Name: Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania rekombinowanej integrazy wirusa pienistego PFV z wykorzystaniem chromatografii afinitacyjnej na heparynie oraz testu na aktywność nukleazową. Protokół umożliwia uzyskanie wolnego od zanieczyszczeń enzymu do badań biochemicznych i jednocząsteczkowych mechanizmów integracji retrowirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH AI099854 i AI126742 do KEY.

1. Indukuj ekspresję PFV IN u E. coli
<ol>
	<li>Dodaj 1 μl plazmidu ekspresyjnego PFV IN (10 ng / μL) do 20 μl E. coli BL21 (DE3) pLysS (20 μl podwielokrotność dostępnych na rynku komórek ma >2 x 106 CFU / μg plazmidu) w probówce 1,5 ml. Delikatnie wymieszaj, stukając palcem lub przesuwając tubkę. Inkubować na lodzie 5 min.
	<ol>
		<li>Szok cieplny dokładnie przez 30 s w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C, a następnie natychmiastowy powrót do lodu na 2 minuty.</li>
		<li>Dodaj 80 μl super optymalnego bulionu o temperaturze pokojowej z pożywką do tłumienia katabolitu (SOC). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obrotach na minutę (obr./min).</li>
		<li>Płytka 25 μl mieszaniny na szalce Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm zawierająca 25 ml agaru Luria bulionu (LB) (1 l agaru LB: 10 g bakto-tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego, 15 g agaru) i 100 μg/ml ampicyliny (100 mg/ml roztworu podstawowego).</li>
		<li>Pozostałe 75 μl przekształconych komórek należy umieścić na drugiej identycznej płytce. Inkubować płytki z opuszczonymi pokrywkami przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobrać płytki z przekształconą bakterią E. coli. Użyj pojedynczej kolonii do zaszczepienia 3 ml LB (1 l LB: 10 g bakto-tryptonu, 10 g NaCl, 5 g ekstraktu drożdżowego) uzupełnionych 100 μg/ml ampicyliny w 14-mililitrowej probówce do hodowli polipropylenu z okrągłym dnem. Inkubować przez ~8 h w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 225 obr./min.
	<ol>
		<li>Dodać 3 ml kultury do 50 ml LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu (34 mg/ml roztworu podstawowego) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.</li>
		<li>Przenieść 53 ml kultury do 1 l LB, 100 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu w 4 l kolbie Erlenmeyera. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem 225 obr./min.</li>
		<li>Okresowo mierzyć gęstość optyczną kultury przy długości fali zewnętrznej 600 nm (OD600). Początkowo sprawdzaj kulturę OD600 co godzinę. Gdy kultura osiągnie pożądany OD600, sprawdzaj co 15 minut, aby nie zarosnąć. Rozwijaj kulturę do OD600 między 0,9 a 1,0. Przenieść kolbę do łaźni lodowej i zawirować, aby obniżyć temperaturę kultury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś 1 ml kultury do probówki o pojemności 1,5 ml w celu późniejszej analizy poprzez denaturację analizy SDS-PAGE.
	<ol>
		<li>Granulować komórki w probówce o pojemności 1,5 ml przez wirowanie przez 1 minutę w mikrofugach o sile 14 000 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez pipetowanie. PBS może być z CaCl2 i MgCl2 lub bez nich.</li>
		<li>Dodać 150 μl 2x bufor do próbek SDS-PAGE (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 1,2% SDS, 30% glicerol, 15% β-merkaptoetanol (βME), 0,0018% błękit bromofenolowy) i dokładnie wymieszać pipetą lub wirem. Gotować przez 3 minuty. Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do hodowli bakteryjnej dodać końcowe stężenie 0,25 mM izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG, 0,25 M roztwór podstawowy) i 50 μM ZnCl2 (50 mM roztwór podstawowy). IPTG indukuje ekspresję genu PFV IN z promotora T7, a ZnCl2 jest dodawany jako suplement do prawidłowego fałdowania aminokońcowej domeny palca cynkowego w PFV IN. Inkubować kulturę w temperaturze 25 °C, wytrząsając przy 225 obr./min przez 4 godziny. Natychmiast przenieść kolbę do łaźni lodowej. Zaoszczędź 1 ml kultury do analizy SDS-PAGE zgodnie z tym samym protokołem, co powyżej w 1.3.</li>
	<li>Przenieś kulturę bakteryjną do butelek wirówkowych o odpowiedniej wielkości. Na przykład kulturę o pojemności 1 l można przenieść do czterech sterylnych jednorazowych butelek polipropylenowych o pojemności 250 ml ze stożkowym dnem. Wirować butelki w wirówce stołowej z chłodzeniem o sile 3000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odlać supernatanty przez nalanie.
	<ol>
		<li>Zawiesić wszystkie granulki z 1 l kultury bakteryjnej w całkowitej objętości 25 ml (6,25 ml na butelkę) zimnego PBS (z lub bez CaCl2 i MgCl2) przez pipetowanie. Połączyć i przenieść zawiesiny bakteryjne do jednej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować w wirówce z chłodzeniem przy 3 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez nalewanie lub pipetowanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić osad bakteryjny w 10 ml buforu do sporządzania zawiesiny (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl i inhibitor proteazy 500 μM fenylometylosulfanu (PMSF)) przez pipetowanie. Zatrzaskowo zamroź osad, umieszczając probówkę w kolbie Dewara z ciekłym azotem wystarczającym do zanurzenia probówki o pojemności 50 ml. Ostrożnie wyjąć probówkę z ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	Uwaga: Granulki bakteryjne mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C. Nie zaobserwowaliśmy utraty aktywnego białka po przechowywaniu w temperaturze -80 °C przez dwa lata.</li>
	<li>Analizuj próbki przed indukcją i po indukcji dla żeli SDS-PAGE o szerokości 8,3 cm, wysokości 7,3 cm i grubości 0,75 mm z 1,5 ml 6% poliakryloamidu (125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6% akrylamidu, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED) i 3,5 ml 10% warstwy rozdzielczej poliakrylamidu (375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 10% akrylamidu, 0,1% SDS, 0,1% nadsiarczanu amonu, 0,001% TEMED)12.
	<ol>
		<li>Po nalaniu żelu do układania w stos włóż grzebień z 10 dołkami. Gdy żel spolimeryzuje, zmontuj aparat PAGE i dodaj wystarczającą ilość buforu do biegania SDS-PAGE (25 mM Tris, 192 mM glicyny, 0,1% SDS).</li>
		<li>Załadować 10 μl każdej próbki i 4 μl wstępnie wybarwionych wzorców białkowych. Biegać z napięciem 16,5 V/cm, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu, około 60 minut.</li>
		<li>Zdemontuj płytki żelowe i przenieś żel do plastikowej wanny. Dodaj roztwór barwiący Coomassie Brilliant Blue (0,1% błękitu brylantowego Coomassie R-250, 40% metanolu, 10% kwasu octowego), aby obficie pokryć żel i barwić przez 20 minut w temperaturze otoczenia.</li>
		<li>Usuń roztwór barwiący, wlewając go i zastąp roztworem odbarwiającym (40% metanolu, 10% kwasu octowego), aż pasma będą łatwo widoczne. Usuń roztwór odbarwiający, wlewając go i zastąp wodą dejonizowaną. PFV IN powinien być łatwo zidentyfikowany w próbce po indukcji. PFV IN ze znacznikiem heksahistydyny ma masę cząsteczkową 47374 Da.</li>
		<li>Jeśli PFV IN nie jest widoczny, powtórz indukcję, zaczynając od innej kolonii z jednej z płytek transformacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chromatografia powinowactwa do niklu
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną osadkę bakteryjną na lodzie. 
	Uwaga: Zajmie to dużo czasu (około 2 - 3 godzin). Gdy osad rozmrozi się do zawiesiny komórkowej, dodaj dodatkowe 500 μM PMSF (100 mM roztworu podstawowego).</li>
	<li>Probówkę o pojemności 50 ml z zawiesiną bakteryjną należy przechowywać na lodzie. Sonikuj bakterie przy amplitudzie 30% przez 30 s (1 s wł., 1 s wyłącz) na osad pochodzący z 1 l kultury za pomocą sonikatora z biotubą o średnicy 0,5 cala ze stożkową mikrokońcówką o średnicy 0,125 cala, częstotliwości 20 kHz i maksymalnej mocy 400 W.</li>
	<li>Przenieść próbkę komórki do zimnej probówki ultrawirówkowej. Używaj zestawów butelek z poliwęglanu (średnica 25 mm, wysokość 89 mm) kompatybilnych z wirnikiem o stałym kącie nachylenia typu 60 Ti. Można stosować alternatywne rury i wirniki, jeśli osiągana jest ta sama siła grawitacji. Wirować 120 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C. Powinna być oczywista kulka. Supernatant może mieć barwę żółtą.</li>
	<li>Przenieść supernatant przez nalewanie lub pipetowanie do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Zwróć uwagę na głośność; Objętość ta powinna być w przybliżeniu równa objętości bufora do sporządzania zawiesiny użytej przed zamrożeniem błyskawicznym. Jeśli supernatant jest lepki, może być zanieczyszczony bakteryjnym DNA, które może zatkać kolumnę chromatograficzną. W takim przypadku powtórz ultrawirowanie, aby osadzać DNA bakterii.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml buforu A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) i 500 ml buforu B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazolu). 
	Uwaga: Zgodnie z tym protokołem system szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), wszystkie i próbkę należy przechowywać w temperaturze 4 °C w chłodni.
	<ol>
		<li>Sterylne filtracyjne A i B z jednorazowymi jednostkami filtrującymi 0,2 μm. W zależności od systemu FPLC umyj pompę A i pompę B odpowiednio z buforem A i buforem B. Przepuść 90% buforu A i 10% buforu B przez system, aż ustabilizują się odczyty przewodności i UV. Maksymalne natężenie przepływu będzie zależeć od instrumentu; stosować natężenie przepływu 5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 1,0 MPa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kolumnę FPLC o długości 110 mm i średnicy 5 mm z 1,5 ml żywicy naładowanej niklem (maksymalna zdolność wiązania 50 mg/ml, maksymalne ciśnienie 1 MPa). Kolumna może być przygotowana dzień przed oczyszczeniem i przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Podłącz kolumnę do przyrządu FPLC. Zrównoważyć kolumnę z 20 ml 90% buforu A i 10% buforu B (20 mM imidazolu) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 0,5 MPa. Przyrząd powinien zbierać w czasie rzeczywistym dane dotyczące przewodności i absorbancji UV przy 280 nm (A280). Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować. Jeśli te odczyty nie ustabilizowały się, kontynuuj przepływ przez kolumnę, aż będą stabilne.</li>
	<li>Załaduj próbkę białka (~10 ml na granulkę) do kolumny z natężeniem przepływu 0,15 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 0,5 MPa. Natężenie przepływu i ciśnienie w kolumnie pozostają takie same przez cały czas oczyszczania. Zebrać przepływ w probówce o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Przemyć kolumnę 20 ml 90% buforu A i 10% buforu B. Zebrać płukanie w probówce o pojemności 50 ml. Eluować białka za pomocą 20 ml gradientu liniowego od 10% do 100% buforu B (20 mM do 200 mM imidazolu).</li>
		<li>Na koniec przemyć kolumnę 5 ml 100% buforu B (200 mM imidazolu). Zbierz gradient i końcowe pranie we frakcjach 0,27 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połączyć 15 μl buforu próbki 2x SDS-PAGE z 15 μl frakcji przepływu, przemywania i piku A280. Gotuj próbki przez 3 minuty.
	<ol>
		<li>Przygotuj dwa 10% żele SDS-PAGE, jak opisano wcześniej w kroku 1.6, z wyjątkiem 15 grzebieni studzienkowych. Załadować 10 μl każdej próbki do żeli i 4 μl wstępnie wybarwionych wzorców białkowych. Uruchom, wybarwij i przeanalizuj żele zgodnie z opisem w kroku 1.6.</li>
		<li>Połącz frakcje, które wydają się zawierać prawie czysty PFV IN na podstawie oględzin. Odmierz objętość przez pipetowanie, zwykle 8 - 10 ml.</li>
		<li>Za pomocą spektrofotometru zmierz A280 połączonych frakcji i oblicz całkowitą ilość białka PFV IN; nasza typowa wydajność to ~ 10 mg na L indukowanej hodowli. Współczynnik ekstynkcji PFV IN ze znacznikiem heksahistydyny wynosi 59360 cm-1 M-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby usunąć znacznik heksahistydyny, należy uzupełnić PFV IN 10 mM ditiotreitolem (DTT, 1 M roztwór podstawowy) i 0,1 mM EDTA, pH 8,0 (0,5 M roztwór podstawowy). Dodać 15 μg proteazy 3C ludzkiego rinowirusa (HRV) na mg PFV IN. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Rozszczepienie zmniejsza masę cząsteczkową PFV IN z 47374 Da do 44394 Da i może być zweryfikowane przez 10% analizę SDS-PAGE.</li>
</ol>
3. Chromatografia powinowactwa heparyny
<ol>
	<li>Przygotuj 250 ml buforu C (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF) i 250 ml buforu D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl). 
	Uwaga: W tym protokole system FPLC, i próbka są przechowywane w chłodni w temperaturze 4 °C.
	<ol>
		<li>Sterylne filtracyjne C i D z jednorazowymi jednostkami filtrującymi 0,2 μm. W zależności od systemu FPLC umyć pompę A i pompę B odpowiednio buforem C i buforem D. Przepuść 80% buforu C i 20% buforu D przez system, aż odczyty przewodności i UV ustabilizują się. Maksymalne natężenie przepływu będzie zależeć od instrumentu; rutynowo stosujemy natężenie przepływu 5 ml/min z maksymalnym limitem ciśnienia 1,0 MPa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować kolumnę FPLC o długości 80 mm i średnicy 5 mm z 1 ml heparynowej żywicy sefarozowej (maksymalna zdolność wiązania 2,0 mg bydlęcej antytrombiny III na ml żywicy; maksymalne ciśnienie 1,4 MPa). Kolumnę można przygotować dzień przed oczyszczaniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podłączyć kolumnę do przyrządu FPLC.
	<ol>
		<li>Zrównoważyć kolumnę z 20 ml 80% buforu C i 20% buforu D (200 mM NaCl) przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 1 MPa. Przyrząd powinien zbierać w czasie rzeczywistym dane dotyczące przewodności i absorbancji UV przy 280 nm (A280). Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować. Jeśli te odczyty nie ustabilizowały się, kontynuuj przepływ przez kolumnę, aż będą stabilne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmniejszyć stężenie NaCl w próbce PFV IN do 200 mM, dodając 1,5 objętości buforu C. Na przykład dodaj 15 ml buforu C do 10 ml PFV IN. Nasza całkowita objętość to zazwyczaj ~25 mL.</li>
	<li>Załadować rozcieńczoną próbkę PFV IN do kolumny sefarozy heparyny przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min przy maksymalnym ciśnieniu granicznym 1,0 MPa. Natężenie przepływu i ciśnienie w kolumnie pozostają takie same przez cały czas oczyszczania. Zebrać przepływ w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
	<ol>
		<li>Przemyć kolumnę 20 ml 80% buforu C i 20% buforu D (200 mM NaCl), zbierając popłuczynę do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Eluować kolumnę za pomocą 30 ml gradientu liniowego od 20% do 100% buforu D (200 mM do 1 M NaCl).</li>
		<li>Przemyć kolumnę 5 ml 100% buforu D. Zebrać gradient i końcowe płukanie we frakcjach 0,37 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizuj obciążenie, przepływ, mycie i frakcje o 8% SDS-PAGE zgodnie z opisem w 2.9. PFV IN po rozszczepieniu znacznika heksahistydyny ma masę cząsteczkową 44394 Da, a współczynnik ekstynkcji pozostaje 59360 cm-1 M-1 bez znacznika heksahistydyny. Przechowywać wszystkie frakcje w temperaturze 4 °C do czasu zakończenia testu nukleazy.</li>
</ol>
4. Test nukleazy
<ol>
	<li>Zidentyfikuj frakcje sefarozy heparyny, które wydają się zawierać prawie czysty PFV IN. Połączyć 3 μl frakcji heparyny i 50 ng 3 kb superskręconego plazmidowego DNA w buforze reakcyjnym (10 mM HEPES, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mMMgSO4, 4 μM ZnCl2, 10 mM DTT) z końcową objętością 15 μL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 min. Uwzględnij kontrolę ujemną bez PFV IN.
	<ol>
		<li>Zatrzymać reakcję za pomocą 1 mg/ml proteinazy K (20 mg/ml roztworu podstawowego) i 0,5% SDS (10% roztworu podstawowego). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do późniejszej analizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować 125 ml żelu agarozy o zawartości 1% wagowo-objętościowej (w/v) w 1x bufor TAE (40 mM tris-acetat, 1 mM EDTA) z 0,1 μg/ml bromku etydyny (10 mg/ml roztworu podstawowego)13. Rozpuść roztwór agarozy i wlej do tacki do odlewania żelu o wymiarach 15 cm x 10 cm. Włóż grzebień z 15 dołkami z dołkami o szerokości 5 mm i grubości 0,75 mm. Cienkie studzienki zapewniają lepszą rozdzielczość pasma w porównaniu do studzienek o grubości 1,5 mm. Pozwól żelowi zestalić się w temperaturze otoczenia.
	<ol>
		<li>Zanurz żel w 1x TAE z 0,1 μg/ml bromku etydyny. Dodaj 3,5 μl 6-krotnego barwnika ładującego (50% glicerolu, 0,15% barwnika pomarańczowego G) do reakcji testu nukleazy. Załaduj całą objętość do żelu. Uruchom żel przy stałym napięciu, 10 woltów na cm (100 V) w temperaturze otoczenia przez 1 godzinę lub do momentu, gdy czoło barwnika Orange G dotrze do końca żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast zobrazuj żel agarozowy za pomocą skanera fluorescencyjnego ustawionego na wykrywanie bromku etydyny. Liniowe DNA powinno działać zgodnie z rozmiarem 3 kb, superskręcone DNA powinno działać szybciej (~2 kb), a zrelaksowane okrągłe DNA powinno działać wolniej (~3,5 kb).
	<ol>
		<li>Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, oblicz objętość pikseli superskręconego, liniowego i zrelaksowanego plazmidu kołowego na każdym pasie. Wywołaj sumę objętości pikseli dla tych trzech form DNA wartością "całkowitego DNA" i użyj jej do obliczenia procentu okręgów liniowych i zrelaksowanych. Na przykład objętość pikseli zrelaksowanych okręgów dzieli się przez całkowitą wartość piksela DNA na tym pasie, pomnóż tę liczbę przez 100, aby określić procent. Frakcje zawierające zanieczyszczającą nukleazę wykazują wyższy procent okręgów liniowych i zrelaksowanych w porównaniu z kontrolą negatywną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz frakcje sefarozy heparyny, które nie wykazują zanieczyszczającej aktywności nukleazy. Dializować w rurkach dializacyjnych o masie cząsteczkowej 10 mm 6 - 8 kDa (MWCO) w temperaturze 4 °C przez noc w stosunku do 1 l 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM NaCl, 50 μM ZnCl2, 10 mM DTT, 20% glicerolu.</li>
	<li>Odzyskaj wolną od nukleaz próbkę PFV IN z rurki dializowej. Zmierzyć A280 i obliczyć końcowe stężenie białka. Podwielokrotność i szybkie zamrożenie w ciekłym azocie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li>
<li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+reaction+pathway+and+critical+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li>
<li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li>
<li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rekombinowane białka, które oddziałują z DNA, takie jak białka naprawcze DNA, zmiatacze tlenu do zastosowań w mikroskopii jednocząsteczkowej lub integrazy retrowirusowe, powinny być wolne od zanieczyszczających nukleaz bakteryjnych 2,3. Zanieczyszczenia te mogą zmylić interpretację wyników podczas masowych testów biochemicznych lub jednocząsteczkowych.
Odkryliśmy, że nukleaza bakteryjna często oczyszcza się z PFV IN. Jednak PFV IN wyka...

Badania biochemiczne i jednocząsteczkowe interakcji białek z DNA wymagają wyjątkowo czystych białek rekombinowanych. Zanieczyszczenie nukleaz przez bakterie może zaciemnić wyniki tych testów. Skażający nukleazę znaleziono w preparatach rekombinowanych białek, protokatechuaty-3,4-dioksygenazy wymiatającej tlen (PCD) i prototypowej integrazy (IN) wirusa piankowatego (PFV) wyizolowanej z Escherichia coli (E. coli)1,2,3.
Testy integracji retrowirusowej polegają na konwersji superskręconego DNA na produkty nacięte lub liniowe jako miarę aktywności IN4. Podczas infekcji komórkowej IN łączy dwa końce wirusowego cDNA z chromatyną gospodarza5. Każda reakcja łączenia końców nazywana jest przenoszeniem nici. Testy aktywności rekombinowanego IN mogą łączyć dwa oligomery DNA naśladujące końcówki cDNA wirusa do docelowego DNA w skoordynowanej reakcji integracji4,5,6,7,8. Alternatywnie, rekombinowany IN może łączyć tylko jeden koniec DNA w niefizjologicznie istotnej reakcji integracji połowy miejsca9,10. Gdy celem integracji jest superskręcone plazmidowe DNA, skoordynowane produkty integracji są linearyzowanym DNA, a produkty integracji połowy miejsca są zrelaksowanymi kręgami. Te produkty reakcji są identyfikowane na podstawie ich względnej ruchliwości podczas elektroforezy w żelu agarozowym1. Jeśli rekombinowany IN ma zanieczyszczającą nukleazę, pojawią się fałszywe rozluźnione kręgi lub prawdopodobnie zlinearyzowany plazmid, który myli wyniki eksperymentalne. Oligomery wirusowego DNA mogą być znakowane fluorescencyjnie w celu jednoznacznej identyfikacji produktów integracji, w przeciwieństwie do produktów nukleazy. Jednak IN bardzo faworyzuje cele superskręconego DNA; jakakolwiek utrata superskręconego plazmidu do zrelaksowanych okręgów lub liniowego DNA przez zanieczyszczenie nukleazy może zniekształcić wyniki i interpretację danych11. Dlatego konieczne jest usunięcie nukleaz bakteryjnych z retrowirusowych preparatów IN.
PFV IN ma inne powinowactwo do sefarozy heparyny w porównaniu do nukleazy bakteryjnej1. PFV IN i nukleazę można oddzielić przez elucję o liniowym gradiencie od sefarozy heparyny. Nukleaza nie jest łatwo wykrywana przez absorbancję ultrafioletu (UV) przy piku 280 nm lub przez analityczną elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE). Zamiast tego nukleaza jest wykrywana przez test aktywności nukleazy wykorzystujący konwersję superskręconego plazmidu do zrelaksowanych okręgów lub produktów liniowych. Każda frakcja po chromatografii sefarozy heparyny jest badana pod kątem aktywności nukleazy. PFV IN i zanieczyszczenie nukleazą nie mają różnicy w powinowactwie do żywicy anionowej Mono-Q. Istnieje niewielka różnica w powinowactwie do żywicy kationowej Mono-S. Jednak rozdzielczość Mono-S nukleazy bakteryjnej i PFV IN nie pozwoliłaby na skuteczną separację białek. Ostatecznie, oczyszczanie powinowactwa sefarozy heparyny zapewnia najlepszą separację nukleazy bakteryjnej od PFV IN i ma tę zaletę, że ma nieograniczoną objętość ładunku.
Testy na aktywność nukleazy mogą być dostosowane do innych białek. Białko będące przedmiotem zainteresowania będzie prawdopodobnie miało alternatywne charakterystyki powinowactwa niż PFV IN; Różnica w charakterystyce wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania i zanieczyszczenia nukleazą musi być określona empirycznie. Ta metodologia identyfikacji zanieczyszczenia nukleazami może być dostosowana do innych żywic, w tym żywic kationowych Mono-S lub żywic anionowymiennych Mono-Q. Żywice powinowactwa i wymiany jonowej mogą stanowić niezawodną metodę izolowania rekombinowanego białka będącego przedmiotem zainteresowania od zanieczyszczających nukleaz bez ograniczeń dotyczących objętości białka podczas chromatografii.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB bulion</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza&nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 Proteaza 3C&nbsp;</td><td>Chemikalia EMD</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Białko integrazy (IN) prototypu wirusa piankowatego (PFV) retrowirusa jest modelowym enzymem do badania mechanizmu integracji retrowirusowej. W porównaniu do IN z innych retrowirusów, PFV IN jest bardziej rozpuszczalny i bardziej podatny na manipulację eksperymentalną. Ponadto jest wrażliwy na klinicznie istotne inhibitory ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV-1) IN, co sugeruje, że mechanizm katalityczny PFV IN jest podobny do mechanizmu HIV-1 IN. IN katalizuje kowalencyjne łączenie komplementarnego DNA wirusa (cDNA) z docelowym DNA w procesie zwanym transferem nici. Ta reakcja przenoszenia nici wprowadza nacięcia do docelowego DNA. Analiza produktów reakcji integracji może być zakłócona przez obecność nukleaz, które podobnie nacinają DNA. Wykazano, że nukleaza bakteryjna oczyszcza się jednocześnie z rekombinowanym PFV IN ulegającym ekspresji w Escherichia coli (E. coli). Tutaj opisujemy metodę izolowania PFV IN od zanieczyszczającej nukleazy za pomocą chromatografii powinowactwa heparyny. Frakcje można łatwo przebadać pod kątem zanieczyszczenia nukleazą za pomocą superskręconego plazmidu i elektroforezy w żelu agarozowym. PFV IN i zanieczyszczająca nukleaza wykazują alternatywne powinowactwo do sefarozy heparyny, co pozwala na beznukleazowe przygotowanie rekombinowanego PFV IN, odpowiedniego do masowej analizy biochemicznej lub integracji pojedynczych cząsteczek.

Rekombinowana integraza PFV (PFV IN) jest często zanieczyszczona nukleazą bakteryjną1. Biochemiczne testy integracji opierają się na ilościowym oznaczeniu konwersji superkolowanego DNA plazmidowego w koliste formy zrelaksowane oraz produkty liniowe. Obecność zanieczyszczającej nukleazy może prowadzić do błędnych wyników ilościowych w tych testach. Ekspresja PFV IN z tagiem heksahistydynowym jest indukowana w E. coli (Rycina 1) i wstępnie oczyszczana za pomocą...

Rekombinowany prototyp pienistego białka integrazy wirusa jest często zanieczyszczony nukleazą bakteryjną podczas oczyszczania. Metoda ta identyfikuje zanieczyszczenie nukleazą i usuwa je z końcowego przygotowania enzymu.

Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest identyfikacja i usuwanie zanieczyszczającej aktywności nukleazy podczas oczyszczania białek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie retrowirologii, takie jak biochemia, struktura i dynamika integracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na identyfikację i usuwanie zanieczyszczającej aktywności nukleazy DNA z interesującego badacza białka rekombinowanego podczas procesu oczyszczania.Zacznij od rozmrożenia na lodzie jednej porcji osadu komórek E.coli wykazujących ekspresję prototypowej integrazji wirusa piankowego. Użyj sonikatora wyposażonego w biohorn o średnicy 0,5 cala z mikrokońcówką stożkową o średnicy 0,125 cala, aby przeprowadzić sonikację przez 30 sekund przy amplitudzie 30%, trzymając probówkę na lodzie. Po sonikacji przenieś próbkę komórek do zimnej probówki do ultrawirówki i wiruj przy 120 000 ×g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu powinien pojawić się wyraźny osad, a nadpływ może mieć żółty kolor. Przenieś nadpływ do schłodzonej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przygotuj kolumnę FPLC o długości 110 mm i średnicy 5 mm, wypełnioną 1,5 ml żywicy załado

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie i usuwanie skażenia nukleazą podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa piankowatego

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Źródło: Mackler, R. M., et al. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (2018)W tym filmie przedstawiono oczyszczanie intasomów wirusa pienistego prototypowego (PFV) z mieszanej zawiesiny białkowo-DNA przy użyciu ekstrakcji solnej i chromatografii żelowej (SEC), co pozwala na uzyskanie aktywnych kompleksów do dalszych analiz.

Oczyszczanie intasomów prototypowego wirusa piankowatego (PFV) metodą chromatografii wykluczania cząsteczkowego

Oczyszczanie integrazu wirusowego za pomocą chromatografii powinowactwa

Źródło: Lopez Jr., M. et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę oczyszczania integraz wirusowej z zanieczyszczeń nukleazami bakteryjnymi przy użyciu chromatografii kolumnowej na żywicy heparin Sepharose, a następnie analizę SDS-PAGE w celu potwierdzenia czystości białka.

Oczyszczanie integraz wirusowej przy użyciu chromatografii powinowactwa do heparyny

Źródło: Gao, Y., et al. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (2021)Film prezentuje montaż in vitro swoistych dla wirusa nukleokapsydów z oczyszczonego kompleksu nukleoproteiny i fosfoproteiny pozbawionego RNA, ich oczyszczanie za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego oraz walidację pełnowymiarowego wirusowego RNA wewnątrz zmontowanych cząsteczek.

Rekonstytucja in vitro i oczyszczanie wirusowych cząstek przypominających nukleokapsyd

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Rekombinowana integraza retrowirusowa i oligomery DNA naśladujące końcówki DNA wirusa mogą tworzyć enzymatycznie aktywny kompleks znany jako intasom. Intasomy mogą być wykorzystywane do badań biochemicznych, strukturalnych i kinetycznych. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak składać i oczyszczać prototypowe pieniste intasomy wirusa.

Montaż i oczyszczanie prototypowych pienistych intasomów wirusowych

Opisujemy tutaj generowanie in vitro DNA HBV za pomocą systemu infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i bardzo czułe wykrywanie jego (1-2 kopii) integracji za pomocą odwrotnego zagnieżdżonego PCR.

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

Rekombinowany wirus związany z adenowirusem (rAAV) jest szeroko stosowany do klinicznego i przedklinicznego dostarczania genów. Niedocenianym zastosowaniem rAAV jest silna transdukcja hodowanych komórek bez konieczności oczyszczania. Dla badaczy, którzy są nowicjuszami w rAAV, udostępniamy protokół klonowania kaset transgenowych, produkcji prymitywnych wektorów i transdukcji kultur komórkowych.

Ekspresja transgenu w hodowanych komórkach przy użyciu nieoczyszczonych rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adenowirusem

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Mutageneza insercyjna jest niezbędnym narzędziem w genetyce postępowej do identyfikacji funkcjonalnych elementów genomu. W tym miejscu opisujemy InSET (InSET) badanie przesiewowe oparte na insercji dla funkcjonalnych elementów i transkryptów, metodę wykrywania miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej opartej na lentiwirusie.

Identyfikacja funkcjonalnie istotnych miejsc integracji lentiwirusa w bibliotece komórek mutagenezy insercyjnej

Poznaj metodę oczyszczania rekombinowanej integrazy wirusa pienistego PFV z wykorzystaniem chromatografii afinitacyjnej na heparynie oraz testu na aktywność nukleazową. Protokół umożliwia uzyskanie wolnego od zanieczyszczeń enzymu do badań biochemicznych i jednocząsteczkowych mechanizmów integracji retrowirusowej.

Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

Przeglądaj więcej filmów