Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej prototypowej integrazy wirusa pienistego

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest identyfikacja i usuwanie zanieczyszczającej aktywności nukleazy podczas oczyszczania białek. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie retrowirologii, takie jak biochemia, struktura i dynamika integracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na identyfikację i usuwanie zanieczyszczającej aktywności nukleazy DNA z interesującego badacza białka rekombinowanego podczas procesu oczyszczania.

Zacznij od rozmrożenia na lodzie jednej porcji osadu komórek E.coli wykazujących ekspresję prototypowej integrazji wirusa piankowego. Użyj sonikatora wyposażonego w biohorn o średnicy 0,5 cala z mikrokońcówką stożkową o średnicy 0,125 cala, aby przeprowadzić sonikację przez 30 sekund przy amplitudzie 30%, trzymając probówkę na lodzie. Po sonikacji przenieś próbkę komórek do zimnej probówki do ultrawirówki i wiruj przy 120 000 ×g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu powinien pojawić się wyraźny osad, a nadpływ może mieć żółty kolor. Przenieś nadpływ do schłodzonej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przygotuj kolumnę FPLC o długości 110 mm i średnicy 5 mm, wypełnioną 1,5 ml żywicy załadowanej niklem.

W pierwszej kolejności należy podłączyć kolumnę do urządzenia FPLC i wprowadzić bufor. Urządzenie powinno rejestrować w czasie rzeczywistym dane dotyczące przewodności oraz absorbancji UV przy 280 nanometrach. Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować.

W razie potrzeby kontynuuj przepływ buforów przez kolumnę, aż odczyty się ustabilizują. Używając pętli superloop, nałóż próbkę białka na kolumnę przy szybkości przepływu 0,15 ml/min i maksymalnym limicie ciśnienia 0,5 MPa. Podłącz pętlę superloop do systemu AKTA FPLC.

Po przemyciu kolumny i elucji białek, pobrać 15-µl aliquoty początkowego przelewu, przemywki oraz frakcji z piku absorbancji przy 280 nm, a następnie do każdej próbki dodać 15 µl 2X buforu do próbek SDS-PAGE. Gotować próbki przez trzy minuty. Na żele 10% SDS-PAGE nanieść 10 µl każdej próbki wraz z czterema µl wstępnie barwionych standardów białkowych.

Dokonaj inspekcji wizualnej żelu w celu zidentyfikowania frakcji, które wydają się zawierać niemal czystą integrazę prototypowego wirusa pienistego. Połącz te frakcje, notując ich objętość podczas pipetowania. Zazwyczaj wynosi ona od 8 do 10 ml.

Za pomocą spektrofotometru zmierz absorbancję UV przy 280 nanometrach połączonych frakcji, a następnie oblicz całkowitą ilość białka integrazu wirusa piankowego prototypowego. Typowa wydajność wynosi około 10 miligramów na litr indukowanej hodowli. Aby usunąć znacznik heksahistydynowy, uzupełnij integrazę wirusa piankowego prototypowego do końcowego stężenia 10-milimolowego DTT oraz 0,1-milimolowego EDTA.

Następnie należy dodać 15 µg proteazy 3C ludzkiego rynowirusa na każdy mg integraz integrazy prototypowego wirusa piankowego i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Aby przeprowadzić frakcjonowanie integraz prototypowego wirusa piankowego za pomocą chromatografii powinowactwa do heparyny, należy obniżyć stężenie chlorku sodu w próbce do 200 mM poprzez dodanie 1,5 objętości buforu C. Następnie rozcieńczoną próbkę integraz prototypowego wirusa piankowego należy nałożyć na kolumnę Sepharose z heparyną przy szybkości przepływu 0,5 mL/min i maksymalnym limicie ciśnienia 1 MPa. Po przemyciu kolumny oraz zebraniu gradientu i końcowego przemycia, należy przeanalizować próbkę nałożoną, przepływ, przemycia oraz frakcje za pomocą 8% SDS-PAGE.

Następnie należy ocenić frakcje, barwiąc żel błękitem Coomassie. Integraza prototypowego wirusa pienistego oraz zanieczyszczająca nukleaza wykazują różną powinowactwo do chromatografii na Sepharose z heparyną. Należy zidentyfikować frakcje z Sepharose z heparyną, które wydają się zawierać niemal czystą integrazę prototypowego wirusa pienistego, aby wykorzystać je w teście nukleazowym.

Aby rozpocząć analizę nukleazową, połączyć 3 µL frakcji heparyny, 50 ng superzwiniętego plazmidowego DNA o długości 3 kb oraz bufor reakcyjny do uzyskania końcowej objętości 15 µL. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. Przerwać reakcję, dodając Proteinazę K o stężeniu 1 mg/mL oraz 0,5% SDS, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Następnie do reakcji testu nukleazowego należy dodać 3,5 µL barwnika do nakładania 6X, a całą objętość nanieść na żel agarozy 1%. Żel należy prowadzić przy napięciu 100 V w temperaturze otoczenia przez jedną godzinę lub do momentu, aż czoło barwnika dotrze do końca żelu. Po zakończeniu elektroforezy obraz żelu z fluorescencyjnego skanera powinien wykazać, że liniowe DNA wędruje zgodnie z rozmiarem na poziomie 3 kb, superzwinięte DNA wędruje szybciej, do około 2 kb, a rozluźnione koliste DNA wędruje wolniej, blisko 3,5 kb.

Używając oprogramowania do analizy obrazu, oblicz objętość pikseli dla plazmidu w formie superskręconej, liniowej i rozluźnionej w każdej ścieżce. Sumę objętości pikseli dla tych trzech form DNA określ jako całkowitą wartość DNA i wykorzystaj ją do obliczenia procentowego udziału form liniowych i rozluźnionych kół. Frakcje zawierające zanieczyszczenia nukleazami wykazują wyższy procent form liniowych i rozluźnionych kół w porównaniu z kontrolą negatywną.

Połączyć frakcje z kolumny Heparin Sepharose, które nie wykazują zanieczyszczenia aktywnością nukleazy, i przenieść je do membran dializacyjnych o średnicy 10 mm i progu odcięcia masy cząsteczkowej od 6 do 8 kDa. Dializować przez noc w temperaturze 4 °C przeciwko 1 litrowi roztworu dializacyjnego. Następnego dnia odzyskać z membrany dializacyjnej próbkę prototypowej integrazy wirusa piankowego wolną od nukleazy.

Zmierz absorbancję przy 280 nanometrach i oblicz końcowe stężenie białka. Podziel białko na alikwoty i zamroź je gwałtownie w ciekłym azocie. Następnie przechowuj alikwoty w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Test nukleazy przeprowadzono zgodnie z opisem w tym filmie. Kontrole negatywne obejmują plazmidowe DNA bez białka oraz poprzednią puryfikację integraz wirusa piankowego typu prototypowego (wild-type prototype foamy virus integrase), o której wiadomo, że jest wolna od nukleazy. Kontrolą pozytywną dla zanieczyszczającej aktywności nukleazy jest poprzednia puryfikacja katalitycznie nieaktywnej integraz wirusa piankowego typu prototypowego, o której wiadomo, że zawiera zanieczyszczającą nukleazę.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak testy biochemiczne lub obrazowanie pojedynczych cząsteczek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące kinetyki i dynamiki enzymów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak zidentyfikować i usunąć zanieczyszczającą aktywność nukleazy z białka rekombinowanego.