Name: Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metodę stabilnej transfekcji hepatocytów mysich in vivo przy użyciu hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej. Technika umożliwia indukowalną ekspresję transgenów i shRNA, co wspiera badania nad rakiem wątroby i regeneracją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Krebshilfe, Niemcy (grant numer 111289 dla UE), Lucile Packard Foundation for Children's Health (Ernest and Amelia Gallo Endowed Postdoctoral Fellowship - CTSA grant number UL1 RR025744 to UE). Dziękujemy dr Markowi A. Kayowi za konstrukty wektorowe i porady eksperymentalne oraz dr Julienowi Sage'owi za myszy i wsparcie eksperymentalne.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych i zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne władze (Regierung von Oberbayern, Monachium, Niemcy i Stanford Institutional Animal Care and Use Committee, Stanford, CA, USA). Lista wszystkich plazmidów do klonowania (kroki od 1 do 4) znajduje się w tabeli uzupełniającej S1.
1. Klonowanie transgenu w celu konstytutywnej ekspresji genu
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji transgenu13,14.</li>
	<li>Dodaj miejsca ograniczeń dla PacI (TTAATTAA) na końcu 5' startera do przodu. Dodaj miejsca ograniczeń dla AscI (GGCGCGCC) lub FseI (GGCCGGCC) na końcu 5' startera odwrotnego.</li>
	<li>Amplifikacja transgenu metodą PCR przy użyciu warunków zoptymalizowanych dla pożądanego transgenu14. Oczyść za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania DNA. 
	UWAGA: Czas wyżarzania zależy od podkładów zaprojektowanych w kroku 1.1., czas wydłużenia zależy od długości konstrukcji. Na przykład dla konstrukcji o długości 1,000 pz użyj 60 s czasu wydłużenia.</li>
	<li>Strawić transgen i wektor do konstytutywnej ekspresji genów15 z odpowiednimi nukleazami restrykcyjnymi (patrz krok 1.2) i buforować w całkowitej objętości 50 μl w temperaturze 37 °C przez noc. Na przykład skrót konstrukować z 5 jednostkami PacI i 5 jednostkami FseI, jeśli to konieczne (patrz krok 1.2).</li>
	<li>Żel oczyszcza strawiony wektor i wprowadza za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonać standardowe podwiązanie 100 ng wektora i 100–1 000 ng wkładki przy użyciu 400 U T4 ligazy w temperaturze 14 °C przez 16 godzin. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przekształć kompetentne bakterie za pomocą standardowego protokołu szoku cieplnego16.</li>
	<li>Płytka na płytkach agarowych zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Wybierz pojedyncze kolonie, oczyść plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu miniprep zgodnie z instrukcjami producenta i zweryfikuj sekwencjonowanie za pomocą sekwencjonowania Sangera17 (starter sekwencjonowania: 5' TGCTGGAGTTCTTCGCC 3').</li>
	<li>Użyj dodatnich kolonii do amplifikacji plazmidu DNA w maksymalnej skali i oczyść za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn18 zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Konstrukcja jest gotowa do wstrzyknięcia, dlatego przejdź do kroku 5.</li>
</ol>
2. Klonowanie transgenu w celu indukowalnej ekspresji genu
<ol>
	<li>Zaprojektuj startery do amplifikacji transgenu13,14.</li>
	<li>Dodaj miejsca ograniczeń dla SacI (GAGCTC), SpeI (ACTAGT) lub KpnI (GGTACC) do końca 5' startera do przodu. Dodaj miejsca ograniczeń dla NotI (GCGGCCGC) lub XhoI (CTCGAG) na końcu 5' odwróconego startera.</li>
	<li>Amplifikacja transgenu metodą PCR przy użyciu warunków zoptymalizowanych dla pożądanego transgenu14. Oczyść za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania DNA.</li>
	<li>Oddzielnie trawić oczyszczony transgen i 4 μg wektora wejściowego (wektor pEN_TTmcs, patrz tabela materiałów)19 za pomocą odpowiednich nukleaz restrykcyjnych (patrz krok 2.2) i buforować w całkowitej objętości 50 μl w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Żel oczyszcza strawiony wektor i wprowadza za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonać standardowe podwiązanie ze 100 ng wektora i 100–1 000 ng wkładki przy użyciu 400 U T4 ligazy w temperaturze 14 °C przez 16 godzin. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przekształć kompetentne bakterie za pomocą standardowego protokołu szoku cieplnego16.</li>
	<li>Płytka na płytkach agarowych zawierających 15 μg/ml gentamycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Wybierz pojedyncze kolonie, oczyść plazmidowe DNA i zweryfikuj wstawienie przez sekwencjonowanie17 za pomocą startera do przodu pCEP: 5' AGAGCTCGTTTAGTGAACCG 3'. 
	UWAGA: PCR na pojedynczych koloniach można przeprowadzić bez wcześniejszego oczyszczania za pomocą starterów pCEP do przodu i pCEP do tyłu (5' AGA AAG CTG GGT CTA GAT ATC TCG 3'). Ten krok może być przydatny do wstępnej selekcji dodatnich kolonii.</li>
	<li>Przejdź do kroku 4.</li>
</ol>
3. Klonowanie miR-shRNA w celu wyeliminowania indukowalnego genu
<ol>
	<li>Projektowanie oligonukleotydów miR-shRNA zgodnie z protokołem klonowania pSLIK19. Wyżarzać i oczyszczać oligonukleotydy i rozcieńczać 1 : 20 w ddH2O.</li>
	<li>Strawić 3 μg wektora wejściowego za pomocą 5 U BfuAI w temperaturze 50 °C przez 3 godziny, a następnie dezaktywować reakcję w temperaturze 65 °C przez 20 min. 
	UWAGA: Jeśli pożądana jest koekspresja białka zielonej fluorescencji (GFP), użyj pEN_TTGmiRc19 jako wektora wejściowego, w przeciwnym razie użyj pEN_TTmiRc219.</li>
	<li>Żel oczyszcza strawiony wektor jak w kroku 2.5. Przeprowadzić standardowe ligowanie 100 ng wektora i 1 μl oczyszczonych i rozcieńczonych oligonukleotydów shRNA (krok 3.1) przy użyciu 400 U ligazy T4 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 10 min.</li>
	<li>Przekształć kompetentne bakterie za pomocą standardowego protokołu szoku cieplnego16.</li>
	<li>Płytka na płytkach agarowych zawierających 15 μg/ml gentamycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.</li>
	<li>Wybierz pojedyncze kolonie, oczyść plazmidowe DNA i zweryfikuj wstawienie za pomocą sekwencjonowania Sangera17 (starter sekwencjonowania: 5' TAGTCGACTAGGGATAACAG 3').</li>
	<li>Przejdź do kroku 4.</li>
</ol>
4. Klonowanie rekombinacyjne w celu wygenerowania klonów gotowych do wstrzyknięcia
<ol>
	<li>Wymieszaj 150 ng wektora wejściowego (z kroku 2 lub kroku 3) i 150 ng wektora pTC TET-vector20.</li>
	<li>Dodać bufor TE do całkowitej objętości 8 μl (pH = 8).</li>
	<li>Przenieść mieszaninę enzymów LR-klonazy II (patrz tabela materiałów) do lodu, inkubować przez 2 minuty.</li>
	<li>Dodać 2 μl mieszaniny enzymów LR-klonazy II do reakcji i inkubować w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Zatrzymaj reakcję, dodając 1 μl roztworu K proteinazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Przekształć kompetentne bakterie Stbl3 za pomocą 2 μl rekombinacyjnej mieszanki klonującej przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego16.</li>
	<li>Płytka na płytkach agarowych zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Wybierz pojedyncze kolonie, oczyść plazmidowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn18 zgodnie z instrukcjami producenta i potwierdź integralność wektora za pomocą sekwencjonowania Sanger17 (starter sekwencjonowania 5' AGGGACAGCAGATCCAGTTTGG 3').</li>
	<li>Konstrukcja jest gotowa do wstrzyknięcia, przejdź do kroku 5.</li>
</ol>
5. Przygotowanie roztworu do hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej
UWAGA: Przygotowanie konstruktów do konstytutywnej i indukowalnej ekspresji genów jest opisane w Kroku 1, 2, 3 i 4.
<ol>
	<li>Przygotować sterylny 0,9% roztwór soli fizjologicznej do wstrzykiwań (nie stosować PBS). Użyj objętości odpowiadającej około 10% masy ciała myszy. Przykład: dla myszy o wadze 20 g przygotuj 2 ml roztworu.</li>
	<li>Przygotuj wektory iniekcyjne, które zostały oczyszczone za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn18 (patrz odpowiednio krok 1.8 lub 4.8).</li>
	<li>Dodaj 10 μg lub 15 μg bezendotoksynowego konstruktu wektorowego śpiącej królewny (z kroku 1 użyj 10 μg, z kroku 4 użyj odpowiednio 15 μg) i 1 μg wolnego od endotoksyn pc-HSB521 na ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Przechowywać roztwór do 4 godzin w temperaturze 4 °C. Nie zamrażać.</li>
</ol>
6. Wykonywanie hydrodynamicznej iniekcji żył ogonowych
<ol>
	<li>Do wstrzykiwania żyły ogonowej należy użyć ogranicznika (dostępnego w handlu lub przygotowanego ze stożkowej rurki o pojemności 50 ml z otworami do oddychania i do ogona). Wypełnij dno tuby bibułą.</li>
	<li>Do wstrzykiwań należy używać myszy w wieku około 8–10 tygodni o wadze 20–25 g.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem należy zważyć myszy i przygotować objętość wstrzyknięcia w zależności od masy ciała (co odpowiada 10% masy ciała, patrz krok 5.1). Przygotować sterylną strzykawkę o pojemności 3 ml z igłą 27 G do wstrzykiwań i napełnić wymaganą objętością.</li>
	<li>Umieść mysz w ograniczniku. Dostosuj ilość bibuły (patrz krok 6.1), aby pozostawić tylko minimalną przestrzeń do ruchu, ale wystarczająco dużo miejsca do oddychania.</li>
	<li>Upewnij się, że mysz regularnie oddycha.</li>
	<li>Ogrzej ogon za pomocą lampy na podczerwień przez 30-60 s. Uważnie obserwuj, czy nie ma oznak przegrzania.</li>
	<li>Oczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem.</li>
	<li>Wprowadzić igłę prawie poziomo do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych w pobliżu podstawy ogona. 
	UWAGA: W przypadku pomyślnego umieszczenia, niewielka ilość krwi może spłynąć z powrotem do stożka igły. Nie zaleca się aktywnego zasysania, ponieważ każdy dodatkowy ruch igły może spowodować jej przemieszczenie i/lub uszkodzenie żyły.</li>
	<li>Wstrzyknąć całkowitą objętość do żyły ogonowej w ciągu 8-10 sekund.</li>
	<li>Natychmiast wyjmij mysz z ogranicznika. Uciskać ranę po wstrzyknięciu przez co najmniej 30 s lub do momentu ustąpienia krwawienia.</li>
	<li>Umieść mysz w osobnej klatce. Gdy mysz dojdzie do siebie po zabiegu (około 30–60 minut), przenieś mysz z powrotem do pierwotnej klatki. Regularnie sprawdzaj na myszce przez następne 24 godziny < / >
	UWAGA: Łagodną sedację myszy obserwuje się rutynowo przez okres do 2 godzin po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do dalszych eksperymentów (tj. kroku 7) należy odczekać 10–15 dni na usunięcie niezintegrowanych wektorów.</li>
</ol>
7. Indukcja transfekowanego CreER za pomocą tamoksyfenu
UWAGA: Tamoksyfen jest szkodliwy, może działać na raka lub uszkadzać płodność. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki.
<ol>
	<li>Zaplanuj dootrzewnowe wstrzyknięcia tamoksyfenu przez trzy kolejne dni.</li>
	<li>W dniu 1 rozpuść 10 mg tamoksyfenu w 40 μl etanolu. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Wirować kilka razy, aż tamoksyfen się rozpuści.</li>
	<li>Dodaj 960 μl oleju kukurydzianego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 55 °C. Kilkakrotnie przemieszać, aby uzyskać klarowny roztwór.</li>
	<li>Przygotować roztwór w strzykawce insulinowej o pojemności 1 ml z igłą 27 G.</li>
	<li>Chropij mysz, ostrożnie chwytając szyję myszy kciukiem i drugim palcem, mocując ogon między podstawą dłoni a czwartym i piątym palcem.</li>
	<li>Wstrzyknąć 0,1 ml (= 1 mg tamoksyfenu) roztworu dootrzewnowo w lewy dolny kwadrant jamy brzusznej.</li>
	<li>Powtórz wstrzyknięcia w drugim i trzecim dniu.</li>
</ol>
8. Indukcja ekspresji genu zależnego od tetracykliny lub shRNA
UWAGA: Doksycyklina może być szkodliwa. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki.
UWAGA: W zależności od rodzaju i czasu trwania eksperymentu, doksycyklina może być dostarczana do wody pitnej (krok 8.1) lub karmy (krok 8.2)
<ol>
	<li>W przypadku eksperymentów krótkoterminowych (<10 dni) należy podawać doksycyklinę z wodą pitną, stosując następujący protokół.
	<ol>
		<li>Rozpuść 5 g sacharozy w 100 ml wody z kranu. Autoklaw.</li>
		<li>Rozpuścić 100 mg hykulanu doksycykliny w 5 ml roztworu sacharozy (krok 8.1.1) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml sterylnie przefiltruj roztwór przez filtr 0,2 μm. Dodać do roztworu sacharozy przygotowanego w kroku 8.1.1.</li>
		<li>Dostarczyć myszowi roztwór doksycykliny i sacharozy jako wodę pitną. Sprawdzaj codziennie i wymieniaj, gdy roztwór stanie się mętny, co wskazuje na przerost bakterii (wymień klarowny roztwór najpóźniej po trzech dniach).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku długotrwałych doświadczeń (>10 dni) lub doświadczeń wrażliwych na zmiany metaboliczne należy stosować handlową doksycyklinę (np. Doksycyklinę Hyclate Chow 0,625 g/kg), aby uniknąć odwodnienia i/lub zmian w wątrobie leczonych zwierząt wywołanych sacharozą.</li>
</ol>
9. Przygotowanie wątroby myszy do analizy metodą barwienia immunologicznego
UWAGA: Paraformaldehyd może być szkodliwy. Proszę zapoznać się z kartą charakterystyki.
UWAGA: Czas, w którym myszy będą analizowane, zależy od eksperymentu. Zaleca się analizę tkanki wątroby po co najmniej trzech dniach leczenia doksycykliną, aby zapewnić wystarczającą indukcję ekspresji transgenu lub shRNA.
<ol>
	<li>Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 27 G z 1 ml 4% roztworu paraformaldehydu (PFA).</li>
	<li>Poddaj mysz eutanazji odpowiednią metodą zgodnie z zatwierdzonym protokołem dla zwierząt. 
	UWAGA: Wytyczne dotyczące odpowiednich metod eutanazji mogą się różnić w zależności od instytucji.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek preparacyjnych i kleszczy anatomicznych ostrożnie otwórz jamę brzuszną za pomocą laparotomii środkowej, aby odsłonić wątrobę. Przesuń jelito cienkie w prawo, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną (IVC).</li>
	<li>Wprowadzić igłę przygotowanej strzykawki (patrz krok 9.1) do kroplówki i przeciąć żyłę wrotną. Wstrzyknąć powoli 1 ml PFA do IVC, aby perfundować tkankę wątroby i usunąć autofluorescencyjne czerwone krwinki (pożądane, jeśli ma być przeprowadzone barwienie immunofluorescencyjne).</li>
	<li>Usuń wątrobę. Spłucz wodą i przenieś do 5–10 ml 4% roztworu PFA.</li>
	<li>W przypadku wycinków parafinowych należy utrwalić tkankę przez 36–48 godzin. Tkanka jest gotowa do odwodnienia i zatopienia w parafinie.</li>
	<li>W przypadku zamrożonych skrawków utrwalić tkankę w 4% PFA na 1 godzinę.
	<ol>
		<li>W celu krioprotekcji przenieś do 10% roztworu sacharozy. Inkubacja 60 min.</li>
		<li>Przenieść do 20% roztworu sacharozy. Inkubacja 60 min.</li>
		<li>Przenieść do 30% roztworu sacharozy. Inkubacja 12–16 godzin. Zanurzyć w masie do zatapiania zamrożonych części i zamrozić w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Byass, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+liver+disease%3A+a+challenge+for+methods+and+for+public+health%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">The global burden of liver disease: a challenge for methods and for public health.</a> BMC Med. 12, 159(2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic liver diseases.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (5), G449-G468 (2013).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 645-658 (2007).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+reverse+tet-transactivator+mouse+strains+for+the+efficient+induction+of+TRE-regulated+transgenes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional reverse tet-transactivator mouse strains for the efficient induction of TRE-regulated transgenes in mice.</a> PLoS One. 9 (4), e95236(2014).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latest+development+in+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Latest development in viral vectors for gene therapy.</a> Trends Biotechnol. 21 (3), 117-122 (2003).</li>
<li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Kanefuji, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemodynamics+of+a+hydrodynamic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Hemodynamics of a hydrodynamic injection.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14029(2014).</li>
<li>Ivics, Z., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty+Transposition%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty Transposition.</a> Microbiol Spectr. 3 (2), (2015).</li>
<li>Hausl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperactive+sleeping+beauty+transposase+enables+persistent+phenotypic+correction+in+mice+and+a+canine+model+for+hemophilia+B%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Hyperactive sleeping beauty transposase enables persistent phenotypic correction in mice and a canine model for hemophilia B.</a> Mol Ther. 18 (11), 1896-1906 (2010).</li>
<li>Doyle, A., McGarry, M. P., Lee, N. A., Lee, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+transgenic+and+gene+knockout%2Fknockin+mouse+models+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease.</a> Transgenic Res. 21 (2), 327-349 (2012).</li>
<li>Hubner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+transfection+system+for+inducible+gene+expression+and+gene+silencing+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes.</a> J Gene Med. 19 (1-2), (2017).</li>
<li>Katzen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gateway%28%28R%29%29+recombinational+cloning%3A+a+biological+operating+system%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gateway((R)) recombinational cloning: a biological operating system.</a> Expert Opin Drug Discov. 2 (4), 571-589 (2007).</li>
<li>Chuang, L. Y., Cheng, Y. H., Yang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+primer+design+for+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Specific primer design for the polymerase chain reaction.</a> Biotechnol Lett. 35 (10), 1541-1549 (2013).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Ehmer, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+size+control+is+dominant+over+Rb+family+inactivation+to+restrict+proliferation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Organ size control is dominant over Rb family inactivation to restrict proliferation in vivo.</a> Cell Rep. 8 (2), 371-381 (2014).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explanatory+chapter%3A+how+plasmid+preparation+kits+work%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Explanatory chapter: how plasmid preparation kits work.</a> Methods Enzymol. 529, 23-28 (2013).</li>
<li>Shin, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+lentiviral+vector+platform+for+microRNA-based+conditional+RNA+interference+and+coordinated+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single lentiviral vector platform for microRNA-based conditional RNA interference and coordinated transgene expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13759-13764 (2006).</li>
<li>Hubner, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+transfection+system+for+inducible+gene+expression+and+gene+silencing+in+murine+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">An in vivo transfection system for inducible gene expression and gene silencing in murine hepatocytes.</a> J Gene Med. , (2016).</li>
<li>Yant, S. R., Huang, Y., Akache, B., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+transposon+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Site-directed transposon integration in human cells.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e50(2007).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Hum Gene Ther. 10 (10), 1735-1737 (1999).</li>
<li>Maruyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+naked+DNA+delivered+to+rat+liver+via+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">High-level expression of naked DNA delivered to rat liver via tail vein injection.</a> J Gene Med. 4 (3), 333-341 (2002).</li>
<li>Bell, J. B., Aronovich, E. L., Schreifels, J. M., Beadnell, T. C., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+expression+and+activity+of+Sleeping+Beauty+transposase+in+mouse+liver+following+hydrodynamic+DNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Duration of expression and activity of Sleeping Beauty transposase in mouse liver following hydrodynamic DNA delivery.</a> Mol Ther. 18 (10), 1796-1802 (2010).</li>
<li>Brunetti-Pierri, N., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+inborn+errors+of+liver+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for inborn errors of liver metabolism.</a> Mol Genet Metab. 86 (1-2), 13-24 (2005).</li>
<li>Atta, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+liver+regeneration%3A+experimental+studies+and+prospects+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for liver regeneration: experimental studies and prospects for clinical trials.</a> World J Gastroenterol. 16 (32), 4019-4030 (2010).</li>
<li>Malato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+of+mature+hepatocytes+in+mouse+liver+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration.</a> J Clin Invest. 121 (12), 4850-4860 (2011).</li>
<li>Weber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+somatic+multiplex-mutagenesis+for+high-throughput+functional+cancer+genomics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).</li>
<li>Viecelli, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+phenylketonuria+using+minicircle-based+naked-DNA+gene+transfer+to+murine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Treatment of phenylketonuria using minicircle-based naked-DNA gene transfer to murine liver.</a> Hepatology. 60 (3), 1035-1043 (2014).</li>
<li>Delerue, F., White, M., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible%2C+tightly+regulated+and+non-leaky+neuronal+gene+expression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Inducible, tightly regulated and non-leaky neuronal gene expression in mice.</a> Transgenic Res. 23 (2), 225-233 (2014).</li>
<li>Izsvak, Z., Ivics, Z., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+Beauty%2C+a+wide+host-range+transposon+vector+for+genetic+transformation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Sleeping Beauty, a wide host-range transposon vector for genetic transformation in vertebrates.</a> J Mol Biol. 302 (1), 93-102 (2000).</li>
<li>Koponen, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline-regulated+lentiviral+vector+system+with+a+novel+reverse+transactivator+rtTA2S-M2+shows+a+tight+control+of+gene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Doxycycline-regulated lentiviral vector system with a novel reverse transactivator rtTA2S-M2 shows a tight control of gene expression in vitro and in vivo.</a> Gene Ther. 10 (6), 459-466 (2003).</li>
<li>Saitoh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+doxycycline-mediated+adrenocorticotropic+hormone+secretion+from+encapsulated+Tet-on+proopiomelanocortin+Neuro2A+cells+in+the+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent doxycycline-mediated adrenocorticotropic hormone secretion from encapsulated Tet-on proopiomelanocortin Neuro2A cells in the subarachnoid space.</a> Hum Gene Ther. 9 (7), 997-1002 (1998).</li>
<li>Yao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Inducible+Triple-Transgenic+Mouse+Model+for+Rapid+Real-Time+Detection+of+HCV+NS3%2F4A+Protease+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conditional Inducible Triple-Transgenic Mouse Model for Rapid Real-Time Detection of HCV NS3/4A Protease Activity.</a> PLoS One. 11 (3), e0150894(2016).</li>
<li>Santacatterina, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+oxidative+phosphorylation+in+the+liver+by+expression+of+the+ATPase+inhibitory+factor+1+induces+a+tumor-promoter+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of oxidative phosphorylation in the liver by expression of the ATPase inhibitory factor 1 induces a tumor-promoter metabolic state.</a> Oncotarget. 7 (1), 490-508 (2016).</li>
<li>Hojman, P., Eriksen, J., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-On+induction+with+doxycycline+after+gene+transfer+in+mice%3A+sweetening+of+drinking+water+is+not+a+good+idea%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tet-On induction with doxycycline after gene transfer in mice: sweetening of drinking water is not a good idea.</a> Anim Biotechnol. 18 (3), 183-188 (2007).</li>
<li>Cawthorne, C., Swindell, R., Stratford, I. J., Dive, C., Welman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+doxycycline+delivery+methods+for+Tet-inducible+gene+expression+in+a+subcutaneous+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Tech%22%5BJournal%5D)">Comparison of doxycycline delivery methods for Tet-inducible gene expression in a subcutaneous xenograft model.</a> J Biomol Tech. 18 (2), 120-123 (2007).</li>
<li>Yuan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HBV-tolerant+immunocompetent+model+that+effectively+simulates+chronic+hepatitis+B+virus+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Anim%22%5BJournal%5D)">An HBV-tolerant immunocompetent model that effectively simulates chronic hepatitis B virus infection in mice.</a> Exp Anim. , (2016).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPB5-Mediating+Protein+Suppresses+Hepatitis+B+Virus+%28HBV%29+Transcription+and+Replication+by+Counteracting+the+Transcriptional+Activation+of+Hepatitis+B+virus+X+Protein+in+HBV+Replication+Mouse+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Jundishapur+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">RPB5-Mediating Protein Suppresses Hepatitis B Virus (HBV) Transcription and Replication by Counteracting the Transcriptional Activation of Hepatitis B virus X Protein in HBV Replication Mouse Model.</a> Jundishapur J Microbiol. 8 (9), e21936(2015).</li>
<li>Yagai, T., Miyajima, A., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3E+secreted+by+damaged+hepatocytes+regulates+the+sinusoidal+regeneration+and+liver+fibrosis+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3E secreted by damaged hepatocytes regulates the sinusoidal regeneration and liver fibrosis during liver regeneration.</a> Am J Pathol. 184 (8), 2250-2259 (2014).</li>
<li>Tordella, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SWI%2FSNF+regulates+a+transcriptional+program+that+induces+senescence+to+prevent+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SWI/SNF regulates a transcriptional program that induces senescence to prevent liver cancer.</a> Genes Dev. 30 (19), 2187-2198 (2016).</li>
<li>Ogata, K., Selvaraj, S. R., Miao, H. Z., Pipe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+factor+VIII+B+domain+missense+mutations+are+unlikely+to+be+causative+mutations+for+severe+hemophilia+A%3A+implications+for+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Most factor VIII B domain missense mutations are unlikely to be causative mutations for severe hemophilia A: implications for genotyping.</a> J Thromb Haemost. 9 (6), 1183-1190 (2011).</li>
<li>Vercellotti, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ferritin+ferroxidase+induces+cytoprotective+pathways+and+inhibits+microvascular+stasis+in+transgenic+sickle+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">H-ferritin ferroxidase induces cytoprotective pathways and inhibits microvascular stasis in transgenic sickle mice.</a> Front Pharmacol. 5, 79(2014).</li>
<li>Ando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+adverse+events+of+interferon+gamma+gene+therapy+by+gene+delivery+of+interferon+gamma-heparin-binding+domain+fusion+protein+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Prevention of adverse events of interferon gamma gene therapy by gene delivery of interferon gamma-heparin-binding domain fusion protein in mice.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 14023(2014).</li>
<li>Watcharanurak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immunological+balance+by+sustained+interferon-gamma+gene+transfer+for+acute+phase+of+atopic+dermatitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Regulation of immunological balance by sustained interferon-gamma gene transfer for acute phase of atopic dermatitis in mice.</a> Gene Ther. 20 (5), 538-544 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Transfekcja hepatocytów z hydrodynamicznym wstrzyknięciem żyły ogonowej stała się uznaną metodą od czasu jej wprowadzenia ponad 15 lat temu6. Wstrzyknięta objętość przekracza pojemność minutową serca i przepływa z żyły głównej dolnej do sinusoid wątroby7, prowadząc do transfekcji około 10-20%, w niektórych przypadkach do 40% hepatocytów25,26. Predyktorami udanej transfekcji są wstrzyknięta objętość na czas wstrzykni...

Przewlekła choroba wątroby stanowi poważne obciążenie zdrowotne na całym świecie1. Modele badawcze na zwierzętach są niezbędnymi narzędziami w badaniach nad chorobami wątroby i pomogły odpowiedzieć na złożone pytania dotyczące regeneracji wątroby, zapalenia wątroby i stłuszczenia, a także raka wątroby2. Znaczna liczba tych modeli zwierzęcych opiera się na genetycznej modyfikacji komórek wątroby. Dlatego pomocne są skuteczne narzędzia do manipulowania ekspresją genów w hepatocytach3. Uznane metody, takie jak hodowla genetycznie modyfikowanych szczepów myszy lub generowanie wektorów wirusowych do infekcji hepatocytami, są albo czasochłonne, budzą obawy dotyczące bezpieczeństwa, albo powodują słabą ekspresję transgenu w hepatocytach in vivo4,5. Hydrodynamiczne wstrzykiwanie żył ogonowych (HTVI) jest alternatywną metodą transfekcji in vivo hepatocytów, pozwalającą na łatwe, szybkie i opłacalne badanie funkcji genów w wątrobie. W przypadku HTVI wektor przenoszący pożądaną sekwencję DNA rozpuszcza się w objętości soli fizjologicznej odpowiadającej 10% masy ciała wstrzykniętego zwierzęcia. Roztwór jest następnie wstrzykiwany do żyły ogonowej w ciągu 5-10 s6. Przekraczając pojemność minutową serca, sól fizjologiczna przepływa z żyły głównej dolnej do żył wątrobowych, prowadząc do rozszerzenia wątroby i hydrodynamicznej transfekcji hepatocytów7. Aby osiągnąć stabilną integrację genomową, metoda ta została połączona z wektorami opartymi na transpozonach, takimi jak system transpozonów śpiącej królewny. System ten pośredniczy w rekombinacji wektorów docelowych z miejscami rekombinacji genomowej katalizowanymi przez transpozazę śpiącej królewny8,9. W przypadku modeli zwłóknienia wątroby lub kancerogenezy często pożądane jest nadekspresja lub wyciszenie genów w określonych punktach czasowych modelu choroby. W tym celu można użyć narzędzi do indukowalnej ekspresji genów, takich jak system Cre/LoxP lub system ekspresji genów indukowany tetracykliną (Tet-On)10.
Tutaj opisujemy protokół transfekcji in vivo mysich hepatocytów za pomocą HTVI systemu opartego na transpozonach śpiącej królewny. Oprócz protokołu stabilnej, konstytutywnej ekspresji transgenu pod kontrolą promotora specyficznego dla wątroby, opisujemy bardziej zaawansowany system wektorowy, który łączy konstytutywną ekspresję rekombinazy Cre zależnej od tamoksyfenu (CreER) z indukowalną ekspresją shRNA przystosowanego do transgenu lub mikroRNA (miR-shRNA), zwanego pTC TET-system11. W tym systemie wektorów indukowalne transgeny lub miR-shRNA do ekspresji zależnej od tetracykliny są klonowane do wektora szkieletowego za pomocą rekombinacyjnego systemu klonowania, co pozwala na szybkie i łatwe generowanie nowych wektorów12. Ten przewodnik oparty na wideo obejmuje przygotowanie odpowiednich wektorów, wstrzykiwanie i leczenie myszy w celu uzyskania indukowalnej ekspresji transgenu / miR-shRNA, a na koniec przygotowanie tkanki wątroby do analizy. Metoda opisana w tym protokole została zaprojektowana, aby umożliwić połączenie dowolnego systemu mysiego, w którym pośredniczy Cre/loxP, z ekspresją lub knock-downem dowolnego genu, co czyni go systemem szeroko stosowanym w badaniach nad chorobami wątroby.

<table><tbody><tr><td>Materiał ogólny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Drabinka DNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>#SM1331</td><td>Drabinka DNA do elektroforezy</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>zatapianie kriosekcji</td></tr><tr><td>Biozym LE Agaroza</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-sacharoza</td><td>Carl Roth</td><td>4621.1</td><td>Do słodzenia roztworu doksycyliny</td></tr><tr><td>Sól sodowa ampicyliny</td><td>AppliChem</td><td>A0839,0010</td><td>Do wyboru klonów</td></tr> <tr>odpornych na Amp<td>LB Agar (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X969.1</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion (Luria/Miller)</td><td>Carl Roth</td><td>X968.1</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. Medium</td><td>Thermo Fischer</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny</td><td>AppliChem</td><td>A1492,0001</td><td>Do wyboru klonów odpornych na gentamycynę</td></tr><tr><td>Roti-Histofix 4 %</td><td>Fa. Roth</td><td>P087.6</td><td>roztwór para-formaldehydu</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaza</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>GatewayTM LR ClonaseTM II Enzyme Mix</td><td>invitrogen/ThermoFisher</td><td>11791-020</td><td>zawiera LR-klonazę enzymatyczną mieszaninę II i proteinazę K</td></tr><tr><td>DB3.1 Competent Cells</td><td>Thermo Fisher</td><td>11782-018</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 Chemicznie kompetentny E. coli</td><td>Thermo Fisher</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>FseI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0588S</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0156S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>BfuAI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0701S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Do ekstrakcji DNA z</td></tr><tr><td>żelu NucleoSpin Gel i PCR Clean Up</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740609.10</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond PC20</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740571</td><td>Ekstrakcja plazmidu (Mini prep)</td></tr><tr><td>NucleoBond PC500</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740574</td><td>Ekstrakcja plazmidowa (Maxi prep)</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiały do eksperymentów na myszach</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injekt Strzykawka F 1 ml</td><td>Braun</td><td>9166017V</td><td>Do wstrzykiwań dootrzewnowych</td></tr><tr><td>Omnifix Luer 3 ml</td><td>Braun</td><td>4616025V</td><td>Do wstrzykiwań dożylnych</td></tr><tr><td>Kaniula Sterican 24G Kratykanka</td><td>Braun</td><td>4657675</td><td></td></tr><tr><td>Sterican Cannula 27G</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td>Do aktywacji CreER</td></tr><tr><td>Olej kukurydziany</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8267-500ML</td><td>Nośnik do wstrzykiwań tamoksyfenu</td></tr><tr><td>Hykulan doksycykliny</td><td>AppliChem</td><td>A2951,0025</td><td>Aktywacja ekspresji zależnej od tetracykliny</td></tr><tr><td>Injekt 10 ml Strzykawka</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S 0.2</td><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td>Do filtracji doksycykliny</td></tr><tr><td>NaCl 0,9%</td><td>Braun</td><td>3200905</td><td>Nośnik do wstrzykiwań dożylnych</td></tr><tr><td>Rurka stożkowa Falcon 50ml</td><td>Corning Life Science</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Lampa na podczerwień</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Do ogrzewania ogona myszy</td></tr><tr><td>IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>System obrazowania in vivo</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Plazmidy do klonowania wektorów transpozonów śpiącej królewny dla HTVI.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pTC</td><td></td><td>n/a</td><td>Wektor do konstytutywnej ekspresji genów, ref. 15</td></tr><tr><td>pEN_TTmcs</td><td></td><td>Addgene #25755</td><td>Wektor wejściowy do indukowalnej ekspresji genów, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTGmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25753</td><td>Wektor wejściowy do indukowalnej ekspresji miR-shRNA z koekspresją GFP, ref. 19</td></tr><tr><td>pEN_TTmiRc2</td><td></td><td>Addgene #25752</td><td>Wektor wejściowy do indukowalnej ekspresji miR-shRNA bez koekspresji GFP, ref. 19</td></tr><tr><td>pTC ApoE-Tet</td><td></td><td>Addgene #85578</td><td>Wektor ekspresyjny do indukowalnej ekspresji genu lub miR-shRNA z promotorem ApoE.HCR.hAAT, ref. 11</td></tr><tr><td>pTC-CMV-Tet</td><td></td><td>Addgene #85577</td><td>Wektor ekspresyjny do indukowalnej ekspresji genu lub miR-shRNA z promotorem CMV, ref. 11</td></tr></tbody></table>

konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

W modelach badawczych raka wątroby, regeneracji, stanów zapalnych i zwłóknień, elastyczne systemy do ekspresji genów in vivo i wyciszania są bardzo przydatne. Hydrodynamiczne wstrzykiwanie do żyły ogonowej konstruktów opartych na transpozonach jest skuteczną metodą manipulacji genetycznej hepatocytów u dorosłych myszy. Oprócz konstytutywnej ekspresji transgenu, system ten może być wykorzystywany do bardziej zaawansowanych zastosowań, takich jak knock-down genów za pośrednictwem shRNA, implikacja systemu CRISPR/Cas9 do indukowania mutacji genów lub systemy indukowalne. W tym przypadku jako przykład tej techniki przedstawiono połączenie konstytutywnej ekspresji CreER wraz z indukowalną ekspresją wybranego transgenu lub miR-shRNA. Zajmujemy się wieloetapową procedurą, począwszy od przygotowania konstruktów transpozonu śpiącej królewny, poprzez wstrzyknięcie i leczenie myszy, aż po przygotowanie tkanki wątroby do analizy za pomocą barwienia immunologicznego. Prezentowany system jest niezawodnym i skutecznym podejściem do osiągania złożonych manipulacji genetycznych w hepatocytach. Jest szczególnie przydatny w połączeniu ze szczepami myszy na bazie Cre / loxP i może być stosowany do różnych modeli w badaniach nad chorobami wątroby.

Wydajność transfekcji metodą hydrodynamicznej iniekcji do żyły ogonowej: Procent hepatocytów mysich poddanych transfekcji hydrodynamicznej podczas pojedynczej iniekcji jest zmienny i zależy od wielu parametrów, takich jak objętość iniekcji, czas iniekcji, ilość wstrzykniętego DNA oraz wielkość wprowadzonego konstruktu6,2,23. Ponadto wydajność transfekcji jest zazwyczaj niższa u w...

Hydrodynamiczne wstrzykiwanie wektorów integracji opartych na transpozonach do żyły ogonowej umożliwia stabilną transfekcję mysich hepatocytów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół dla systemów transfekcji, który umożliwia długotrwałą konstytutywną ekspresję pojedynczego transgenu lub połączoną konstytutywną i indukowaną doksycykliną ekspresję transgenu lub miR-shRNA w wątrobie.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Ogólnym celem tej metody jest stabilna transfekcja hepatocytów in vivo, z konstruktami wektorowymi do indukowalnej ekspresji genów lub shRNA. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad wątrobą. Na przykład, może być stosowany do badania mechanizmów raka wątroby i regeneracji.Główną zaletą tej techniki jest połączona ekspresja CreER wraz z indukowalną ekspresją transgenu R shRNA w hepatocytach myszy in vivo, osiągniętą przez hydrodynamiczne wstrzyknięcie żyły ogonowej. Procedurę zademonstruje Eric Hübner, student medycyny z naszego laboratorium. Zacznij od połączenia 150 nanogramów wektora wejściowego zawierającego krótki RNA spinki do włosów dla docelowego białka ze 150 nanogramami wektora pTC Tet i buforu TE do całkowitej objętości ośmiu mikrolitrów.Następnie przenieś mieszaninę enzymów klonazy LR II do lodu i inkubuj przez dwie minuty. Wirować dwa razy podczas inkubacji. Następnie dodaj do reakcji dwa mikrolitry mieszanki enzymów klonazy LR II i inkubuj w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez godzinę.Po inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając jeden mikrolitr roztworu proteinazy K. Następnie inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dziesięć minut. Następnie przekształć bakterie kompetentne Stbl3 za pomocą dwóch mikrolitrów mieszanki klonującej przy użyciu standardowego protokołu szoku cieplnego.Po posianiu przemiany na płytkach agarowych zawierających ampicylinę, inkubować w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia zbierz pojedyncze kolonie i zaszczep małe ilości pożywki bakteryjnej do inkubacji przez noc. Po wyizolowaniu DNA i potwierdzeniu integralności wektora za pomocą sekwencjonowania Sangera, przygotuj maksimum DNA konstruktu do wstrzyknięcia.Zacznij od zważenia myszy. Następnie przygotuj sterylny roztwór soli fizjologicznej zawierający 15 mikrogramów na mililitr bezendotoksynowego konstruktu wektorowego Śpiąca Królewna i jeden mikrogram na mililitr wolnego od endotoksyn pchsB5. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby wstrzyknąć każdej myszy objętość równą 10% jej masy ciała.Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 3 mililitrów wymaganą objętością dla jednej myszy i przymocuj igłę o rozmiarze 27. Po dodaniu odpowiedniej ilości bibuły, aby pozostawić minimalną przestrzeń do ruchu, ale wystarczająco dużo miejsca do oddychania, włóż mysz do odpowiedniego ogranicznika z otworami do oddychania. Ogrzej ogon za pomocą lampy na podczerwień przez 30 do 60 sekund, uważnie obserwując oznaki przegrzania, takie jak szybki ruch ogona lub inne oznaki pobudzenia.Następnie wyczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem. Wbić igłę prawie poziomo do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych w pobliżu podstawy ogona. W przypadku pomyślnego umieszczenia, niewielka ilość krwi może spłynąć z powrotem do stożka igły.Wstrzyknąć całkowitą objętość do żyły ogonowej w ciągu ośmiu do dziesięciu sekund. Po wstrzyknięciu należy natychmiast wyjąć mysz z ogranicznika. Uciskać ranę po wstrzyknięciu sterylną gazą przez co najmniej 30 sekund lub do momentu ustąpienia krwawienia.Udane hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej ma kluczowe znaczenie dla transfekcji, a zwłaszcza zależy od prędkości, objętości i czasu iniekcji. Aby ułatwić wstrzyknięcie dożylne, upewnij się, że myszy nie są zestresowane ani odwodnione w dniu wstrzyknięcia. Po 30 do 60 minutach samodzielnego trzymania w klatce odzyskiwania przenieś mysz z powrotem do pierwotnej klatki.Indukcję rekombinazy Cre należy rozpocząć 10 do 15 dni po wstrzyknięciu żyły ogonowej, aby umożliwić usunięcie niezintegrowanych wektorów. Rozpuścić dziesięć miligramów tamoksyfenu w 40 mikrolitrach etanolu i inkubować w temperaturze 55 stopni Celsjusza przez dziesięć minut z wytrząsaniem. Wirować kilka razy, aż tamoksyfen się rozpuści.Następnie dodaj 960 mikrolitrów oleju kukurydzianego i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Po schłodzeniu wciągnąć roztwór do 1-mililitrowej strzykawki insulinowej z igłą o rozmiarze 20. Następnie zmień na igłę o rozmiarze 27.Aby wstrzyknąć, najpierw potrząśnij myszą, ostrożnie chwytając szyję myszy kciukiem i drugim palcem, mocując ogon między podstawą dłoni a czwartym i piątym palcem. Następnie dootrzewnowo wstrzyknąć 0,1 mililitra roztworu w lewy dolny kwadrant brzucha. W przypadku eksperymentów trwających krócej niż dziesięć dni, należy stale podawać doksycyklinę w wodzie pitnej, stosując następujący protokół.Najpierw rozpuść pięć gramów sacharozy w 100 mililitrach wody z kranu i autoklawie. Następnie rozpuść 100 miligramów hykulanu doksycykliny w pięciu mililitrach roztworu sacharozy w 15-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie użyj 10-mililitrowej strzykawki, aby sterylnie przefiltrować roztwór przez filtr 0,2 mikrona.Następnie dodaj przefiltrowany roztwór doksycykliny do pozostałych 95 mililitrów roztworu sacharozy i podawaj roztwór myszy zamiast wody pitnej. Sprawdzaj codziennie i wymieniaj natychmiast, jeśli roztwór stanie się mętny, ponieważ oznacza to przerost bakterii. Przygotuj 1-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 27 z jednym mililitrem 4% roztworu paraformaldehydu.Użyj nożyczek preparacyjnych i kleszczy anatomicznych, aby wykonać laparotomię środkową i odsłonić wątrobę poddanej eutanazji myszy. Przesuń jelito cienkie w prawo, aby odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną. Wprowadzić igłę przygotowanej strzykawki do żyły głównej dolnej i przeciąć żyłę wrotną.Wstrzyknij powoli jeden mililitr PFA, aby obficie obficie tkankę wątroby i usunąć autofluorescencyjne czerwone krwinki. Po usunięciu wątroby opłucz ją w wodzie i przenieś do pięciu do dziesięciu mililitrów 4% roztworu PFA do postfix przed cięciem. Wstrzyknięcie konstruktu transpozonu, który łączy konstytutywną ekspresję indukowalnej rekombinazy Cre z indukowalną ekspresją wybranego transgenu lub shRNA do myszy reporterowych Cre wykazało silną ekspresję genu reporterowego GFP po aktywacji rekombinazy Cre przez tamoksyfen.Po leczeniu doksycykliną indukowaną ekspresję transgenu można uwidocznić za pomocą odpowiednich przeciwciał w transfekowanych hepatocytach. W przypadku indukowalnej ekspresji shRNA, cytoplazmatyczna ekspresja GFP wykryta przez barwienie immunologiczne może być wykorzystana jako zastępczy marker ekspresji shRNA. Wstrzyknięto konstrukt transpozonu zawierający kasetę ekspresji lucyferazy pod kontrolą konstruktu promotora specyficznego dla wątroby.Po wstrzyknięciu lucyferyny myszy obrazowano za pomocą systemu obrazowania in vivo dwa tygodnie po hydrodynamicznym wstrzyknięciu żyły ogonowej. Obrazowanie wykazało solidną i stabilną bioluminescencję lucyferazy w wątrobie 15 dni po wstrzyknięciu, co pokazuje, że system może być z powodzeniem stosowany do śledzenia obecności transfekowanych komórek in vivo za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Po opanowaniu, hydrodynamiczne iniekcje do żyły ogonowej można wykonać w około 15 minut, podczas gdy cała procedura od klonowania naszego wstrzyknięcia myszom, indukcji ekspresji transgenu R shRNA do przygotowania wątroby zajmie około trzech do czterech tygodni.Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wielkości i integralności sekwencji plazmidów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zastosować system pTC Tet z wybranym transgenem R shRNA do dowolnego modelu myszy Crelux Pbase.

constitutive-inducible-systems-for-genetic-vivo-modification-mouse

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film opisuje procedurę nokautu genu docelowego za pomocą systemu rekombinazy Cre indukowanego tamoksyfenem po dootrzewnowym wstrzyknięciu tamoksyfenu w modelu mysim.

Inaktywacja genu docelowego oparta na systemie CreER-LoxP: indukowany tamoksyfenem system rekombinazy Cre do docelowego nokautu genu w modelu mysim

Ten film demonstruje system ekspresji genów tetracykliny lub Tet-On w modelu mysim. W obecności doksycykliny, pochodnej tetracykliny, system Tet-On składający się z białka transaktywatora kontrolowanego przez odwróconą tetracyklinę ulega aktywacji i ulega ekspresji interesującego genu.

Indukowalna regulacyjna ekspresja genów oparta na systemie Tet-On in vivo: indukowany tetracykliną system ekspresji genów do aktywacji transkrypcji genu docelowego w modelu mysim

Ten film opisuje technikę genetycznej transfekcji in vivo mysich hepatocytów poprzez hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej. Ten system transfekcji generuje długotrwałą ekspresję transgenu w hepatocytach.

Hydrodynamiczne dostarczanie genów: technika transfekcji in vivo egzogennego DNA w mysich hepatocytach poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej

Transfekcja in vivo nagiego DNA poprzez hydrodynamiczne dostarczanie genów wprowadza geny do tkanki zwierzęcia z minimalną reakcją zapalną. Generowane są wystarczające ilości produktu genowego, aby można było analizować funkcję i regulację genów, a także strukturę i funkcję białek.

Przejściowa ekspresja białek przez hydrodynamiczne dostarczanie genów u myszy

Tutaj prezentujemy nowy humanizowany model wątroby myszy wygenerowany u myszy z nokautem komórkowym za pośrednictwem receptora alb-toksyny (TRECK)/SCID po przeszczepie niedojrzałych i zdolnych do rozbudowy ludzkich komórek macierzystych wątroby.

Generowanie humanizowanej wątroby myszy przy użyciu ludzkich komórek macierzystych wątroby

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Tutaj prezentujemy protokół manipulacji genami specyficznymi dla serca u myszy. W znieczuleniu serca myszy zostały uzewnętrznione przez czwartą przestrzeń międzyżebrową. Następnie adenowirusy kodujące określone geny wstrzyknięto za pomocą strzykawki do mięśnia sercowego, a następnie dokonano pomiaru ekspresji białka za pomocą obrazowania in vivo i analizy Western blot.

Prosta i skuteczna metoda manipulacji genami in vivo specyficznymi dla serca poprzez wstrzyknięcie do mięśnia sercowego u myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ludzkiego chimerycznego mysiego modelu hipercholesterolemii rodzinnej wątroby przy użyciu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych hepatocytów. Jest to cenny model do testowania nowych terapii hipercholesterolemii.

Rodzinny model myszy chimerycznej wątroby hipercholesterolemii przy użyciu indukowanych pluripotencjalnych hepatocytów pochodzących z komórek macierzystych

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Ten protokół opisuje techniki izolowania pierwotnych mysich hepatocytów z wątroby i elektroportowania CRISPR-Cas9 jako rybonukleoprotein i mRNA w celu zakłócenia terapeutycznego genu docelowego związanego z dziedziczną chorobą metaboliczną wątroby. Opisane metody skutkują wysoką żywotnością i wysokim poziomem modyfikacji genów po elektroporacji.

Dostarczanie rybonukleoprotein Cas9 i mRNA za pośrednictwem elektroporacji do świeżo izolowanych pierwotnych hepatocytów myszy

Ten protokół opisuje mikroiniekcję i elektroporację in vivo dla regionalnie ograniczonej edycji genomu za pośrednictwem CRISPR w jajowodzie myszy.

Somatyczne modele myszy z inżynierią genomu przy użyciu mikroiniekcji in vivo i elektroporacji

Poznaj metodę stabilnej transfekcji hepatocytów mysich in vivo przy użyciu hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej. Technika umożliwia indukowalną ekspresję transgenów i shRNA, co wspiera badania nad rakiem wątroby i regeneracją.

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej (Wideo) | JoVE Journal

Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji in vivo mysich hepatocytów za pomocą hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

Przeglądaj więcej filmów