Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego
8 grudnia 2017
Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.
Ogólnym celem tego protokołu hodowli komórek 3D jest modelowanie blizny glejowej ośrodkowego układu nerwowego przy użyciu kluczowych komórek wskaźnikowych: mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia nerwów, takie jak potencjał komórek glejowych do wzmacniania strategii regeneracyjnych i usuwania blizny glejowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że biologię glejową można szybko scharakteryzować w mikrośrodowisku 3D za pomocą systematycznych i wysokonakładowych manipulacji. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe do wysiewu, zacznij od dodania jednego mililitra metakrylanu 3-propylu do 49 mililitrów wody destylowanej, aby uzyskać 2% roztwór. Następnie umieść 18-milimetrową szklaną pokrywę w roztworze i kołysz przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie spłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno w trzech zlewkach po 100 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe w próżni za pomocą eksykatora i piekarnika w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyj kleszczy, aby szybko zanurzyć poszczególne szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu. Następnie, bez suszenia, wrzuć każde szkiełko nakrywkowe do dołka z 12-dołkową płytką. Następnie umyj każdą studzienkę jednym mililitrem sterylnej wody dejonizowanej. Następnie dodaj jeden mililitr sterylnego poli
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół trójwymiarowej (3D) hodowli komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Szczegółowo opisano procesy pierwotnej hodowli komórkowej, syntezy hydrożelu oraz techniki obrazowania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Trójwymiarowe (3D) systemy hodowli komórkowej są niezbędne do badania komórek glejowych.
- Komórki glejowe pochodzące z mózgu szczura odgrywają kluczową rolę w neurobiologii.
- Hydrożele zapewniają wspierające środowisko dla wzrostu komórek.
- Techniki obrazowania są niezbędne do analizy morfologii komórek.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu hodowli komórek glejowych w 3D.
- Pogłębienie zrozumienia oddziaływań między komórkami glejowymi.
- Umożliwienie zaawansowanego obrazowania hodowlanych komórek.
Zastosowane metody
- Pierwotna hodowla komórkowa gleju pochodzącego z mózgu szczura.
- Synteza hydrożelu z metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA).
- Fotopolimeryzacja HAMA w celu enkapsulacji komórek.
- Przygotowanie próbek do mikroskopii konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Pomyślna enkapsulacja komórek glejowych w hydrożelu HAMA.
- Wykazanie żywotności i funkcjonalności hodowanych komórek.
- Uzyskanie wysokiej jakości obrazowania morfologii komórek.
- Protokół stanowi podstawę dla przyszłych badań nad komórkami glejowymi.
Wnioski
- Opracowany protokół jest skuteczny w 3D hodowli komórek glejowych.
- Metoda ta może być zastosowana w różnych obszarach badań nad układem nerwowym.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym schemacie w celu prowadzenia zaawansowanych analiz.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modelowanie procesów neurozapalnych w fizjologicznie istotnym środowisku 3D umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku terapii ukierunkowanych na glej. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez odtworzenie procesu tworzenia się blizny glejowej, która jest kluczową cechą patologiczną w uszkodzeniach OUN i neurodegeneracji. Metoda ta ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrywania do oceny przedklinicznej, zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby do przesiewania związków immunomodulujących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie interakcji komórek glejowych w mikrośrodowisku 3D w celu wyjaśnienia mechanizmów patogennych neuroinflamacji.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów jako celów terapeutycznych w schorzeniach ośrodkowego układu nerwowego.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wyboru celu poprzez modelowanie tworzenia się blizny glejowej, będącej kluczowym czynnikiem cytotoksyczności i upośledzonej regeneracji.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowaną, powtarzalną platformę do przygotowywania hydrożeli z komórkami glejowymi do przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi glejowych za pomocą obrazowania konfokalnego i SEM, co wspiera przygotowanie testów.
- Skalowalność: Kompatybilna z manipulacjami wysokoprzepustowymi i modyfikacją podłoży bioaktywnych w celu optymalizacji testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkrywania z badaniami przedklinicznymi poprzez modelowanie istotnego dla choroby procesu tworzenia blizny glejowej.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę wpływu związków na aktywację gleju i dojrzewanie blizny, co pozwala na dostosowanie postępów badań do poziomu ryzyka.
- Zgodność z biomarkerami: Wspiera ocenę morfologii i reaktywności gleju jako translacyjnych biomarkerów odpowiedzi neurozapalnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje kontinuum procesów odkrywania leków – od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – dostarczając trójwymiarowego systemu hodowli glejowej, który modeluje patologię neurozapalną.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących zapośredniczonych przez glej szlaków zapalnych oraz komunikacji międzykomórkowej w środowisku biomimetycznym.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów i uzyskanie ilościowych odczytów w celu oceny efektów immunomodulujących w odniesieniu do fenotypu i funkcji gleju.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze obrazy z mikroskopii konfokalnej i SEM do ilościowej oceny morfologii, rozmieszczenia oraz stanów aktywacji komórek.
- Badania translacyjne: Łączy wczesną modulację celów glejowych z wynikami przedklinicznymi poprzez replikację kluczowego procesu patologicznego w urazach i chorobach OUN.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę hydrożelową dla modeli przewlekłego i ostrego zapalenia układu nerwowego w ramach projektów badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności prognostycznej w walidacji celów terapeutycznych dzięki mechanisticznemu wglądowi w proces tworzenia blizny glejowej oraz kaskady neurozapalne.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność 3D kultur glejowych w celu zapewnienia spójności eksperymentów prowadzonych przez różne zespoły.
- Wartość strategiczna: Usprawnienie decyzji typu go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności biologicznej w zakresie oddziaływania na cele glejowe i modulacji szlaków sygnałowych.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja terapii OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o skuteczność w modulowaniu odpowiedzi glejowej w systemie odpowiadającym modelowi choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu izolacji pierwotnych komórek glejowych, syntezy hydrożeli oraz technik hodowli 3D.
- Wykorzystywana aparatura obejmuje systemy fotopolimeryzacji UV, mikroskopy konfokalne oraz skaningowe mikroskopy elektronowe do charakteryzacji.
- Standaryzacja pomiędzy zespołami wymaga spójności w składzie hydrożeli, gęstości wysiewu komórek oraz protokołach obrazowania.
- Adaptacja do innych źródeł komórek glejowych lub modeli chorobowych może wymagać optymalizacji sztywności hydrożelu i powłoki bioaktywnej.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność wydajności pierwotnych komórek oraz konieczność stosowania technik aseptycznych podczas etapów enkapsulacji i polimeryzacji.
