Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Ogólnym celem tej metody jest stabilna transfekcja hepatocytów in vivo, z konstruktami wektorowymi do indukowalnej ekspresji genów lub shRNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad wątrobą. Na przykład, może być stosowany do badania mechanizmów raka wątroby i regeneracji.

Główną zaletą tej techniki jest połączona ekspresja CreER wraz z indukowalną ekspresją transgenu R shRNA w hepatocytach myszy in vivo, osiągniętą przez hydrodynamiczne wstrzyknięcie żyły ogonowej. Procedurę zademonstruje Eric Hübner, student medycyny z naszego laboratorium. Zacznij od połączenia 150 nanogramów wektora wejściowego zawierającego krótki RNA spinki do włosów dla docelowego białka ze 150 nanogramami wektora pTC Tet i buforu TE do całkowitej objętości ośmiu mikrolitrów.

Następnie przenieś mieszaninę enzymów klonazy LR II do lodu i inkubuj przez dwie minuty. Wirować dwa razy podczas inkubacji. Następnie dodaj do reakcji dwa mikrolitry mieszanki enzymów klonazy LR II i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę.

Po inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając jeden mikrolitr roztworu proteinazy K. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dziesięć minut. Następnie przekształć bakterie kompetentne Stbl3 za pomocą dwóch mikrolitrów mieszanki klonującej przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego.

Po posianiu przemiany na płytkach agarowych zawierających ampicylinę, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz pojedyncze kolonie i zaszczep małe ilości pożywki bakteryjnej do inkubacji przez noc. Po wyizolowaniu DNA i potwierdzeniu integralności wektora za pomocą sekwencjonowania Sangera, przygotuj maksimum DNA konstruktu do wstrzyknięcia.

Zacznij od zważenia myszy. Następnie przygotuj sterylny roztwór soli fizjologicznej zawierający 15 mikrogramów na mililitr bezendotoksynowego konstruktu wektorowego Śpiąca Królewna i jeden mikrogram na mililitr wolnego od endotoksyn pchsB5. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby wstrzyknąć każdej myszy objętość równą 10% jej masy ciała.

Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 3 mililitrów wymaganą objętością dla jednej myszy i przymocuj igłę o rozmiarze 27. Po dodaniu odpowiedniej ilości bibuły, aby pozostawić minimalną przestrzeń do ruchu, ale wystarczająco dużo miejsca do oddychania, włóż mysz do odpowiedniego ogranicznika z otworami do oddychania. Ogrzej ogon za pomocą lampy na podczerwień przez 30 do 60 sekund, uważnie obserwując oznaki przegrzania, takie jak szybki ruch ogona lub inne oznaki pobudzenia.

Następnie wyczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Wbić igłę prawie poziomo do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych w pobliżu podstawy ogona. W przypadku pomyślnego umieszczenia, niewielka ilość krwi może spłynąć z powrotem do stożka igły.

Wstrzyknąć całkowitą objętość do żyły ogonowej w ciągu ośmiu do dziesięciu sekund. Po wstrzyknięciu należy natychmiast wyjąć mysz z ogranicznika. Uciskać ranę po wstrzyknięciu sterylną gazą przez co najmniej 30 sekund lub do momentu ustąpienia krwawienia.

Udane hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej ma kluczowe znaczenie dla transfekcji, a zwłaszcza zależy od prędkości, objętości i czasu iniekcji. Aby ułatwić wstrzyknięcie dożylne, upewnij się, że myszy nie są zestresowane ani odwodnione w dniu wstrzyknięcia. Po 30 do 60 minutach samodzielnego trzymania w klatce odzyskiwania przenieś mysz z powrotem do pierwotnej klatki.

Indukcję rekombinazy Cre należy rozpocząć 10 do 15 dni po wstrzyknięciu żyły ogonowej, aby umożliwić usunięcie niezintegrowanych wektorów. Rozpuścić dziesięć miligramów tamoksyfenu w 40 mikrolitrach etanolu i inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dziesięć minut z wytrząsaniem. Wirować kilka razy, aż tamoksyfen się rozpuści.

Następnie dodaj 960 mikrolitrów oleju kukurydzianego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu wciągnąć roztwór do 1-mililitrowej strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 20. Następnie zmień na igłę o rozmiarze 27.

Aby wstrzyknąć, najpierw potrząśnij myszą, ostrożnie chwytając szyję myszy kciukiem i drugim palcem, mocując ogon między podstawą dłoni a czwartym i piątym palcem. Następnie dootrzewnowo wstrzyknąć 0,1 mililitra roztworu w lewy dolny kwadrant brzucha. W przypadku eksperymentów trwających krócej niż dziesięć dni, należy stale podawać doksycyklinę w wodzie pitnej, stosując następujący protokół.

Najpierw rozpuść pięć gramów sacharozy w 100 mililitrach wody z kranu i autoklawie. Następnie rozpuść 100 miligramów hykulanu doksycykliny w pięciu mililitrach roztworu sacharozy w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby sterylnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 mikrona.

Następnie dodaj przefiltrowany roztwór doksycykliny do pozostałych 95 mililitrów roztworu sacharozy i podawaj roztwór myszy zamiast wody pitnej. Sprawdzaj codziennie i wymieniaj natychmiast, jeśli roztwór stanie się mętny, ponieważ oznacza to przerost bakterii. Przygotuj 1-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 27 z jednym mililitrem 4% roztworu paraformaldehydu.

Użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy anatomicznych, aby wykonać laparotomię środkową i odsłonić wątrobę poddanej eutanazji myszy. Przesuń jelito cienkie w prawo, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną. Wprowadzić igłę przygotowanej strzykawki do żyły głównej dolnej i przeciąć żyłę wrotną.

Wstrzyknij powoli jeden mililitr PFA, aby obficie obficie tkankę wątroby i usunąć autofluorescencyjne czerwone krwinki. Po usunięciu wątroby opłucz ją w wodzie i przenieś do pięciu do dziesięciu mililitrów 4% roztworu PFA do postfix przed cięciem. Wstrzyknięcie konstruktu transpozonu, który łączy konstytutywną ekspresję indukowalnej rekombinazy Cre z indukowalną ekspresją wybranego transgenu lub shRNA do myszy reporterowych Cre wykazało silną ekspresję genu reporterowego GFP po aktywacji rekombinazy Cre przez tamoksyfen.

Po leczeniu doksycykliną indukowaną ekspresję transgenu można uwidocznić za pomocą odpowiednich przeciwciał w transfekowanych hepatocytach. W przypadku indukowalnej ekspresji shRNA, cytoplazmatyczna ekspresja GFP wykryta przez barwienie immunologiczne może być wykorzystana jako zastępczy marker ekspresji shRNA. Wstrzyknięto konstrukt transpozonu zawierający kasetę ekspresji lucyferazy pod kontrolą konstruktu promotora specyficznego dla wątroby.

Po wstrzyknięciu lucyferyny myszy obrazowano za pomocą systemu obrazowania in vivo dwa tygodnie po hydrodynamicznym wstrzyknięciu żyły ogonowej. Obrazowanie wykazało solidną i stabilną bioluminescencję lucyferazy w wątrobie 15 dni po wstrzyknięciu, co pokazuje, że system może być z powodzeniem stosowany do śledzenia obecności transfekowanych komórek in vivo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Po opanowaniu, hydrodynamiczne iniekcje do żyły ogonowej można wykonać w około 15 minut, podczas gdy cała procedura od klonowania naszego wstrzyknięcia myszom, indukcji ekspresji transgenu R shRNA do przygotowania wątroby zajmie około trzech do czterech tygodni.

Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wielkości i integralności sekwencji plazmidów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować system pTC Tet z wybranym transgenem R shRNA do dowolnego modelu myszy Crelux Pbase.