Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Ogólnym celem tego podejścia do obrazowania fluorescencyjnego jest określenie okresu półtrwania białka będącego przedmiotem zainteresowania w pojedynczych żywych komórkach za pomocą znacznika SNAP. Białka komórkowe są intensywnie przekształcane, a tempo syntezy i degradacji jest specyficzne dla każdego białka i podlega regulacji fizjologicznej. Jednak najczęściej stosowane metody określania okresu półtrwania białek są albo ograniczone do średnich populacji komórek, albo wymagają stosowania inhibitorów syntezy białek.

W tym filmie pokazujemy, w jaki sposób znacznik SNAP w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią poklatkową może być wykorzystany do pomiaru okresu półtrwania białka w żywych komórkach. Zaletą tej metody jest to, że osiąga rozdzielczość pojedynczej komórki, a zatem zapewnia oszacowanie niejednorodności okresów półtrwania w populacji hodowanych komórek. Przedstawiona tutaj procedura eksperymentalna może być zastosowana do dowolnego typu przylegających komórek hodowlanych, wyrażających interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP.

Można to osiągnąć poprzez endogenne znakowanie białek lub nadmierną ekspresję znakowanych białek. SNAP-tag jest zmutowaną wersją enzymu naprawy DNA, alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA, która specyficznie reaguje z benzylguaniną, która może być sprzężona z sondami molekularnymi. W związku z tym każde białko fuzyjne SNAP-tag może być nieodwracalnie znakowane barwnikiem przepuszczalnym dla komórek florescencyjnych.

Po wypłukaniu z resztkowego barwnika znakowana populacja białek będzie się rozkładać wykładniczo i można wywnioskować okres półtrwania odpowiedniego białka. W tym filmie używamy embrionalnych komórek macierzystych, które tworzą ciasne kolonie, gdy są hodowane klasycznie na szalkach pokrytych żelatyną. Aby umożliwić im wzrost jako monowarstwę komórek, a tym samym osiągnięcie rozdzielczości pojedynczej komórki do eksperymentów obrazowania kwiatowego, hodowaliśmy je na przylegających do nich powlekanych płytkach, co zmniejsza interakcje między komórkami, w których pośredniczy przyleganie komórkowe inc wyrażane na błonie plazmatycznej.

Rozcieńczyć rekombinowany inc przylegający do pięciu nanogramów na mikrolitr w PBS i dodać 30 mikrolitrów rozcieńczonego inc przylegającego na zawór w płytce zaworowej 96, odpowiedniej do obrazowania. Należy unikać intensywnego pipetowania, ponieważ przyleganie rekombinantu jest bardzo delikatne. Inkubować w temperaturze 37 stopni przez półtorej godziny.

Odessać przylegający roztwór inc, przemyć raz 100 mikrolitrami PBS i dodać do 200 mikrolitrów wstępnie odrobaczonej pożywki hodowlanej ESL. Użyj linii ESL wyrażających interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP. Umyj komórki pięcioma ml PBS.

Następnie dodać dwa ml Tripsona i inkubować przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni. Dodać cztery ml pożywki hodowlanej ESL, ponownie zawiesić i odwirowywać w temperaturze 1000 T przez cztery minuty. Odessać supernatant, ponownie zawiesić w świeżej pożywce i policzyć komórki.

Umieść 30 000 komórek na centymetr kwadratowy w przylegającej powlekanej płytce obrazowej. Kontynuuj barwienie barwnikiem SNAP 24 godziny po umieszczeniu komórki. Rozcieńczyć barwnik komórkowy w pożywce hodowlanej ELS do optymalnego stężenia wcześniej określonego.

Odessać pożywkę za pomocą pipety i ostrożnie dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika SNAP. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni. Odessać barwnik i przemyć trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS pre-worm.

Dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej ESL i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni. Czynności mycia należy wykonywać za pomocą delikatnej pipety i nie używać automatycznego aspiratora, ponieważ komórki mają tendencję do łatwego odłączania się. Powtórz te same etapy mycia jeszcze dwa razy, a następnie dodaj 200 mikrolitrów podłoża do obrazowania.

Użyj pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, aby zmniejszyć tło kwiatescencji. Użyj mikroskopu umożliwiającego kontrolowanie temperatury i CO2. Ustaw temperaturę na 37 stopni, a CO2 na pięć procent przed użyciem i pozwól zachować równowagę przez jedną do dwóch godzin.

Umieść płytkę w mikroskopie i wybierz miejsce odpowiednie do obrazowania. Obrazy w jasnym polu pokazują ESL przymocowany do przylegającego powlekanego naczynia w monowarstwie. Wybierz cel, obiektyw 20X jest odpowiedni dla tego rozmiaru ESL.

Wybierz ustawienia oświetlenia dla kanału fluorescencji, który ma być nagrywany. Dostosuj moc lasera i ekspozycję, aby uzyskać silny sygnał, ponieważ będzie on zmniejszał się w trakcie trwania filmu. Wybierz parametry akwizycji dla eksperymentu poklatkowego.

W przypadku białek o oczekiwanym okresie półtrwania od dwóch do dwudziestu godzin, wybierz czas wchłaniania od 12 do 24 godzin w odstępach czasowych 15 minut. Rozpocznij eksperyment z obrazowaniem. Użyj oprogramowania FIJI do przetwarzania i analizy filmu.

Zbierz uzyskane obrazy jako stos i zdeformuj go. Użyj funkcji odejmowania tła FIDŻI, aby usunąć tło ze wszystkich obrazów w stosie. Wybierz interesującą komórkę, narysuj wokół niej obszar zainteresowania za pomocą paska narzędzi FIDŻI i dodaj obszar zainteresowania do Menedżera ROI.

Przejdź do następnej klatki i powtórz poprzednie czynności. Śledź interesującą Cię komórkę przez cały czas trwania filmu i zapisz ustawiony zwrot z inwestycji dla każdej śledzonej komórki. Kliknij miarę, aby uzyskać wartości średniej intensywności i obszaru ROI.

Aby oszacować tło lokalne, dodaj obszar zainteresowania w pobliżu komórki zainteresowania dla każdego przedziału czasu. Na koniec kliknij przycisk Zmierz, aby uzyskać wartości średniej intensywności tła. Najpierw oblicz średnią intensywność komórki, mnożąc uzyskaną wartość średniej intensywności komórkowego ROI przez jej powierzchnię.

Następnie przystąp do obliczania zintegrowanej wartości tła komórki, mnożąc średnią intensywność ROI tła przez obszar ROI komórki. Na koniec, aby uzyskać skorygowaną wartość tła dla zintegrowanej intensywności komórki, odejmij wartość zintegrowanej intensywności tła od wartości zintegrowanej intensywności komórkowej. Aby uzyskać średni okres półtrwania populacji komórek, znormalizuj uzyskane wartości do wartości intensywności pierwszej klatki dla każdej komórki.

Gwarantuje to, że każda komórka przyczynia się z taką samą wagą do średniej wartości półtrwania, niezależnie od jej bezwzględnej intensywności kwitnienia. Po podziałach komórkowych śledź obie komórki potomne oddzielnie i sumuj ich zintegrowane intensywności po odjęciu tła, aby uwzględnić rozcieńczenie białka podczas podziału komórki. Zapisz zestawy ROI dla obu komórek potomnych.

Aby oszacować okres półtrwania białka, użyj narzędzia do dopasowywania krzywych w MATLAB. Rozpad białka następuje wykładniczo, gdzie F(x) jest intensywnością kwitnienia w danym punkcie czasowym, a "początkową intensywnością" i b "szybkością rozpadu. Po uzyskaniu wartości szybkości zaniku b"z dopasowania, okres półtrwania można obliczyć, dzieląc logarytm dwóch przez b"Ten film pokazuje rozpad florescencji barwnika SNAP w doksycyklinie, bezużytecznej linii komórkowej fuzyjnej opt four.

Obserwowany sygnał florescencji będzie zależał od użytej linii komórkowej, poziomu ekspresji odpowiedniego białka będącego przedmiotem zainteresowania, a także właściwości użytego barwnika. W przypadku eksperymentów z rozpadem białek ważne jest, aby użyć odpowiedniego stężenia barwnika SNAP. Stężenie powinno być wystarczająco wysokie, aby dać jasny sygnał fluorescencji na początku upływu czasu.

Jednak stosowanie zbyt wysokich stężeń barwnika może spowodować, że resztki barwnika pozostaną w podłożu, nawet po umyciu. Wolny barwnik może następnie wiązać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w trakcie filmu, co zniekształciłoby krzywą rozpadu. Dlatego tak ważne jest, aby zoptymalizować stężenie barwnika SNAP poprzez testowanie różnych rozcieńczeń.

Rysunek ten przedstawia krzywe rozpadu dla ośmiu różnych stężeń barwnika SNAP o charakterze kwiatowym testowanym na nienadającej się do użytku linii komórkowej doksycykliny. Początkowe stężenie barwnika wynoszące trzy mikromole wybrano zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi obrazowania żywych komórek, a następnie przeprowadzono seryjne rozcieńczanie od jednego do trzech, aż do osiągnięcia stężenia 1,4 nanomola. Dla dwóch najwyższych stężeń sygnał nie maleje, podczas gdy obserwowany rozpad przebiega zgodnie z krzywą wykładniczą dla niższych stężeń.

W tym przykładzie wybrano optymalne stężenie 12 nanomolowców, ponieważ stężenie to zapewnia minimalne ilości resztkowego barwnika pozostawionego w pożywce po umyciu, ale sygnał kwitnienia jest nadal wystarczająco jasny, aby zaobserwować wyraźną krzywą rozpadu. Opisany protokół zapewnia oszacowanie zmienności między komórkami i okresu półtrwania dla dowolnego białka połączonego z SNAP-tag. Rysunek ten pokazuje rozpad pojedynczej komórki i średnią populacji dla trzech różnych linii komórkowych fuzji doksycykliny ze znacznikiem SNAP.

Nanog "i Oct4" są raczej krótkotrwałe, ze średnimi okresami półtrwania wynoszącymi 2,9 i 4,8 godziny. Natomiast Srsf11 "jest dłużej żywy, a średni okres półtrwania wynosi 25,3 godziny. Wykresy pudełkowe pokazują rozkład okresów półtrwania dla trzech białek.

Wykazaliśmy, że zastosowanie znacznika SNAP w połączeniu z mikroskopią poklatkową kwiatu pozwala na określenie okresu półtrwania dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Pomiary rozpadu pojedynczej komórki pozwalają oszacować niejednorodność okresów półtrwania w populacji komórek, co jest pomijane przy użyciu innych metod określania okresu półtrwania białka. Jednym z najważniejszych kroków podczas korzystania z SNAP-tag do monitorowania rozpadu białek jest upewnienie się, że po umyciu w pożywce lub w komórkach nie pozostały żadne resztki niezwiązanego barwnika.

W przeciwnym razie może związać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w dalszej części eksperymentu, a tym samym zakłócić krzywą rozpadu. Osiąga się to z jednej strony poprzez staranne wykonanie wszystkich opisanych kroków prania. Z drugiej strony stężenie barwnika SNAP powinno być utrzymywane na jak najniższym poziomie, a jednocześnie znajdować się w zakresie, który pozwala uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.

Stężenie barwnika SNAP powinno być zoptymalizowane dla każdego eksperymentu zgodnie z linią komórkową i rodzajem użytego barwnika. Chociaż możliwe jest, że znacznik SNAP może w niektórych przypadkach zmieniać okres półtrwania białek kandydujących, nie widzimy dowodów na takie efekty, ponieważ określone okresy półtrwania białek kandydujących w teście są ściśle zgodne z opublikowanymi wartościami. Aby jeszcze bardziej wykluczyć wpływ znacznika SNAP na degradację białka, jedną z opcji byłoby zablokowanie syntezy białek za pomocą cykloheksymidu i wykonanie blotów w toalecie w różnych punktach czasowych, przy użyciu przeciwciała, które rozpoznaje rodzime białko.

I bezpośrednio porównać rozpad białka kandydującego na znacznik SNAP z nieoznakowaną wersją rodzimą.