeden mililitr 1XPBS. Przenieś zawiesiny do 1,8 mililitra stożkowych probówek wirówkowych z dnem. Osadzać komórki przez odwirowanie.
Rozpocznij przenikanie bakterii od ostrożnego usunięcia supernatantu. Użyj pipet o małej objętości, aby usunąć cały płyn na zewnątrz granulki. Następnie ponownie zawiesić granulat w 300 mikrolitrach uzdatnionej wody DEPC.
Dodaj 350 mikrolitrów wysokiej jakości absolutnego etanolu i delikatnie wymieszaj roztwór, odwracając probówkę. Dodaj kolejne 350 mikrolitrów etanolu i ponownie wymieszaj. Następnie obracaj próbkę za pomocą rotatora probówki z prędkością 20 obr./min przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.
Osadzaj komórki z permeabilizacji. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr 20% buforu do płukania do próbek.
Pozostaw je na kilka minut. Następnie osadzać komórki przez wirowanie przez siedem minut w temperaturze 750 G i czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant bardzo delikatnie i użyć pipet o małej objętości, aby usunąć cały płyn na zewnątrz osadu.
Następnie dodać roztwór podstawowy zestawu sondy oligonukleotydowej do podwielokrotności buforu hybrydyzacyjnego tak, aby końcowe stężenie oligonukleotydu wynosiło 250 nanomolowych i energicznie wirować probówkę. Zawiesić próbki w 50 mikrolitrach buforu hybrydyzacyjnego, który zawiera sondy oligonukleotydowe, unikając wytwarzania pęcherzyków. Pozostaw próbki na noc, w ciemności, na bloku grzewczym w temperaturze 30 stopni Celsjusza.
Aby przygotować płukanie, należy zaopatrzyć się w jedną nową probówkę do mikrowirówki dla każdej próbki do zobrazowania. Dodaj jeden mililitr buforu do płukania do każdej probówki. Dodaj 10 do 15 mikrolitrów z hybrydyzowanych próbek do nowej probówki zawierającej bufor do płukania.
Osadzać komórki przez odwirowanie. Następnie usunąć supernatant. Umyj próbki jeszcze dwa razy.
Ponownie zawiesić granulat w buforze do płukania o pojemności 25 mikrolitrów. Przygotuj żel agarozowy, dodając 150 miligramów agarozy do 10 mililitrów buforu 2X SSC. Za każdym razem podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez 10 do 15 sekund, aż agaroza całkowicie się rozpuści.
Następnie odłóż rurkę na bok do ostygnięcia przez kilka minut. Następnie umieść oddzielającą, silikonową ramkę na szkiełku tak, aby środek prowadnicy pozostał odsłonięty. Umieść sztywny pierścień o szerokości 10 milimetrów i grubości od jednego do dwóch milimetrów na środku szkiełka.
Nałóż niewielką ilość żelu na środek w celu uszczelnienia i odczekaj kilka minut, aż żel stwardnieje. Następnie dodaj więcej żelu, aż utworzy się wysoki kształt kopuły. Odczekaj około 10 minut, aż żel stwardnieje i zdejmij pierścień.
Umieść 10 mikrolitrów komórek bakteryjnych myjących się na żelu i uszczelnij go szkiełkiem nakrywkowym z numerem zero. Próbkę należy przechowywać w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu. Pomiary smFiSH komórek E. coli pokazują poziom indukcji galK w odpowiedzi na zmienne zewnątrzkomórkowe stężenia D-fukozy.
Sygnał tła jest pokazany przez szczep delecji galK lub delta galK JW0740 jako kontrolę ujemną. W większości komórek widoczne są liczne plamki. Odpowiada pojedynczym lub kilku transkryptom galK po dodaniu dwóch milimolowych D-fukozy do kultury bakteryjnej.
Natomiast kilka plam jest widocznych przy braku zewnątrzkomórkowej D-fukozy. Innym przykładem zastosowania tego protokołu jest gen sodB, z obrazami fluorescencji i kontrastu fazowego smFiSH w typie dzikim lub szczepie sodB z delecją JW1648. Próbki przygotowane za pomocą tego protokołu mogą być również obrazowane za pomocą STORM, co pozwala na dokładne precyzję transkryptów w komórce.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią systemową do badania statystyk zdarzeń transkrypcyjnych w poszczególnych komórkach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten manuskrypt opisuje metodę znakowania poszczególnych transkryptów mRNA za pomocą oznaczonych fluorescencyjnie sond DNA do wykorzystania w eksperymentach hybrydyzacji in situ z fluorescencją pojedynczych cząsteczek (smFISH) u E. coli. Ta technika umożliwia jednoczesną detekcję, lokalizację i kwantyfikację pojedynczych cząsteczek mRNA w ustalonych pojedynczych komórkach.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuroscience
- Systems Biology
- Cell Biology
Wprowadzenie
- Hybrydyzacja in situ z fluorescencją pojedynczych cząsteczek (smFISH) to potężna metoda wizualizacji.
- Ta metoda umożliwia badanie procesów transkrypcyjnych na poziomie pojedynczej komórki.
- Zrozumienie lokalizacji mRNA i kwantyfikacja jest kluczowe dla systemów biologii.
- E. coli służy jako organizm modelowy dla tych eksperymentów.
Cel badania
- Oznaczenie poszczególnych transkryptów mRNA w E. coli.
- Wizualizacja lokalizacji mRNA za pomocą oznaczonych fluorescencyjnie sond DNA.
- Wzmocnienie zrozumienia zmienności transkrypcyjnej między komórkami.
Wykorzystane metody
- Uprawa E. coli MG1655 w pożywce LB przez noc.
- Rozcieńczenie kultury nocnej w świeżym pożywce.
- Pomiar gęstości optycznej w celu zapewnienia odpowiednich warunków wzrostu.
- Zastosowanie oznaczonych fluorescencyjnie sond DNA do analizy smFISH.
Główne wyniki
- Pomyślne oznaczenie poszczególnych transkryptów mRNA.
- Wizualizacja lokalizacji mRNA w ustalonych komórkach.
- Kwantyfikacja procesów transkrypcyjnych na poziomie pojedynczej cząsteczki.
- Wgląd w zmienność międzykomórkową w ekspresji transkryptów.
Wnioski
- Metoda zapewnia solidne podejście do badania dynamiki mRNA.
- Wnosi cenną wiedzę do dziedziny systemów biologii.
- Technika ta może być stosowana do różnych pytań badawczych dotyczących ekspresji genów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) in E. coli enables direct quantification and spatial mapping of mRNA transcripts at single-cell resolution, addressing key challenges in understanding transcriptional heterogeneity. This capability supports predictive confidence in early discovery by revealing cell-to-cell variability and subcellular transcript localization. The method is strategically positioned for target validation and mechanistic de-risking in microbial systems biology and synthetic biology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of gene expression variability across individual bacterial cells.
- Supports mechanistic de-risking by mapping transcript localization and abundance at single-molecule resolution.
- Facilitates functional target validation by distinguishing true biological effects from population-averaged artifacts.
- Provides high-content data for hypothesis-driven pathway analysis in microbial models.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of gene regulation or synthetic constructs.
- Delivers reproducible, quantitative mRNA copy number outputs for assay standardization.
- Enables multiplexed transcript detection within single cells, limited by spectral overlap of fluorophores.
- Supports robust evaluation of gene induction or repression in response to experimental perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling precise quantification of gene expression changes in microbial models.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation for engineered strains or pathway interventions.
- Reduces risk in advancing microbial targets by supplying single-cell resolution data on transcript dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
This smFISH labeling method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for microbial systems, supporting both hypothesis testing and quantitative analytics.
- Discovery Biology: Delivers direct measurement of transcriptional events and spatial transcript distribution for pathway clarification.
- Screening: Supplies standardized, quantitative readouts for evaluating gene expression modulation in engineered or wild-type strains.
- Analytics: Enables statistical analysis of mRNA copy number distributions and cell-to-cell variability using open-source or custom software.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by validating gene expression changes at single-cell resolution.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable workflow for transcript quantification in diverse bacterial systems and experimental contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial gene expression studies.
- Operational Value: Standardizes transcript labeling and imaging for reproducible, scalable data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for microbial targets and synthetic constructs by providing high-resolution expression data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbial targets and engineered pathways based on quantitative single-cell analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial cell handling, fixation, and fluorescence microscopy.
- Needs access to fluorescence imaging platforms with low-intensity detection and appropriate filter sets.
- Demands cross-team standardization of probe design and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptation to other bacterial strains or gene targets may require probe redesign and spectral optimization.
- Multiplexing is limited by spectral overlap of available fluorophores, constraining simultaneous gene detection.
