Name: Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę pomiaru czasu połowicznego zaniku białek w pojedynczych komórkach przy użyciu znaczników SNAP i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia analizę heterogeniczności degradacji białek w populacji komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Eksperymenty z mikroskopią poklatkową przeprowadzono w Biomolecular Screening Facility (BSF), EPFL. Dziękujemy Marcowi Delachaux (Service Audiovisuel, EPFL) za filmowanie i montaż filmu.

Uwaga: W tym badaniu zastosowano linię komórek ES E14. Protokół ten można jednak bezpośrednio zastosować do każdej innej linii komórek ES myszy eksprymujących białko zainteresowania połączone z tagiem SNAP, zarówno poprzez otagowanie białka endogennego, jak i poprzez nadekspresję. W przykładach pokazanych w sekcji wyników wykorzystano linie komórkowe z indukowalnym tagiem SNAP (tag SNAP połączony z następującymi białkami: Nanog, Oct4, Srsf11 lub z białkami fluorescencyjnymi mOrange2 i sfGFP, pod kontrolą promotora indukowalnego doksycykliną. Zobacz11 w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat plazmidów użytych do generowania indukowalnych linii komórkowych z fuzją SNAP-tag). System indukowalny doksycykliną może być szczególnie przydatny, ponieważ pozwala ściśle kontrolować czas i intensywność ekspresji białka zainteresowania. Zaleca się umiejscowienie tagu SNAP na C-końcu, ponieważ zmiana sekwencji aminokwasów na N-końcu jest bardziej prawdopodobna, by wpłynąć na czas półtrwania białka docelowego (zasada N-końca12).
1. Pokrywanie powierzchni E-kadheryną i zasiewanie komórek
<ol>
	<li>Uzyskaj linię komórek ES eksprymującą białko zainteresowania połączone z tagiem SNAP4.</li>
	<li>Wymyj naczynia do hodowli komórek o powierzchni 100 mm roztworem żelatyny (0,1%, rozcieńczoną w buforze fosforanowym (PBS) bez Ca2+/Mg2+) w ilości 4 mL przez 1 godzinę. Usuń żelatynę i pozostaw do wyschnięcia przez 1 godzinę. Użyj natychmiast lub przechowuj naczynia pokryte żelatyną do 2 miesięcy.</li>
	<li>Hoduj linię komórek zainteresowania w pożywce do hodowli komórek ES (Glasgow Minimum Essential Medium, uzupełnionej 10% surowicą cielęcą fetusem odpowiednią do hodowli komórek ES, 2 mM pirogronianem sodu, 1% nielosowymi aminokwasami, 1% penicyliną/streptomycyną, 2 mM L-glutaminą, 100 µM 2-merkaptoetanolem, czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), 3 µM CHIR99021 oraz 0,8 µM PD184352) na naczyniach pokrytych żelatyną w 37 °C i 5% CO2 przez 2 dni, aż do osiągnięcia zacieplenia wynoszącego 10–20 mln komórek na naczynie. 
	Uwaga: W tym przypadku LIF uzyskano poprzez chwilowe transfekcję komórek HEK 293T, a następnie zebranie i odfiltrowanie supernatantu. Każda partia LIF była testowana pod kątem zdolności do utrzymywania pluripotencji, jednak stężenia nie były oznaczane. Niemniej jednak, rekombinacyjny LIF jest również dostępny komercyjnie, a stężenie powszechnie stosowane w hodowli komórek ES myszy to 1000 jednostek/mL13.</li>
	<li>Wymyj płytkę 96-dołkową odpowiednią do obrazowania roztworem rekombinowanego białka chimerycznego E-kadheryny myszy z fragmentem Fc (E-kad-Fc) w ilości 30 µL na dołek (5 ng/µL, rozcieńczone w PBS z Ca2+/Mg2+. Użyj stężenia magazynowego 100 ng/µL, przechowywanego w -80 °C). Unikaj intensywnego pipetowania, ponieważ E-kad-Fc jest bardzo kruche. Inkubuj przez 1,5 godziny w 37 °C. 
	Uwaga: W zależności od mikroskopu, mogą być stosowane inne formaty.</li>
	<li>Odciągnij E-kad-Fc, przepłucz raz 100 µL PBS z Ca2+/Mg2+ i dodaj 100 µL uprzednio podgrzanego medium do hodowli komórek ES.</li>
	<li>Przepłucz komórki zainteresowania 5 mL PBS bez Ca2+/Mg2+. Odciągnij i dodaj 2 mL trypsyny-EDTA 0,25%. Inkubuj 4 minuty w 37 °C. Dodaj 4 mL pożywki do hodowli komórek ES, zawieś komórki i odwirowuj przy 1000 x g przez 4 minuty. Odciągnij supernatant i zawieś osad w 2 mL świeżej pożywki do hodowli komórek ES. 
	Uwaga: PBS bez Ca2+/Mg2+ należy stosować do przepłukiwania komórek przed trypsynizacją, aby usunąć jony Ca2+, które są niezbędne do adhezji komórek. Natomiast do rozcieńczania i pokrywania powierzchni E-kad-Fc (krok 1.4) należy używać PBS z Ca2+/Mg2+, ponieważ adhezja komórek ES do naczyń pokrytych E-kad-Fc zależy od obecności Ca2+14.</li>
	<li>Rozcieńcz zawiesinę komórek 1:10 w 1 mL pożywki do hodowli komórek ES i policz komórki, używając komory liczącej (nalej 10 µL do komory o głębokości 0,1 mm).</li>
	<li>Zasejuj 30 000 komórek/cm2 na płytce do obrazowania pokrytej E-kad-Fc. Uzupełnij do objętości 200 µL na dołek pożywką do hodowli komórek ES. W przypadku linii komórkowych indukowalnych doksycyklina, zaindukuj odpowiednią dawką doksycykliny (optymalizuj dawkę i czas indukcji wcześniej. Linie komórkowe używane w tym przypadku były traktowane 500 ng/mL doksycykliny 24 godziny przed obrazowaniem). Inkubuj w 37 °C i 5% CO2 i przejdź do etapu znakowania impulsowego i obrazowania 24 godziny po zaszyciu komórek.</li>
</ol>
2. Oznaczanie impulsowe białka SNAP-tag
Uwaga: W eksperymentach badających rozpad białek kluczowe jest użycie odpowiedniego stężenia barwnika SNAP. Stężenie powinno być wystarczająco wysokie, aby uzyskać silny sygnał fluorescencyjny na początku serii pomiarów, ponieważ fluorescencja będzie zmniejszać się w czasie. Jednak zbyt wysokie stężenia barwnika mogą prowadzić do pozostawania jego resztek w pożywce lub w komórkach nawet po przemywaniu. Wolny barwnik może następnie wiązać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami znacznika SNAP w trakcie trwania eksperymentu, co zaburzy krzywą rozpadu. Obserwowany sygnał fluorescencyjny zależy od właściwości barwnika, linii komórkowej oraz poziomu ekspresji odpowiedniego białka. Dlatego ważne jest zoptymalizowanie stężenia barwnika poprzez testowanie różnych rozcieńczeń, zaczynając od rozcieńczenia zalecanego przez producenta do obrazowania żywych komórek. W tym badaniu użyto podłożą fluorescencyjnego w zakresie dalekiego podczerwieni. Optymalne stężenie 12 nM określono dla linii komórkowych z indukowalną przez doksycyklindę nadekspresją.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć barwnik SNAP do odpowiedniego stężenia w podgrzanym medium do hodowli komórek ES. Ostrożnie usunąć pipetą medium z komórek wcześniej zaszczepionych w płytce 96-dołkowej i dodać 50 µL rozcieńczonego barwnika SNAP do każdego dołka. Inkubować przez 30 min w 37 °C.</li>
	<li>Odsączyć rozcieńczony barwnik pipetą i przemyć 3-krotnie 200 µL podgrzanego roztworu soli fizjologicznej (bez Ca2+/Mg2+). Dodać 200 µL medium do hodowli komórek ES i inkubować przez 15 min w 37 °C.</li>
	<li>Powtórzyć dwukrotnie poprzednie kroki przemywania. 
	Uwaga: Dokładne przemywanie jest ważne, aby usunąć niezwiązany barwnik. Powtarzane przemywanie roztworem soli fizjologicznej usuwa pozostałości barwnika pozakomórkowego w medium, natomiast 15-minutowe inkubacje zapewniają trwałe znakowanie białek fuzji z tagiem SNAP przed rozpoczęciem eksperymentu mikroskopowego. Należy jednak przeprowadzać kroki przemywania ostrożnie, za pomocą pipety, nie używając automatycznego odsysacza, ponieważ komórki zaszczepione na E-cad-Fc łatwo się odklejają.</li>
	<li>Dodać 200 µL medium do wizualizacji. Aby zmniejszyć tło fluorescencyjne, należy użyć medium bez fenolo czerwonego (uzupełnionego 10% surowicą cielęcą odpowiednią do komórek ES, 2 mM pirogronianu sodu, 1% nieliniowych aminokwasów, 1% penicyliny/streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 100 µM 2-merkaptopropanolu, LIF, 3 µM CHIR99021 oraz 0.8 µM PD184352).</li>
</ol>
3. Mikroskopia z podwójnym ekspozycją
<ol>
	<li>Użyj mikroskopu odpowiedniego do obrazowania żywych komórek, umożliwiającego kontrolę temperatury i stężenia CO2. Ustaw temperaturę na 37 °C, a stężenie CO2 na 5% przed rozpoczęciem eksperymentu i pozostaw urządzenie do uzyskania równowagi przez 1–2 godziny.</li>
	<li>Umieść płytkę w mikroskopie i znajdź miejsca odpowiednie do obrazowania. Wybierz obszary, w których komórki są równomiernie rozmieszczone, ale nie zbyt gęsto, ponieważ ułatwi to analizę. Dostosuj liczbę wybranych miejsc do liczby komórek wymaganych do analizy. W tym badaniu rejestrowano 3–5 miejsc na linię komórkową.</li>
	<li>Wybierz obiektyw. Obiektyw 20X jest odpowiedni dla wielkości komórek ES.</li>
	<li>Wybierz ustawienia oświetlenia dla kanału(-ów) fluorescencyjnego(-ych), który ma być rejestrowany. Dostosuj moc lasera i czas ekspozycji do natężenia sygnału fluorescencyjnego pochodzącego od badanych komórek. Upewnij się, że uzyskasz silny początkowy sygnał, ponieważ będzie on zmniejszał się w trakcie nagrania, ale unikaj mocy lasera powyżej 30%, aby zminimalizować fototoksyczność i wybielenie fluorescencji. W tym badaniu zastosowano filtr wzbudzenia 632/22 nm (długość fali/przepustowość), filtr emisji 679/34 nm (długość fali/przepustowość), moc lasera 10% oraz czas ekspozycji 100 ms.</li>
	<li>Wybierz interwały obrazowania i czas trwania eksperymentu z czasem rzeczywistym. Dla białek o oczekiwanych czasach połowicznego rozpadu wynoszących 2–20 godzin, wybierz czasy akwizycji 12–24 godziny z interwałami co 15 minut. Dla białek o krótszym czasie życia skróć interwały i czas akwizycji, a dla dłużej trwających odpowiednio wydłuż.</li>
	<li>Rozpocznij obrazowanie.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie i analiza obrazów
<ol>
	<li>Zebranie obrazów jako zestawu w formacie tiff. Do dalszej obróbki i analizy użyj oprogramowania FIJI15Jeśli dane z trybu timelapse nie zostały zebrane przez oprogramowanie mikroskopu jako zestaw, otwórz wszystkie klatki eksperymentu timelapse w programie (poprzez kliknięcie) Plik | Otwórz… lub przeciągając i upuszczając odpowiednie pliki na pasek narzędzi) i kliknij Obraz | Stosy | Obrazy do zestawienia.</li>
	<li>Użyj funkcji odejmowania tła, aby usunąć tło ze wszystkich obrazów w stosie. W tym celu kliknij Proces | Odejmij tło. Wybierz promień kuli w oknie podręcznym. Użyj promienia co najmniej równego wielkości obrazowanych komórek. Aby zastosować odjęcie tła do wszystkich komórek w stosie, zaznacz Tak w Stos procesów? okno podręczne</li>
	<li>Wybierz interesującą komórkę i narysuj wokół niej obszar zainteresowania (ROI) za pomocą paska narzędzi. W przypadku sygnałów jądrowych użyj Owalny wybór poprzez najpierw kliknięcie odpowiedniego zakładki na pasku narzędzi, a następnie kliknięcie na interesujące jądro i dostosowanie kształtu owalu wokół niego. W przypadku sygnałów cytoplazmatycznych lub bardzo gęstych obszarów należy użyć zaznaczenia o kształcie dowolnym, aby móc dokładnie śledzić obrys komórki. Unikaj zaznaczania zbyt dużych obszarów tła, mimo że nie jest konieczne dokładne śledzenie obrysu komórki ze względu na późniejsze odjęcie wszystkich pikseli tła (krok 4.8–4.9).</li>
	<li>Dodaj obszar zainteresowania do menedżera ROI, klikając Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI | Dodajlub poprzez naciśnięcie T na klawiaturze</li>
	<li>Przejdź do następnego kadru, przesuwając kartę w oknie stosu lub naciskając shift + &lt; na klawiaturze, a następnie powtórz poprzednie czynności. Obserwuj wybraną komórkę na przestrzeni całego filmu i dodawaj ROI każdego kadru do menedżera ROI. Zapisz końcowy zestaw ROI dla każdej śledzonej komórki, klikając Więcej | Zapisz… w menedżerze ROI. 
	Uwaga: Po podziale komórek śledź obie komórki potomne oddzielnie i po odjęciu tła zsumuj ich zintegrowane intensywności (zobacz kroki 4.6–4.9), aby uwzględnić rozcieńczenie białka podczas podziału komórkowego. Zapisz zestawy ROI dla obu komórek potomnych.</li>
	<li>Po śledzeniu komórki docelowej przez cały film kliknij Zmierz, aby uzyskać wartości średniej intensywności i powierzchni obszarów zainteresowania (ROI). Skopiuj uzyskane wartości do programu do opracowywania arkuszy kalkulacyjnych i oblicz surową całkowitą intensywność komórki dla każdego punktu czasowego zgodnie z następującym wzorem: 
	<img alt="Ic = ŚredniaC * PoleC; równanie do obliczania prądu w analizie obwodów." src="/files/ftp_upload/56604/56604eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie Średniac to średnia intensywność oraz PowierzchniaC pole odpowiadającego obszaru zainteresowania (ROI)</li>
	<li>Aby oszacować lokalne tło, dodaj ROI blisko komórki interesującej w każdej ramce czasowej. Unikaj włączania sygnału fluorescencyjnego pochodzącego od komórek. Użyj okrągłego ROI o wielkości zbliżonej do wielkości komórki i odpowiednio przesuń lub zmniejsz go, jeśli to konieczne. np. jeśli komórki sąsiednie zakłócają. Postępuj zgodnie z wcześniejszym opisem, ustawiając ROI komórkowe w celu uzyskania zestawu ROI tła, a następnie skopiuj zmierzone wartości intensywności do arkusza kalkulacyjnego.</li>
	<li>Aby uzyskać skorygowaną wartość sygnału tła dla całkowitej intensywności komórki, najpierw oblicz całkowitą intensywność sygnału tła dla każdego punktu czasowego: 
	<img alt="Równanie równowagi statycznej, I_BG = Mean_BG * Area_C, ilustrujące obliczanie równowagi." src="/files/ftp_upload/56604/56604eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	gdzie ŚredniaBG to średnia intensywność sygnału tła oraz PowierzchniaC jest polem powierzchni ROI obejmującego komórkę. Nie należy używać pola powierzchni ROI tła, chyba że oba obszary mają taką samą wielkość.</li>
	<li>Oblicz końcową całkowitą intensywność sygnału po odjęciu tła dla komórki w każdym punkcie czasowym: 
	<img alt="Równanie do izolacji sygnału: IC-BG=IC-IBG; stosowane w analizie danych spektroskopowych." src="/files/ftp_upload/56604/56604eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"></li>
	<li>Aby znormalizować krzywe rozpadu pojedynczej komórki, podziel wartość intensywności każdego punktu czasowego przez wartość intensywności pierwszego punktu czasowego. 
	Uwaga: Dopasowanie krzywej (zobacz krok 4.11) można wykonać albo dla każdej pojedynczej komórki oddzielnie, albo dla średniej populacji. W przypadku obliczania uśrednienia opartego na populacji wymagana jest normalizacja, aby uniknąć obciążenia wyników z powodu różniących się intensywności fluorescencji między komórkami. Normalizacja zapewnia zatem, że każda komórka wnosi jednakowy wkład do końcowej krzywej rozpadu. Dodatkowo, normalizacja może być przydatna do wizualizacji rozpadów w pojedynczych komórkach niezależnie od ich absolutnych intensywności fluorescencji (zobacz Rysunki 3A–3C). Jednak jeśli wyznacza się jedynie półtrwanie na poziomie pojedynczych komórek i dane nie są uśredniane, krok normalizacji może zostać pominięty, a dopasowanie krzywej można wykonać bezpośrednio na danych surowych.</li>
	<li>W celu oszacowania czasu półtrwania białka należy użyć narzędzia do dopasowywania krzywych. W tym badaniu wykorzystano zestaw narzędzi do dopasowywania krzywych MATLAB w wersji 3.4.1, który domyślnie znajduje się w Aplikacje sekcja interfejsu użytkownika MATLAB. Zaimportuj wartości intensywności fluorescencji i czasu z arkusza kalkulacyjnego do MATLAB, klikając w Importuj dane otwórz narzędzie dopasowania krzywych i wybierz punkty czasowe oraz dane rozpadu fluorescencji w dane X i dane Y zakładka. Wybierz Niestandardowe równanie na karcie dopasowania krzywej i wprowadź równanie dla wykładniczego zaniku: 
	<img alt="Formuła wykładniczego zaniku f(t)=a*e^(-bt), reprezentacja matematyczna, dopasowanie danych." src="/files/ftp_upload/56604/56604eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> 
	gdzie f(t) to natężenie fluorescencji w danym punkcie czasowym, a początkową intensywność oraz b stopień rozpadu. W Opcje dopasowania… wybierz kartę, ustaw 0 jako dolną granicę dla obu a i b. Szacowane wartości dla a i b pojawi się następnie w oknie wyników. Oblicz okres półtrwania w następujący sposób: 
	<img alt="Równanie okresu półtrwania \( t_{1/2} = \frac{ln(2)}{b} \) ilustrujące proces rozpadu." src="/files/ftp_upload/56604/56604eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"></li>
</ol>

<ol><li>Zhou, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15173609">Determining Protein Half-Lives.</a> Signal Transduct Protoc. , 67-77 (2004).</li>
<li>Schwanhäusser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Plachta, N., Bollenbach, T., Pease, S., Fraser, S. E., Pantazis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oct4+kinetics+predict+cell+lineage+patterning+in+the+early+mammalian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oct4 kinetics predict cell lineage patterning in the early mammalian embryo.</a> Nature Cell Biol. 13 (2), 117-123 (2011).</li>
<li>Keppler, A., Gendreizig, S., Gronemeyer, T., Pick, H., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nature Biotechnol. 21 (1), 86-89 (2002).</li>
<li>Keppler, A., Pick, H., Arrivoli, C., Vogel, H., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+fusion+proteins+with+synthetic+fluorophores+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Labeling of fusion proteins with synthetic fluorophores in live cells.</a> Proc Nat Acad Sci U S A. 101 (27), 9955-9959 (2004).</li>
<li>Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+O6-alkylguanine-DNA+alkyltransferase+for+applications+in+protein+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Select%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling.</a> Protein Eng Design Select. 19 (7), 309-316 (2006).</li>
<li>Jansen, L. E. T., Black, B. E., Foltz, D. R., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+centromeric+chromatin+requires+exit+from+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Propagation of centromeric chromatin requires exit from mitosis.</a> J Cell Biol. 176 (6), 795-805 (2007).</li>
<li>Bojkowska, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+In+Vivo+Protein+Half-Life%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring In Vivo Protein Half-Life.</a> Chem Biol. 18 (6), 805-815 (2011).</li>
<li>Mandic, A., Strebinger, D., Regali, C., Phillips, N. E., Suter, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+quantitative+measurements+of+gene+expression+in+single+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for quantitative measurements of gene expression in single living cells.</a> Methods. 120, 65-75 (2017).</li>
<li>Komatsu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurements+of+Protein+Dynamics+Using+Fluorescence+Activation-Coupled+Protein+Labeling+Method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurements of Protein Dynamics Using Fluorescence Activation-Coupled Protein Labeling Method.</a> J Am Chem Soc. 133 (17), 6745(2011).</li>
<li>Deluz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+mitotic+bookmarking+of+SOX2+in+pluripotency+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A role for mitotic bookmarking of SOX2 in pluripotency and differentiation.</a> Genes Dev. 30 (22), 2538-2550 (2016).</li>
<li>Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+pathway+and+regulation+by+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">The N-end rule pathway and regulation by proteolysis.</a> Protein Sci. 20 (8), 1298-1345 (2011).</li>
<li>Tamm, C., Pijuan Galitó, S., Annerén, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparative+Study+of+Protocols+for+Mouse+Embryonic+Stem+Cell+Culturing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Comparative Study of Protocols for Mouse Embryonic Stem Cell Culturing.</a> PLoS ONE. 8 (12), e81156(2013).</li>
<li>Nagaoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Cadherin-Coated+Plates+Maintain+Pluripotent+ES+Cells+without+Colony+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">E-Cadherin-Coated Plates Maintain Pluripotent ES Cells without Colony Formation.</a> PLoS ONE. 1 (1), e15(2006).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hilsenbeck, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Software+tools+for+single-cell+tracking+and+quantification+of+cellular+and+molecular+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Software tools for single-cell tracking and quantification of cellular and molecular properties.</a> Nat Biotech. 34 (7), 703-706 (2016).</li>
<li>Blanchoud, S., Nicolas, D., Zoller, B., Tidin, O., Naef, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAST%3A+An+automated+segmentation+and+tracking+tool+for+the+analysis+of+transcriptional+kinetics+from+single-cell+time-lapse+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">CAST: An automated segmentation and tracking tool for the analysis of transcriptional kinetics from single-cell time-lapse recordings.</a> Methods. 85, 3-11 (2015).</li>
<li>Peng, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BaSiC+tool+for+background+and+shading+correction+of+optical+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Comm%22%5BJournal%5D)">A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images.</a> Nature Comm. 8, (2017).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nature Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Chae, H. D., Lee, M. R., Broxmeyer, H. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22076938">5-Aminoimidazole-4-carboxyamide Ribonucleoside Induces G1/S Arrest and Nanog Downregulation via p53 and Enhances Erythroid Differentiation.</a> Stem Cells. 30 (2), 140-149 (2012).</li>
<li>Lin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Regulation+of+Akt+and+Oct4+Promotes+the+Self-Renewal+and+Survival+of+Embryonal+Carcinoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Regulation of Akt and Oct4 Promotes the Self-Renewal and Survival of Embryonal Carcinoma Cells.</a> Mol Cell. 48 (4), 627-640 (2012).</li>
<li>Wei, F., Scholer, H. R., Atchison, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+of+Oct4+Enhances+Its+Stability%2C+DNA+Binding%2C+and+Transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Sumoylation of Oct4 Enhances Its Stability, DNA Binding, and Transactivation.</a> J Biol Chem. 282 (29), 21551-21560 (2007).</li>
<li>Gautier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Engineered+Protein+Tag+for+Multiprotein+Labeling+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An Engineered Protein Tag for Multiprotein Labeling in Living Cells.</a> Chem Biol. 15 (2), 128-136 (2008).</li>
<li>Los, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HaloTag%3A+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem przy użyciu znacznika SNAP do monitorowania rozpadu białek jest upewnienie się, że po umyciu w pożywce lub w komórkach nie pozostały żadne resztki niezwiązanego barwnika, ponieważ w przeciwnym razie może on związać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w dalszej części eksperymentu, a tym samym pogorszyć krzywą rozpadu. Osiąga się to z jednej strony poprzez staranne wykonanie wszystkich opisanych kroków prania. Z drugiej strony, stężenie barwnika powinno być utrzymywane na jak najniższym...

Dobrze wiadomo, że białka komórkowe podlegają intensywnej rotacji, a tempo syntezy i degradacji jest specyficzne dla każdego białka i podlega regulacji fizjologicznej. Tradycyjnie, tempo degradacji białek mierzono za pomocą metod masowych, takich jak analiza pościgu impulsów radioaktywnych, lub z udziałem inhibitorów syntezy białek, takich jak cykloheksymid1. Niedawno ustanowiono znakowanie stabilnych izotopów aminokwasami w hodowli komórkowej (SILAC) w połączeniu ze spektrometrią mas w celu ilościowego określenia obrotu białek w skali globalnej2. Metody te są jednak ograniczone przez uśrednianie populacji, w związku z czym informacje o zmienności między komórkami są tracone. Ponadto nie można zidentyfikować przejściowych zmian w degradacji białek, które są niezsynchronizowane w całej populacji komórek.
Alternatywnie, okresy półtrwania białek mogą być również określane za pomocą metod opartych na fluorescencji, które często mają tę zaletę, że zapewniają rozdzielczość pojedynczej komórki. Na przykład, fotoaktywowane białko zielonej fluorescencji (paGFP) zostało użyte do określenia okresu półtrwania Oct4 u wczesnych ssaków embryo3. Inną metodą monitorowania rozpadu białek w żywych komórkach jest użycie znacznika SNAP w połączeniu z fluorescencyjnym obrazowaniem poklatkowym. Znacznik SNAP jest zmutowaną wersją enzymu naprawy DNA klasy O6-alkiloguaniny DNA-alkilotransferazy (AGT), która specyficznie reaguje z pochodnymi benzylguaniny (BG), które mogą być sprzężone z sondami molekularnymi4,5,6. W związku z tym każde białko fuzyjne SNAP-tag może być nieodwracalnie znakowane fluorescencyjnym, przepuszczalnym dla komórek barwnikiem. Znakowanie impulsowe białka będącego przedmiotem zainteresowania połączonego ze znacznikiem SNAP, a następnie wypłukanie resztkowego barwnika, pozwala na monitorowanie degradacji znakowanej populacji białka, a tym samym na określenie okresu półtrwania białka. Znaczniki SNAP są z powodzeniem stosowane do znakowania białek metodą pulse-chase oraz do określania okresów półtrwania białek w przylegających hodowlach komórkowych oraz in vivo5,7,8,9. Na rynku dostępna jest szeroka gama podłoży SNAP-tag pokrywających powszechnie stosowane widma fluorescencyjne, co umożliwia wybór optymalnego barwnika do każdego konkretnego zastosowania. W ten sposób znaczniki SNAP mogą być również używane do obrazowania wielokolorowego w połączeniu z innymi fluorescencyjnymi białkami fuzyjnymi lub barwnikami. Barwniki nieprzepuszczalne dla komórek nadają się do znakowania białek na uwięzi błonowej, podczas gdy barwniki przepuszczalne dla komórek mają zastosowanie do monitorowania zarówno białek wewnątrzkomórkowych, jak i związanych z błoną. Co więcej, niektóre z tych sond prawie nie wykazują podstawowej fluorescencji i zaczynają emitować silny sygnał fluorescencyjny dopiero po związaniu się z SNAP-tag10.
Ten protokół opisuje, jak mierzyć tempo degradacji różnych interesujących białek w pojedynczych komórkach za pomocą znacznika SNAP. Tutaj stosujemy tę metodę do mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES) hodowanych na E-kadherynie, ale powinno być możliwe zastosowanie jej z dowolnym przylegającym typem hodowanych komórek. Pokazujemy, że znakowanie impulsowe białek fuzyjnych SNAP-tag, a następnie fluorescencyjne obrazowanie poklatkowe pozwala na określenie okresów półtrwania różnych białek w pojedynczej komórce i zapewnia oszacowanie zmienności między komórkami okresów półtrwania w populacji hodowanych komórek.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ES linia komórkowa wyrażająca interesujące białko fuzyjne SNAP-tag</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych poddanych działaniu TC</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>96 Well,/przezroczysty, płytka poddana kulturze tkankowej</td><td>Corning</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>Ulepszona przez Neubauera komora licząca, 0,1 mm</td><td>Inkubator CO2 Marienfeld-superior</td><td>640030</td><td></td></tr> Wirówka <tr><td></td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5804000528</td><td></td></tr><tr><td>InCell Analyzer System obrazowania komórek 2200 GE</td><td>Healthcare Life Sciences</td><td>29027886</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu, kwalifikowana do embyonicznych komórek macierzystych</td><td>ThermoFisher</td><td>16141-079</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór pirogronianu sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>113-24-6</td><td></td></tr><tr><td>Minimalne niezbędne medium&nbsp; Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>BioConcept</td><td>4-01F00H</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 200mM</td><td>ThermoFisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik hamujący białaczkę</td><td>-</td><td>-</td><td>Wytwarzany w laboratorium przez przejściową transfekcję komórek HEK-293T, a następnie zbieranie i filtrowanie supernatantu.</td></tr><tr><td>CHIR99021 (Inhibitor GSK-3 XVI)</td><td>Merck Millipore</td><td>361559</td> PD 0325901 Sigma-Aldrich 391210-10-9 Żelatyna ze skóry bydlęcej Sigma-Aldrich 9000-70-8 Dulbecco's PBS 10x skoncentrowany BioConcept 3-05K00-I PBS firmy Dulbecco <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> bez Ca++/Mg++BioConcept 3-05F29-I <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny EDTA 0,25%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko chimery E-kadheryny Fc E-kadheryny Fc</td> R<td>& D systems</td><td>748-EC-050</td><td></td></tr><tr><td>Hyclate doksycykliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>SNAP-Cell 647-SiR</td><td>New England BioLabs</td><td>S9102S</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>-</td><td>-</td><td>Oprogramowanie do analizy obrazów typu open source</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks-Microsoft</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Białka są w dynamicznym stanie syntezy i degradacji, a ich okresy półtrwania mogą być dostosowywane w różnych okolicznościach. Jednak najczęściej stosowane podejścia do określania okresu półtrwania białek są albo ograniczone do średnich populacji z komórek poddanych lizie, albo wymagają stosowania inhibitorów syntezy białek. Protokół ten opisuje metodę pomiaru okresów półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu białek fuzyjnych SNAP-tag w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią poklatkową. Każde interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP może być kowalencyjnie związane przez fluorescencyjny, przepuszczalny dla komórek barwnik, który jest sprzężony z pochodną benzyloguaniny, a rozpad znakowanej populacji białka może być monitorowany po wypłukaniu pozostałego barwnika. Późniejsze śledzenie komórek i kwantyfikacja zintegrowanej intensywności fluorescencji w czasie skutkuje wykładniczą krzywą rozpadu dla każdej śledzonej komórki, co pozwala na określenie szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach poprzez dopasowanie krzywej. Metoda ta pozwala na oszacowanie niejednorodności okresów półtrwania w populacji hodowanych komórek, której nie można łatwo ocenić innymi metodami. Przedstawione tutaj podejście ma zastosowanie do każdego typu hodowanych komórek adherentnych, w których dochodzi do ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania, połączonego ze znacznikiem SNAP. W tym artykule wykorzystujemy mysie embrionalne komórki macierzyste (ES) hodowane na płytkach do hodowli komórkowych pokrytych E-kadheryną, aby zilustrować, w jaki sposób można określić tempo degradacji pojedynczych komórek białek o szerokim zakresie okresów półtrwania.

Opisany protokół umożliwia oszacowanie zmienności z komórki na komórkę w zakresie okresu półtrwania dowolnego białka połączonego z tagiem SNAP. Zastosowanie rekombinowanej E-kadheryny-Fc do powlekania płytki obrazowej pozwala na rozdzielczość pojedynczych komórek w przypadku komórek ES, które w przeciwnym razie rosną w koloniach. Pojedyncze komórki mogą być śledzone oddzielnie przez cały czas trwania filmu (Rycina 1A).
Aby określić okres półtrwania białka dla każd...

Ten protokół opisuje metodę określania okresu półtrwania białek w pojedynczych żywych komórkach przylegających, przy użyciu znakowania impulsowego i fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego białek fuzyjnych znaczników SNAP.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Ogólnym celem tego podejścia do obrazowania fluorescencyjnego jest określenie okresu półtrwania białka będącego przedmiotem zainteresowania w pojedynczych żywych komórkach za pomocą znacznika SNAP. Białka komórkowe są intensywnie przekształcane, a tempo syntezy i degradacji jest specyficzne dla każdego białka i podlega regulacji fizjologicznej. Jednak najczęściej stosowane metody określania okresu półtrwania białek są albo ograniczone do średnich populacji komórek, albo wymagają stosowania inhibitorów syntezy białek.W tym filmie pokazujemy, w jaki sposób znacznik SNAP w połączeniu z fluorescencyjną mikroskopią poklatkową może być wykorzystany do pomiaru okresu półtrwania białka w żywych komórkach. Zaletą tej metody jest to, że osiąga rozdzielczość pojedynczej komórki, a zatem zapewnia oszacowanie niejednorodności okresów półtrwania w populacji hodowanych komórek. Przedstawiona tutaj procedura eksperymentalna może być zastosowana do dowolnego typu przylegających komórek hodowlanych, wyrażających interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP.Można to osiągnąć poprzez endogenne znakowanie białek lub nadmierną ekspresję znakowanych białek. SNAP-tag jest zmutowaną wersją enzymu naprawy DNA, alkilotransferazy O6-alkiloguaniny-DNA, która specyficznie reaguje z benzylguaniną, która może być sprzężona z sondami molekularnymi. W związku z tym każde białko fuzyjne SNAP-tag może być nieodwracalnie znakowane barwnikiem przepuszczalnym dla komórek florescencyjnych.Po wypłukaniu z resztkowego barwnika znakowana populacja białek będzie się rozkładać wykładniczo i można wywnioskować okres półtrwania odpowiedniego białka. W tym filmie używamy embrionalnych komórek macierzystych, które tworzą ciasne kolonie, gdy są hodowane klasycznie na szalkach pokrytych żelatyną. Aby umożliwić im wzrost jako monowarstwę komórek, a tym samym osiągnięcie rozdzielczości pojedynczej komórki do eksperymentów obrazowania kwiatowego, hodowaliśmy je na przylegających do nich powlekanych płytkach, co zmniejsza interakcje między komórkami, w których pośredniczy przyleganie komórkowe inc wyrażane na błonie plazmatycznej.Rozcieńczyć rekombinowany inc przylegający do pięciu nanogramów na mikrolitr w PBS i dodać 30 mikrolitrów rozcieńczonego inc przylegającego na zawór w płytce zaworowej 96, odpowiedniej do obrazowania. Należy unikać intensywnego pipetowania, ponieważ przyleganie rekombinantu jest bardzo delikatne. Inkubować w temperaturze 37 stopni przez półtorej godziny.Odessać przylegający roztwór inc, przemyć raz 100 mikrolitrami PBS i dodać do 200 mikrolitrów wstępnie odrobaczonej pożywki hodowlanej ESL. Użyj linii ESL wyrażających interesujące białko połączone ze znacznikiem SNAP. Umyj komórki pięcioma ml PBS.Następnie dodać dwa ml Tripsona i inkubować przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni. Dodać cztery ml pożywki hodowlanej ESL, ponownie zawiesić i odwirowywać w temperaturze 1000 T przez cztery minuty. Odessać supernatant, ponownie zawiesić w świeżej pożywce i policzyć komórki.Umieść 30 000 komórek na centymetr kwadratowy w przylegającej powlekanej płytce obrazowej. Kontynuuj barwienie barwnikiem SNAP 24 godziny po umieszczeniu komórki. Rozcieńczyć barwnik komórkowy w pożywce hodowlanej ELS do optymalnego stężenia wcześniej określonego.Odessać pożywkę za pomocą pipety i ostrożnie dodać 50 mikrolitrów rozcieńczonego barwnika SNAP. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 stopni. Odessać barwnik i przemyć trzykrotnie 200 mikrolitrami PBS pre-worm.Dodaj 200 mikrolitrów pożywki hodowlanej ESL i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni. Czynności mycia należy wykonywać za pomocą delikatnej pipety i nie używać automatycznego aspiratora, ponieważ komórki mają tendencję do łatwego odłączania się. Powtórz te same etapy mycia jeszcze dwa razy, a następnie dodaj 200 mikrolitrów podłoża do obrazowania.Użyj pożywki wolnej od czerwieni fenolowej, aby zmniejszyć tło kwiatescencji. Użyj mikroskopu umożliwiającego kontrolowanie temperatury i CO2. Ustaw temperaturę na 37 stopni, a CO2 na pięć procent przed użyciem i pozwól zachować równowagę przez jedną do dwóch godzin.Umieść płytkę w mikroskopie i wybierz miejsce odpowiednie do obrazowania. Obrazy w jasnym polu pokazują ESL przymocowany do przylegającego powlekanego naczynia w monowarstwie. Wybierz cel, obiektyw 20X jest odpowiedni dla tego rozmiaru ESL.Wybierz ustawienia oświetlenia dla kanału fluorescencji, który ma być nagrywany. Dostosuj moc lasera i ekspozycję, aby uzyskać silny sygnał, ponieważ będzie on zmniejszał się w trakcie trwania filmu. Wybierz parametry akwizycji dla eksperymentu poklatkowego.W przypadku białek o oczekiwanym okresie półtrwania od dwóch do dwudziestu godzin, wybierz czas wchłaniania od 12 do 24 godzin w odstępach czasowych 15 minut. Rozpocznij eksperyment z obrazowaniem. Użyj oprogramowania FIJI do przetwarzania i analizy filmu.Zbierz uzyskane obrazy jako stos i zdeformuj go. Użyj funkcji odejmowania tła FIDŻI, aby usunąć tło ze wszystkich obrazów w stosie. Wybierz interesującą komórkę, narysuj wokół niej obszar zainteresowania za pomocą paska narzędzi FIDŻI i dodaj obszar zainteresowania do Menedżera ROI.Przejdź do następnej klatki i powtórz poprzednie czynności. Śledź interesującą Cię komórkę przez cały czas trwania filmu i zapisz ustawiony zwrot z inwestycji dla każdej śledzonej komórki. Kliknij miarę, aby uzyskać wartości średniej intensywności i obszaru ROI.Aby oszacować tło lokalne, dodaj obszar zainteresowania w pobliżu komórki zainteresowania dla każdego przedziału czasu. Na koniec kliknij przycisk Zmierz, aby uzyskać wartości średniej intensywności tła. Najpierw oblicz średnią intensywność komórki, mnożąc uzyskaną wartość średniej intensywności komórkowego ROI przez jej powierzchnię.Następnie przystąp do obliczania zintegrowanej wartości tła komórki, mnożąc średnią intensywność ROI tła przez obszar ROI komórki. Na koniec, aby uzyskać skorygowaną wartość tła dla zintegrowanej intensywności komórki, odejmij wartość zintegrowanej intensywności tła od wartości zintegrowanej intensywności komórkowej. Aby uzyskać średni okres półtrwania populacji komórek, znormalizuj uzyskane wartości do wartości intensywności pierwszej klatki dla każdej komórki.Gwarantuje to, że każda komórka przyczynia się z taką samą wagą do średniej wartości półtrwania, niezależnie od jej bezwzględnej intensywności kwitnienia. Po podziałach komórkowych śledź obie komórki potomne oddzielnie i sumuj ich zintegrowane intensywności po odjęciu tła, aby uwzględnić rozcieńczenie białka podczas podziału komórki. Zapisz zestawy ROI dla obu komórek potomnych.Aby oszacować okres półtrwania białka, użyj narzędzia do dopasowywania krzywych w MATLAB. Rozpad białka następuje wykładniczo, gdzie F(x) jest intensywnością kwitnienia w danym punkcie czasowym, a "początkową intensywnością" i b "szybkością rozpadu. Po uzyskaniu wartości szybkości zaniku b"z dopasowania, okres półtrwania można obliczyć, dzieląc logarytm dwóch przez b"Ten film pokazuje rozpad florescencji barwnika SNAP w doksycyklinie, bezużytecznej linii komórkowej fuzyjnej opt four.Obserwowany sygnał florescencji będzie zależał od użytej linii komórkowej, poziomu ekspresji odpowiedniego białka będącego przedmiotem zainteresowania, a także właściwości użytego barwnika. W przypadku eksperymentów z rozpadem białek ważne jest, aby użyć odpowiedniego stężenia barwnika SNAP. Stężenie powinno być wystarczająco wysokie, aby dać jasny sygnał fluorescencji na początku upływu czasu.Jednak stosowanie zbyt wysokich stężeń barwnika może spowodować, że resztki barwnika pozostaną w podłożu, nawet po umyciu. Wolny barwnik może następnie wiązać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w trakcie filmu, co zniekształciłoby krzywą rozpadu. Dlatego tak ważne jest, aby zoptymalizować stężenie barwnika SNAP poprzez testowanie różnych rozcieńczeń.Rysunek ten przedstawia krzywe rozpadu dla ośmiu różnych stężeń barwnika SNAP o charakterze kwiatowym testowanym na nienadającej się do użytku linii komórkowej doksycykliny. Początkowe stężenie barwnika wynoszące trzy mikromole wybrano zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi obrazowania żywych komórek, a następnie przeprowadzono seryjne rozcieńczanie od jednego do trzech, aż do osiągnięcia stężenia 1,4 nanomola. Dla dwóch najwyższych stężeń sygnał nie maleje, podczas gdy obserwowany rozpad przebiega zgodnie z krzywą wykładniczą dla niższych stężeń.W tym przykładzie wybrano optymalne stężenie 12 nanomolowców, ponieważ stężenie to zapewnia minimalne ilości resztkowego barwnika pozostawionego w pożywce po umyciu, ale sygnał kwitnienia jest nadal wystarczająco jasny, aby zaobserwować wyraźną krzywą rozpadu. Opisany protokół zapewnia oszacowanie zmienności między komórkami i okresu półtrwania dla dowolnego białka połączonego z SNAP-tag. Rysunek ten pokazuje rozpad pojedynczej komórki i średnią populacji dla trzech różnych linii komórkowych fuzji doksycykliny ze znacznikiem SNAP.Nanog "i Oct4" są raczej krótkotrwałe, ze średnimi okresami półtrwania wynoszącymi 2,9 i 4,8 godziny. Natomiast Srsf11 "jest dłużej żywy, a średni okres półtrwania wynosi 25,3 godziny. Wykresy pudełkowe pokazują rozkład okresów półtrwania dla trzech białek.Wykazaliśmy, że zastosowanie znacznika SNAP w połączeniu z mikroskopią poklatkową kwiatu pozwala na określenie okresu półtrwania dowolnego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Pomiary rozpadu pojedynczej komórki pozwalają oszacować niejednorodność okresów półtrwania w populacji komórek, co jest pomijane przy użyciu innych metod określania okresu półtrwania białka. Jednym z najważniejszych kroków podczas korzystania z SNAP-tag do monitorowania rozpadu białek jest upewnienie się, że po umyciu w pożywce lub w komórkach nie pozostały żadne resztki niezwiązanego barwnika.W przeciwnym razie może związać się z nowo wyprodukowanymi cząsteczkami SNAP-tag w dalszej części eksperymentu, a tym samym zakłócić krzywą rozpadu. Osiąga się to z jednej strony poprzez staranne wykonanie wszystkich opisanych kroków prania. Z drugiej strony stężenie barwnika SNAP powinno być utrzymywane na jak najniższym poziomie, a jednocześnie znajdować się w zakresie, który pozwala uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu.Stężenie barwnika SNAP powinno być zoptymalizowane dla każdego eksperymentu zgodnie z linią komórkową i rodzajem użytego barwnika. Chociaż możliwe jest, że znacznik SNAP może w niektórych przypadkach zmieniać okres półtrwania białek kandydujących, nie widzimy dowodów na takie efekty, ponieważ określone okresy półtrwania białek kandydujących w teście są ściśle zgodne z opublikowanymi wartościami. Aby jeszcze bardziej wykluczyć wpływ znacznika SNAP na degradację białka, jedną z opcji byłoby zablokowanie syntezy białek za pomocą cykloheksymidu i wykonanie blotów w toalecie w różnych punktach czasowych, przy użyciu przeciwciała, które rozpoznaje rodzime białko.I bezpośrednio porównać rozpad białka kandydującego na znacznik SNAP z nieoznakowaną wersją rodzimą.

single-cell-quantification-protein-degradation-rates-time-lapse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy prototypową metodę przygotowania szkiełek podstawowych pokrytych fluorescencyjną żelatyną w celu wizualizacji degradacji macierzy pośrednio przez invadopodia. Przedstawiono techniki obliczeniowe z wykorzystaniem dostępnego oprogramowania do kwantyfikacji poziomu proteolizy macierzy przez pojedyncze komórki w obrębie mieszanej populacji oraz przez grupy wielokomórkowe obejmujące całe pola widzenia mikroskopu.

Ilościowy pomiar proteolizy macierzy zewnątrzkomórkowej zależnej od invadopodiów w kontekście jednokomórkowym i wielokomórkowym

Ten film opisuje test mikropłytek in vitro oparty na fluorescencji w celu zbadania kinetyki degradacji znakowanego fluorescencyjnie, nieprawidłowo sfałdowanego zmutowanego białka lucyferazy, ulegającego ekspresji w jądrach transfekowanych komórek ssaków. Test polega na traktowaniu komórek eksprymujących zmutowane białko fluorescencyjne za pomocą inhibitora translacji i inhibitora proteasomu w celu oceny degradacji nieprawidłowo sfałdowanego białka za pośrednictwem proteasomu.

Test pościgowy cykloheksymidu oparty na mikropłytkach fluorescencyjnych: technika monitorowania kinetyki degradacji fluorescencyjnych nieprawidłowo sfałdowanych białek jądrowych

Prezentowane są dwie uzupełniające się metody oparte na cytometrii przepływowej i mikroskopii, które umożliwiają ilościowe określenie, na poziomie pojedynczej komórki, dynamiki ekspresji genów indukowanej aktywacją szlaku MAPK u drożdży.

Kwantyfikacja czasowa ekspresji indukowanej MAPK w pojedynczych komórkach drożdży

Tutaj opisujemy solidny test biologiczny do ilościowego określania względnego tempa proteolizy przez układ ubikwityna-proteasom. Odczyt testu to tempo wzrostu drożdży w płynnej kulturze, które zależy od poziomów komórkowych białka reporterowego składającego się z sygnału degradacji połączonego z niezbędnym markerem metabolicznym.

Test wzrostu oparty na reporterze do systematycznej analizy degradacji białek

Poziomy białka w komórkach i tkankach są często ściśle regulowane przez równowagę produkcji białka i jego usuwania. Korzystając z rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP), kinetykę klirensu białek można eksperymentalnie zmierzyć in vivo.

Pomiar stabilności białek w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą rozpadu fluorescencji po fotokonwersji (FDAP)

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje podejście oparte na spektroskopii fluktuacji fluorescencji, mające na celu badanie interakcji między białkami pośredniczącymi w interakcjach komórka-komórka, tj. białkami zlokalizowanymi w połączeniach komórkowych, bezpośrednio w żywych komórkach. Zapewniamy szczegółowe wytyczne dotyczące kalibracji, akwizycji i analizy przyrządów, w tym korekty możliwych źródeł artefaktów.

Test spektroskopii fluktuacji fluorescencji interakcji białko-białko na styku komórka-komórka

Opisujemy nasz protokół pomiaru rytmów biologicznych w katabolizmie białek poprzez autofagię i proteasom w wątrobie myszy.

Pomiar rytmów dobowych w strumieniu autofagicznym i proteasomalnym

Prezentujemy metodę pozyskiwania przebiegów czasu reporterowego fluorescencji z pojedynczych komórek za pomocą mikrowzorców. Protokół opisuje przygotowanie macierzy pojedynczych komórek, konfigurację i obsługę mikroskopii poklatkowej ze skanowaniem żywych komórek oraz narzędzie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym do automatycznej preselekcji, kontroli wizualnej i śledzenia przebiegów czasu fluorescencji zintegrowanych z komórkami na miejsce adhezji.

Obrazowanie żywych komórek macierzy jednokomórkowych (LISCA) - wszechstronna technika ilościowego określania kinetyki komórkowej

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Poznaj metodę pomiaru czasu połowicznego zaniku białek w pojedynczych komórkach przy użyciu znaczników SNAP i mikroskopii fluorescencyjnej. Technika ta umożliwia analizę heterogeniczności degradacji białek w populacji komórek.

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja szybkości degradacji białek w pojedynczych komórkach za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej w przylegającej hodowli komórkowej

Przeglądaj więcej filmów