Name: Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Poznaj protokół 3D hodowli pierwotnych komórek glejowych szczura w hydrożelu HAMA do modelowania zapalenia układu nerwowego. Ta metoda umożliwia badanie interakcji komórkowych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są wdzięczni za wsparcie finansowe od NSERC, CFI, AIHS, Alberta Health Services i Davey Endowment for Brain Research.

Protokół pobierania tkanki mózgowej od pierwszego dnia u szczeniąt szczurów Sprague Dawley, które zostały poddane eutanazji przez dekapitację, został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania na Uniwersytecie Alberty.
1. Izolacja mikrogleju i astrocytów67,68
UWAGA: Wszystkie podłoża do izolacji i hodowli komórkowej są wstępnie podgrzewane do 37 °C w łaźni wodnej. Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) zawiera 1% penicyliny-streptomycyny (PS). Wszystkie zmodyfikowane podłoża Eagle's firmy Dulbecco z mieszanką składników odżywczych F12 Hama (DMEM/F12) są uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (PS). Tylko mieszanki z trypsyną nie mają FBS. Wszystkie materiały w tym protokole są sterylne (filtr, alkohol, zakupione i autoklawowane), a każdy krok następujący po kroku 1.8 jest wykonywany w komorze bezpieczeństwa biologicznego z zachowaniem techniki aseptycznej.
<ol>
	<li>Na mózg podgrzej wstępnie 15 ml HBSS i 12,5 ml DMEM/F12 do 37 °C w stożkowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i około 2 ml 0,25% trypsyny z 1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Podgrzej dodatkowe 25 ml DMEM/F12. Podgrzej trypsynę około 10 minut przed użyciem, aby zapobiec utracie aktywności enzymatycznej.</li>
	<li>Wlej wystarczająco dużo ciepłego HBSS do sterylnych naczyń hodowlanych o średnicy 6 i 10 cm, aby pokryć powierzchnię. Przygotuj jedno naczynie o średnicy 10 cm na każde dwa mózgi oraz dodatkowe naczynie o średnicy 6 cm.</li>
	<li>Umieść do 2 mózgów w każdym naczyniu o długości10 cm2 (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym użyj zakrzywionych i prostych kleszczy, aby oddzielić korę wzdłuż linii środkowej i móżdżek od pnia mózgu. W ten sposób otrzymujemy trzy sekcje tkanki na mózg (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Oderwij cienką, półprzezroczystą warstwę (opony mózgowe) tkanki zawierającej naczynia krwionośne z każdego odcinka tkanki i wyrzuć, przenosząc pozostałą tkankę do oddzielnego naczynia hodowlanego. Chwyć kleszczem cienkie warstwy odsłonięte przez nacięcia tkanek i ostrożnie pociągnij, aż główne części będą "zwisać" z tkanki mózgowej. Na koniec usuń tę porcję, delikatnie szarpiąc. Zobacz Rysunek 2C-2E dla reprezentatywnych obrazów przed, w trakcie i po tym kroku.</li>
	<li>W komorze bezpieczeństwa biologicznego usuń pozostały HBSS z naczynia hodowlanego, ostrożnie zachowując tkankę. Tkankę należy zmacerować skalpelem i przenieść tkankę do wstępnie podgrzanej probówki o pojemności 15 ml z trypsyną.</li>
	<li>Inkubować tę probówkę przez 25 minut w kąpieli o temperaturze 37 °C w celu enzymatycznego trawienia tkanki.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wylać supernatant.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml dodaj 10 ml ciepłego DMEM/F12 w celu dezaktywacji trypsyny i rozcieraj roztwór 5 razy, aby rozbić tkankę.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 500 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i wylać supernatant.</li>
	<li>Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml zawiesić osad w 10 ml ciepłego DMEM/F12 i przenieść roztwór do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18 rozcierać roztwór 3 razy.</li>
	<li>Rozprowadź ten roztwór w porcjach po 12,5 ml ciepłego DMEM/F12 na mózg.</li>
	<li>Odpipetować porcje 1 ml roztartego roztworu do płytki 12-dołkowej (1 na mózg).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2w wilgotnym inkubatorze do hodowli komórkowych. Wymień nośnik po trzech dniach i odświeżaj nośnik co kolejne trzy dni. Po 2 tygodniach komórki można pobrać do eksperymentów.</li>
</ol>
2. Synteza makromerów69
<ol>
	<li>Odważyć 375 mg soli kwasu hialuronowego (HA) w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać 37,5 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Przepłukać roztwór wirownikiem przez 1 minutę i poddać mieszaninę sonikacji, aż stanie się jednorodna i straci swoją żelową lepkość. Ten proces może potrwać 6 godzin.</li>
	<li>Przenieść roztwór do zlewki o pojemności 100 ml z magnetycznym prętem mieszającym (38 mm) i energicznie wymieszać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie miareczkować 5,0 M NaOH do mieszalnego HA i mierzyć za pomocą bibuły do pH, aż pH ustabilizuje się między 8 a 12.</li>
	<li>Zebrać 3 ml świeżego bezwodnika metakrylowego (MA, 94%), pokrytego azotem podczas przechowywania. 
	UWAGA: MA jest wystawiona na działanie atmosfery przez długi czas (dni), straci swoją reaktywność. 
	Uwaga: Całe użycie MA powinno odbywać się pod wyciągiem.</li>
	<li>Dodać 200 μl MA do roztworu kwasu hialuronowego do mieszania. Reakcja obniża pH roztworu poniżej 8.</li>
	<li>Powtarzać kroki od 2.4 do 2.6, aż 3 ml MA zostaną dodane do roztworu. Proces ten może potrwać do 1-2 godzin.</li>
	<li>Pozostawić reakcję na noc w temperaturze 4 °C, bez mieszania.</li>
	<li>Przenieść roztwór do 400 ml zimnego etanolu (EtOH) w zlewce o pojemności 500 ml i pozostawić na wytrącanie przez 24 - 72 godziny w temperaturze 4 °C.56</li>
	<li>Ostrożnie zdekantować większą część roztworu do oddzielnej zlewki w celu usunięcia i zebrać osad do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W razie potrzeby można go rozprowadzić w 2-4 probówkach.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 200 x g w wirówce przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant.</li>
	<li>Uzupełnić probówkę zimnym EtOH, mieszać roztwór z wirownikiem przez 1 minutę i powtórzyć krok 2.10-2.11.</li>
	<li>Dodać 25 ml sterylnej wody dejonizowanej, mieszać roztwór z wirownikiem przez 1 minutę, dokonywać sonikacji (>20 kHz) przez 1 godzinę i inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umieścić roztwór w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 15 minut lub do momentu zamrożenia lub błyskawicznego zamrożenia w ciekłym azocie. 
	UWAGA: Podczas używania ciekłego azotu należy używać rękawic ochronnych, osłony twarzy i fartucha.</li>
	<li>Liofilizować probówkę (poniżej 0,1 mBar i -30 °C) przez 24 - 48 godzin, aż do wytworzenia proszku przypominającego śnieg.</li>
	<li>W tym momencie należy zbadać próbkę pod kątem czystości za pomocą 1H magnetycznego rezonansu jądrowego, w którym można potwierdzić ilość protonów metakrylanu (szczyty przy 6,1 i 5,6 ppm) w stosunku do protonów metylu (1,9 ppm) w szkielecie HA. Dopuszczalny jest minimalny stosunek 95% metakrylanu do protonów metylu. 69</li>
</ol>
3. Tworzenie żelu i enkapsulacja 3D65
<ol>
	<li>Przygotowanie szkiełka nakrywkowego i formy
	<ol>
		<li>Przygotować 50 ml roztworu wody destylowanej 2% metakrylanu 3-(trimetoksysililo)propylu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Umieścić szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm w roztworze i kołysać przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jednorazowo można dodać do 50 szkiełek nakrywkowych.</li>
		<li>Spłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno w 3 zlewkach ze 100 ml wody dejonizowanej.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe wysuszyć przez noc w próżni w temperaturze 40 °C za pomocą eksykatora i piekarnika.</li>
		<li>Szybko zanurz poszczególne szkiełka nakrywkowe w 70% EtOH za pomocą kleszczy.</li>
		<li>Bez suszenia wrzuć każde szkiełko nakrywkowe do dołka z 12-dołkową płytką.</li>
		<li>Umyj i odessaj każdą studzienkę sterylną wodą dejonizowaną (1 ml na studzienkę).</li>
		<li>Dodać 1 ml sterylnej poli-L-lizyny (PLL) 2 μg / ml (PLL) do każdego dołka i inkubować przez >2 godziny.</li>
		<li>Odessać roztwór PLL i pozostawić szkiełka nakrywkowe do wyschnięcia na powietrzu.</li>
		<li>Zanurz formy polidimetylosiloksanu (PDMS) (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 1) w 70% EtOH i umieść jedną na środku każdego szkiełka nakrywkowego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu i stwórz uszczelnienie między formą a szkłem.
		<ol>
			<li>Przygotuj formy PDMS, odlewając odczynniki premiksowe PDMS w stosunku 10:1 w naczyniu z polistyrenu o płaskim dnie. Ilość przygotowanego PDMS dobiera się w taki sposób, aby uzyskać arkusz o grubości około 1 mm. Aby uformować studzienki w PDMS, wytnij arkusze okrągłym dziurkaczem o średnicy wewnętrznej 10.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie komórek 
	UWAGA: Wszystkie kroki w protokole są wykonywane techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) dostosowuje się do pH 7,4 dla wszystkich etapów.
	<ol>
		<li>24 godziny przed enkapsulacją komórek w HAMA, odświeżyć pożywkę dla 2-tygodniowych kultur podstawowych (od kroku 1.15) na płytkach 12-dołkowych. Dodaj 1 ml pożywki DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) na dołek.</li>
		<li>Na każdą 12-dołkową płytkę komórek przygotować 12,5 ml rozcieńczonej trypsyny (0,25% trypsyny-EDTA rozcieńczonej 30% pożywką DMEM/F12) i 25 ml DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) i ogrzać w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Zebrać kondycjonowaną pożywkę z płytek za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml (> 0,5 ml na dołek), dokładnie odessać pozostały płyn i zastąpić 1 ml na dołek rozcieńczonej trypsyny (0,075% trypsyny-EDTA) przez 20-30 minut w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ), aż warstwa komórek zlewająca się oderwie się od płytki.</li>
		<li>Odzyskaj zawieszony materiał komórkowy za pomocą pipety o pojemności 1 ml (wygląda jak pojedynczy pływający element) i zbierz w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Rozcieńczyć równoważną objętością DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS) i odwirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, odrzucając supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy w 10 ml ciepłym DMEM/F12 (10% FBS i 1% PS), rozcierać komórki 5 razy za pomocą pipety 10 ml i wirować przy 200 x g przez 2 min.</li>
		<li>Zdekantować supernatant, ponownie zawiesić komórki w 5 ml ciepłego DMEM/F12 i przenieść komórki do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18 należy 3 razy rozcierać roztwór komórek i przefiltrować zawiesinę przez sito komórkowe 40 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej.</li>
		<li>Zbierz 10 μl zawiesiny komórek, rozcieńcz 1:100 w ciepłym DMEM/F12 i policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek</li>
		<li>Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do etapu kapsułkowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hermetyzacja komórek 
	UWAGA: Wszystkie kroki w protokole są wykonywane techniką sterylną w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
	<ol>
		<li>Na każdą 12-dołkową płytkę hydrożeli 3D należy podgrzać 12,5 ml DMEM/F12 i 12,5 ml kondycjonowanej pożywki DMEM/F12 zebranej podczas przygotowywania komórek.</li>
		<li>Zważyć ilość metakrylonowego kwasu hialuronowego (HAMA) wymaganą do uzyskania końcowego stężenia 0,5% wag./obj. Rozpuść tę HAMA w sterylnym, przefiltrowanym PBS w stężeniu (2% wag./obj.); stężenie 4 razy wyższe niż stężenie końcowe jest wykorzystywane do dodania komórek i innych odczynników. Jedna 12-dołkowa płytka hydrożeli wymaga ~350 μl PBS z 7 mg HAMA.</li>
		<li>Sonikować roztwory (>20 kHz) aż do całkowitego rozpuszczenia HAMA przez 60 minut.</li>
		<li>Przygotować indywidualne 10% roztwory zarówno trietanoloaminy (TEA), jak i 1-winylo-2-pirolidynonu (NVP) oraz 1 mM roztwór eozyny Y (EY) w 1 ml podwielokrotności sterylnego PBS o pH 7,4.</li>
		<li>Na jedną 12-dołkową płytkę przygotuj końcową mieszaninę 1,4 ml 1 x10 7 komórek, 0,5% wag./obj. HAMA (350 μl 2% wag./obj.), 0,1% TEA (14 μl 10%), 0,1% NVP (14 μl 10%) i 0,01 mM EY (14 μl 1 mM) i 20% mieszaniny blaszki podstawowej (280 μl bulionu). Pozostały wolumin to PBS.</li>
		<li>Delikatnie wymieszaj roztwór i odpipetuj 100 μl do każdej formy PDMS za pomocą końcówki o pojemności 1 ml.</li>
		<li>Wystaw próbki na działanie zielonego światła LED o wysokiej intensywności (~520 nm, 60 mW, w zamkniętym pudełku o wymiarach 20 cm x 20 cm x 20 cm) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 1 ml na dołek ciepłego kondycjonowanego DMEM/F12 do płytki 12-dołkowej.</li>
		<li>Chwyć każde szkiełko nakrywkowe między kciukiem a palcem wskazującym, powoli oderwij formę PDMS zakrzywioną pęsetą, uważając, aby nie przesunąć żelu, i umieść go w studzience z kondycjonowanym podłożem.</li>
		<li>Dodaj dodatkowy 1 ml ciepłego DMEM/F12 do każdego dołka.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 2 tygodnie, odświeżając pożywkę komórkową co tydzień, pipetując 1 ml pożywki z każdej studzienki i zastępując 1 ml DMEM/F12.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia
<ol>
	<li>Immunocytochemia 
	UWAGA: Do zobrazowania tych próbek użyto odwróconego mikroskopu konfokalnego, a do przetworzenia i wyświetlenia obrazów użyto ImageJ. Mikroglej, astrocyty, oligodendrocyty i jądra zostaną znakowane po 3 tygodniach w hodowli HAMA.
	<ol>
		<li>Rozgrzej 10% formalinę buforowaną PBS (pH 7,0) w kąpieli o temperaturze 37 °C. 
		Uwaga: Chociaż formalina może być używana na zewnątrz dygestorium, materiał ten reaguje z tkanką i należy zawsze obchodzić się z nim ostrożnie i w rękawiczkach. Należy go utylizować oddzielnie.</li>
		<li>Ostrożnie odessać pożywkę z płytek i odpipetować 1 ml 10% formaliny do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% stężeniu CO2 przez 20 minut.</li>
		<li>Odessać płyn z każdej płytki, odpipetować 2 ml PBS (pH 7,4) do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.</li>
		<li>Powtórz krok 4.1.4 dwukrotnie.</li>
		<li>Odessać płyn z płytek, dodać 1 ml na studzienkę PBS z 10% normalną surowicą końską (NHS) i 0,5% trytonem X-100 i delikatnie kołysać z minimalną prędkością) przez 1 godzinę.</li>
		<li>Powtórz krok 4.1.4 trzy razy.</li>
		<li>Odessać ciecz i dodać 1 ml na studzienkę następującej mieszaniny w PBS: królicza zjonizowana cząsteczka adaptera wiążącego wapń (Iba1) 1:1,000, białko fibrylarne gleju kurczaka (GFAP) 1:5,000, mysia 2',3'-cykliczny nucelotyd 3'-fosodiesteraza (CNPaza) 1:1,000, 1% NHS i 0,1% środek powierzchniowo czynny perforujący komórki. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc, kołysząc płytką tak delikatnie, jak to możliwe.</li>
		<li>Powtórzyć krok 4.1.4 trzy razy, przerywając 1 godzinę inkubacji.</li>
		<li>Odessać ciecz i dodać 1 ml na studzienkę następującej mieszaniny w PBS: 647 nm wzbudzone przeciwciało anty-królicze osła 1:200, 546 nm wzbudzone przeciwciało przeciwko kurczakom kozie 1:200, 488 nm wzbudzone przeciwciało przeciwko myszom osła 1:200, 1% NHS, 1:1,000 niebieskie zabarwienie jądrowe. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, delikatnie kołysząc płytką.</li>
		<li>Powtórz krok 4 trzy razy, wykonując 1 godzinę inkubacji pomiędzy nimi.</li>
		<li>Aby zachować hydrożele, należy odessać bufor i zanurzyć je w 0,5 ml pożywki do montażu komórek na 1 minutę. Odpipetować pożywkę montażową i delikatnie nałożyć szkiełko nakrywkowe na żel, tworząc warstwę między szkłem. Dodać niewielką ilość podłoża mocującego na odsłoniętą stronę szkiełek nakrywkowych, aby zapobiec wysychaniu hydrożelu. 
		UWAGA: W celu rozwiązywania problemów żele można zobrazować w kroku 4.1.11. aby zobaczyć prawidłowe oznakowanie przed dalszym przetwarzaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) 
	UWAGA: Aby uwidocznić hydrożel, użyto skaningowego mikroskopu elektronowego do zobrazowania tych próbek.
	<ol>
		<li>Podgrzej wstępnie mieszaninę utrwalającą 2,5% aldehydu glutarowego i 2% paraformaldehydu w PBS (0,1 M) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
		Uwaga: Odczynniki te są wysoce reaktywne z tkankami i należy obchodzić się z nimi ostrożnie i w rękawiczkach. Należy z nimi obchodzić się w miarę możliwości pod wyciągiem i utylizować oddzielnie.</li>
		<li>Odessać pożywkę z płytek do hodowli komórkowych i dodać 1 ml wstępnie podgrzanej mieszaniny utrwalającej.</li>
		<li>Inkubować płytki w temperaturze 37 °C w 5% stężeniu CO2 przez 20 minut.</li>
		<li>Umieść talerze w temperaturze 4 °C (lodówka/chłodziarka) na noc.</li>
		<li>Odessać roztwór utrwalający ze studzienek i dodać 1 ml PBS.</li>
		<li>Odessać płyn z każdej płytki, dodać 2 ml PBS do każdej studzienki i inkubować przez 15 minut.</li>
		<li>Powtórz krok 4.2.6 jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Odessać PBS i dodać 1 ml 1% tetratlenku osmu buforowanego w PBS do każdej studzienki. 
		UWAGA: Dopóki próbki nie zostaną wysuszone, ten etap i wszystkie kolejne etapy są wykonywane w dygestorium.</li>
		<li>Pozwól na utrwalenie przez 30 minut. Opary osmu z cieczy mogą utrwalić inne próbki na tej samej płytce; dlatego przed tym krokiem należy odpowiednio podzielić próbki. 
		UWAGA: Czterotlenek osmu jest wysoce reaktywny z tkankami i lotny. Jest niebezpieczny i należy się z nim obchodzić w dygestorium w rękawiczkach. On i wszelkie natychmiastowe umyte należy wyrzucić oddzielnie.</li>
		<li>Powtórz krok 4.2.6 trzy razy.</li>
		<li>Zassać płyn i dodać mieszaniny odwadniające z poniższej listy, w kolejności, i inkubować (w temperaturze pokojowej) przez wskazany czas. Zacznij od stopniowego dodawania etanolu (EtOH), a następnie heksametylodilazanu (HMDS). Patrz Tabela 2 dla każdego przyrostu. 
		UWAGA: Podczas dodawania HMDS szkiełka nakrywkowe mogą mocno przylegać do plastiku i stać się bardzo trudne do usunięcia. Można temu zapobiec, umieszczając małą plastikową platformę pod szkiełkiem po pierwszym zastosowaniu HMDS. Po drugiej inkubacji EtOH próbkę można wyjąć i schłodzić w ciekłym azocie przez kilka sekund w celu zamrożenia i złamania próbki.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij wysuszone próbki i zamontuj je na króćcach skaningowego mikroskopu elektronowego za pomocą dwustronnej taśmy przewodzącej.</li>
		<li>Napylać próbki minimalną ilością złota. Umieść próbki w uchwycie i uruchom maszynę na 2 minuty przy natężeniu 15 mA.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby osiągnąć cel, jakim jest wygenerowanie systemu hodowli 3D do modelowania bioreaktywności gleju i procesu bliznowacenia gleju, opracowaliśmy system, który może wspierać pierwotne hodowle mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów oraz umożliwia solidną charakterystykę morfologii komórki i interakcji komórka-komórka. Z przedstawionych mikrofotografii wynika, że morfologia każdego typu komórki była wyraźnie różna w przypadku platform mieszanin blaszek 2D, 3D-HAMA i 3D HAMA-Basal. W systemie 2D morfologia była wyraźnie od...

Zapalenie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) od dawna uważane jest za cechę charakterystyczną ostrego (np. udar niedokrwienny, urazowe uszkodzenie mózgu i rdzenia kręgowego) i przewlekłego (np. choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona) uszkodzenia OUN, ale coraz częściej jest uznawane za przyczynę zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych. Utrzymujący się lub nieodpowiedni stan zapalny może powodować uszkodzenie nerwów i demielinizację (np. stwardnienie rozsiane) oraz negatywnie wpływać na rozwój mózgu (np. schizofrenia, autyzm) i stany nastroju (np. depresja, lęk, choroba afektywna dwubiegunowa). Ponadto, nowatorskie strategie terapeutyczne wykorzystujące urządzenia wszczepialne (np. interfejsy mózg-komputer1,2,3, głęboka stymulacja mózgu4,5, mikrostymulacja śródrdzeniowa6,7,8,9, 10) generują przewidywalną reakcję zapalną na styku urządzenia z OUN, co skutkuje reakcją tkanki ochronnej, która może spowodować utratę skuteczności lub awarię urządzenia przez cały okres użytkowania implantu11. Zapalenie w OUN jest zwykle inicjowane przez mikroglej, który funkcjonuje jako rezydujące komórki odpornościowe OUN odpowiedzialne za nadzór tkanek i mobilizację odpowiedzi ciała obcego (reviewed12). W zależności od nasilenia urazu, mikroglej sygnalizuje i rekrutuje dodatkowe typy komórek do miejsca urazu. W szczególności mikroglej aktywuje astrocyty, które z kolei działają jako wtórne komórki zapalne i tworzą gęstą barierę ochronną, która zawiera miejsce uszkodzenia13,14. Mikroglej może również inicjować kaskadę aktywności w komórkach obwodowego układu odpornościowego, co może skutkować rozpadem bariery krew-mózg, aby umożliwić infiltrację immunologiczną (przejrzane w reference15).
W przypadku urządzeń wszczepianych do OUN, uszkodzenie tkanki wynikające z wprowadzenia urządzenia, jak również ciągła obecność obcego urządzenia, może zainicjować proces określany jako bliznowacenie glejowe. W tym procesie mikroglej migruje i namnaża się w miejscu urazu. Inicjują również uwalnianie czynników zapalnych w celu neutralizacji potencjalnych zagrożeń i rekrutacji dodatkowych komórek glejowych. Następnie aktywowane astrocyty stają się przerostowe i zaczynają otaczać wszczepione urządzenie, tworząc ciągłą barierę włóknistą16. Sygnalizacja zapalna służy również do promowania wycofywania procesów neuronalnych z okolic implantu i ostatecznie rekrutuje fibroblasty do wzmocnienia rozwijającej się blizny glejowej17. Oligodendrocyty, odpowiedzialne za osłonę neuronów mieliną w celu zwiększenia przewodnictwa, nie przeżywają tego procesu, a odległe komórki są oddzielane od implantu przez bliznę18. Bliznowacenie glejowe znacznie skraca funkcję i żywotność wszczepionych urządzeń, szczególnie w przypadku elektrod rejestrujących, i ostatecznie służy ograniczeniu funkcjonalności interfejsów neuronowych19.
W celu zwiększenia biokompatybilności i aktywności interfejsów wszczepionych urządzeń w klasie CNS<sup="xref">20,21,22,23. Dostępny jest obszerny przegląd biokompatybilnego projektu tych interfejsów neuronowych24. Najważniejsze strategie obejmują otoczenie elektrody kompatybilnymi powłokami, takimi jak glikol polieltylenowy (PEG), kwasy polimlekowo-koglikolowe (PLGA)25, lub wzmocnienie elektrody polimerami przewodzącymi, takimi jak poli(dioksytiofen etylenu) (PEDOT) i polipirol (PPy)26,27,28,29,30,31. Zastosowano również powłoki bioaktywne, aby zapewnić wskazówki dotyczące wzrostu tkanki nerwowej przy użyciu ligandów pochodzących z matryc zewnątrzkomórkowych, w tym kolagenów, fibronektyn i kwasów hialuronowych32,33,34,35,36,37. Bioaktywność tych powłok została dodatkowo zbadana za pomocą systemów uwalniania czynników wzrostu w celu emulacji naturalnych wydzielin komórkowych30,38,39,40,41,42,43,44,45, 46,47,48,49,50. Jednocześnie niektóre grupy badawcze zdecydowały się na przemodelowanie geometrii, elastyczności i składu elektrody, aby zmniejszyć mechaniczne niedopasowanie między urządzeniem a tkanką51,52,53,54,55,56,57. Reasumując, strategie te doprowadziły do wielu obiecujących ulepszeń w zakresie neuronowych urządzeń międzyfazowych, jednak długoterminowa kompatybilność jest ciągłym problemem, a postęp może być hamowany przez złożone i czasochłonne modele in vivo.
Podejścia oparte na modelach zwierzęcych mogą ograniczyć wydajność eksperymentalną i zwiększyć koszty testowania biokompatybilności elektrod. Metody in vitro wykorzystujące konwencjonalne techniki hodowli komórkowych oferują bardziej opłacalną alternatywę, ale nie oddają dużej złożoności interakcji między urządzeniem a tkanką58. W szczególności testowanie powłok powierzchniowych przy użyciu hodowli komórkowych 2D ogranicza modelowanie geometrii elektrod oraz wpływ niedopasowania mechanicznego i mikroruchu, które przyczyniają się do generowania odpowiedzi gospodarza przyczyniającej się do awarii urządzenia59,60.
Aby przezwyciężyć problemy związane z hodowlą komórek 2D, opracowano hydrożelowe hodowle komórek nerwowych do szerokiej gamy zastosowań, badania farmakologiczne61, aby ukierunkować różnicowanie komórek nerwowych62, aby zrozumieć szlaki chorób63,64lub warstwowe w jednoczesnej hodowli z innymi typami komórek w celu modelowania migracji komórek, neuroprotekcji lub modelowania mikrośrodowisk tkankowych61. Hydrożele są łatwo formowane w różnych rozmiarach i geometriach, mogą zawierać wiele rodzajów pierwotnych lub unieśmiertelnionych kultur komórkowych i są wysoce podatne na analizę za pomocą powszechnie stosowanych technik, takich jak konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Aby stworzyć model procesu bliznowacenia glejowego, niedawno opracowaliśmy i scharakteryzowaliśmy system hydrożelowy 3D na bazie kwasu hialuronowego do wysokoprzepustowego testowania odpowiedzi glejowej na wszczepione elektrody (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)65. System ten ma kilka wyraźnych zalet: 1) pierwotne komórki glejowe (mikroglej, astrocyty i oligodendrocyty) są zamknięte w matrycy 3D złożonej z polimerów kwasu hialuronowego, który jest endogennym składnikiem macierzy zewnątrzkomórkowej; 2) sztywność matrycy można "dostroić" w celu odtworzenia właściwości mechanicznych tkanki mózgu lub rdzenia kręgowego; oraz 3) komórki mogą być zamknięte w matrycy w szybkim podejściu laboratoryjnym przy użyciu fotopolimeryzacji z zielonym światłem, ograniczając toksyczność podczas enkapsulacji. System ten umożliwia kluczowe cechy biokompatybilności in vivo: urządzenia są wprowadzane do hydrożelu w sposób porównywalny do tkanki, a odpowiedź komórkowa na wszczepione urządzenia jest monitorowana pod kątem szerokiego zakresu parametrów65. Należą do nich mechaniczne niedopasowanie między urządzeniami a powłokami hydrożelowymi o różnych strukturach oraz impulsy stymulacji elektrycznej. System ten obejmuje również oligodendrocyty i pokrewne prekursory, które często są obecne i rekrutowane w bliznach glejowych. Ich uszkodzenie, śmierć i fagocytoza przez mikroglej silnie wskazują na uszkodzenie zapalne, a jako model zmniejszonego bliznowacenia lub regeneracji, mają zdolność wykazywania ponownej mielinizacji neuronów66.
Tutaj opisujemy metodę syntezy i tworzenia hybrydowych hydrożeli kwasu hialuronowego w połączeniu z dostępnymi na rynku preparatami błony podstawnej w celu poprawy integracji komórek. Ponadto zademonstrujemy włączenie pierwotnych hodowanych komórek glejowych (mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów) oraz analizę wzrostu kultur za pomocą immunocytochemii i mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td><silny>1. Materiały do syntezy i fotopolimeryzacji HAMA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas hialuronowy (HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53747-10G</td><td>Streptococcus equi, MW: 1,5 - 1,8 X 10^6</td></tr><tr><td>Bezwodnik metakrylowy (MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>275585-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465-25G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>Alkohole handlowe Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bezwodne tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7,4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>Trietanoloamina (HERBATA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90279-100ML</td><td></td></tr><tr><td>1-winylo-2pirolidynon (NVP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V3409-5G</td><td></td></tr><tr><td>EosinY (EY)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6003-25G</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) Sylgard 184 Silikon Zestaw elastomerów</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoksysililo)metakrylan propylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Zlewka (100 ml)</td><td>Zlewka Corning</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>(500 ml)</td><td>Papier pH Corning</td><td>1000-600</td><td></td></tr><tr><td>(Labstick)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9580</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>2. Materiały do izolacji komórek glejowych i hodowli komórkowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1-2 Szczenięta szczurów Sprague Dawley</td> Charles <td>River</td><td>CD Szczep szczura Sprague Dawley kod szczepu 001</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do dyspreparacji - smukłe ostrza (małe)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14081-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - Toughcut (duże)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14130-17</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie kleszcze (Dumont #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11521-10</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze drobnoziarniste (Dumont #7)</td><td>Narzędzia do nauki o sztuce</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle's Dulbecco i mieszanka składników odżywczych szynki F-12 (DMEM/F12)</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna (PS)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Kwas trypsynowo-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6282</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>15 ml stożkowa probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe płytki poddane działaniu kultur tkankowych (Cellstar)</td>Pipeta serologiczna <td>Greiner Bio-One</td><td>665 108</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10F</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipeta serologiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-676-10K</td><td></td></tr> szalka <tr><td>Petriego (60 mm X 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego ( 100 mm X 15 mm)</td><td></td><td></td>Szkiełko nakrywkowe do mikroskopu Fisher Scientific FB0875712 <td></td></tr><tr><td>(18 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-100 18CIR</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>3. Materiały do mikroskopii (konfokalna i skaningowa mikroskopia elektronowa)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-CNPaza</td><td>abcam</td><td>ab6319</td><td></td></tr><tr><td>Królik anty-Iba1</td><td>Wako Laboratory Chemicals</td><td>019-17741</td><td></td></tr><tr><td>Kurczak anty-GFAP</td><td>abcam</td><td>ab4674</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Fisher Scientific</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td>Buforowany (10%)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica dla koni</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>157-8</td><td>Buforowany (8%)</td></tr><tr><td>Guteraldehyd</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>16019</td><td>Buforowany (8%)</td></tr><tr><td>Czterotlenek osmu</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>19152</td><td>Buforowany (2%)</td></tr><tr><td>Heksametylodilazan (HMDS)</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>16700</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td><td>Electon Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>Szkiełko mikroskopu bezwodnego</td></tr><tr><td>(25 X 75 X 1 mm)</td><td>VWR International</td><td>48311-703</td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszone hodowle hydrożelowe 3d pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

W ośrodkowym układzie nerwowym, liczne ostre urazy i zaburzenia neurodegeneracyjne, a także wszczepione urządzenia lub biomateriały zaprojektowane w celu poprawy funkcji dają ten sam wynik: nadmierny stan zapalny prowadzi do glejozy, cytotoksyczności i/lub tworzenia blizny glejowej, które łącznie pogłębiają uraz lub uniemożliwiają zdrowy powrót do zdrowia. Z zamiarem stworzenia systemu do modelowania powstawania blizn glejowych i badania procesów zapalnych, wygenerowaliśmy rusztowanie komórkowe 3D zdolne do przechowywania pierwotnych hodowanych komórek glejowych: mikrogleju, który reguluje reakcję ciała obcego i inicjuje zdarzenie zapalne, astrocytów, które reagują, tworząc włóknistą bliznę oraz oligodendrocytów, które są zwykle podatne na uszkodzenia zapalne. Niniejsza praca przedstawia szczegółową metodę krok po kroku do wytwarzania, hodowli i charakterystyki mikroskopowej rusztowania hydrożelowego 3D na bazie kwasu hialuronowego z kapsułkowanymi komórkami glejowymi pochodzącymi z mózgu szczura. Ponadto zademonstrowano protokoły charakterystyki enkapsulacji komórek i rusztowania hydrożelowego za pomocą immunofluorescencji konfokalnej i skaningowej mikroskopii elektronowej, a także zdolność do modyfikacji rusztowania za pomocą substratów bioaktywnych, z włączeniem komercyjnej mieszaniny blaszki podstawowej w celu poprawy integracji komórek.

Aby w sposób wysokoprzepustowy zamodelować odpowiedź gospodarza z tkanki nerwowej oraz bliznę glejową, in vitro system wymaga trójwymiarowego rusztowania komórkowego z materiałem macierzy, który jest biokompatybilny i nie wywołuje efektu cytotoksycznego podczas in situ formowanie i może być modyfikowane za pomocą komponentów bioaktywnych w celu ukierunkowania pożądanej odpowiedzi. W tym celu stworzyliśmy system trójwymiarowego rusztowania komórkowego opartego na kwasie h...

Tutaj prezentujemy protokół hodowli 3D komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura, w tym astrocytów, mikrogleju i oligodendrocytów. Pokazujemy pierwotną hodowlę komórkową, syntezę hydrożelu metakrylowanego kwasu hialuronowego (HAMA), fotopolimeryzację HAMAfotopolimeryzację i enkapsulację komórek oraz przetwarzanie próbek do konfokalnego i skaningowego obrazowania mikroskopem elektronowym.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Ogólnym celem tego protokołu hodowli komórek 3D jest modelowanie blizny glejowej ośrodkowego układu nerwowego przy użyciu kluczowych komórek wskaźnikowych: mikrogleju, astrocytów i oligodendrocytów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie zapalenia nerwów, takie jak potencjał komórek glejowych do wzmacniania strategii regeneracyjnych i usuwania blizny glejowej. Główną zaletą tej techniki jest to, że biologię glejową można szybko scharakteryzować w mikrośrodowisku 3D za pomocą systematycznych i wysokonakładowych manipulacji. Aby przygotować szkiełka nakrywkowe do wysiewu, zacznij od dodania jednego mililitra metakrylanu 3-propylu do 49 mililitrów wody destylowanej, aby uzyskać 2% roztwór. Następnie umieść 18-milimetrową szklaną pokrywę w roztworze i kołysz przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie spłucz szkiełka nakrywkowe, zanurzając je kolejno w trzech zlewkach po 100 mililitrów wody dejonizowanej. Następnie wysuszyć szkiełka nakrywkowe w próżni za pomocą eksykatora i piekarnika w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyj kleszczy, aby szybko zanurzyć poszczególne szkiełka nakrywkowe w 70% etanolu. Następnie, bez suszenia, wrzuć każde szkiełko nakrywkowe do dołka z 12-dołkową płytką. Następnie umyj każdą studzienkę jednym mililitrem sterylnej wody dejonizowanej. Następnie dodaj jeden mililitr sterylnego poli

improved-3d-hydrogel-cultures-primary-glial-cells-for-vitro-modelling

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje technikę tworzenia trójwymiarowej hodowli komórek glejowych. Komórki glejowe pochodzące z mózgu szczura są zamknięte w fotosieciowalnej matrycy polimerowej zawierającej składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Po inkubacji w pożywce wzrostowej komórki glejowe namnażają się w macierzy nośnej, tworząc trójwymiarową kulturę.

Stworzenie trójwymiarowej hodowli komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura

Fenotypowo dzikie astrocyty i nerwowe komórki macierzyste pobrane od myszy zmodyfikowanych za pomocą floksowanych, warunkowo onkogennych alleli i przekształconych za pomocą wirusowej rekombinacji za pośrednictwem Cre mogą być używane do modelowania patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo poprzez ortotopowe wstrzykiwanie przekształconych komórek do mózgów syngenetycznych, immunologicznie kompetentnych rodzeństwa z miotu.

Modelowanie patogenezy gwiaździaka in vitro i in vivo przy użyciu astrocytów korowych lub nerwowych komórek macierzystych od warunkowych, genetycznie zmodyfikowanych myszy

Komórki globoidalne są charakterystyczną cechą patologiczną choroby Krabbego, leukodystrofii, która obecnie nie ma skutecznej długoterminowej terapii. Opracowaliśmy model hodowli komórkowej w celu zbadania wrodzonej biologii i potencjału chorobotwórczego aktywowanego mikrogleju oraz jego transformacji w komórki globoidalne.

Model in vitro do badania patofizjologii komórkowej w leukodystrofii komórek globoidalnych

Rozwój bólu neuropatycznego wiąże się z patologicznymi zmianami komórek glejowych rdzenia kręgowego. Brakuje niezawodnego systemu hodowli glejowej pochodzącego z dorosłej tkanki rdzenia kręgowego i przeznaczonego do badania tych komórek in vitro. Dlatego pokazujemy tutaj, jak ustalić pierwotne mieszane kultury glejowe z tkanki rdzenia kręgowego dorosłej myszy.

Przygotowanie pierwotnych mieszanych kultur glejowych z tkanki rdzenia kręgowego dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół trójwymiarowej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta w ortogonalnie przestrajalnych biomateriałach zaprojektowanych tak, aby naśladować matrycę mózgu. Podejście to zapewnia platformę eksperymentalną in vitro, która zachowuje wiele cech komórek glejaka in vivo, zwykle traconych w hodowli.

Hydrożele na bazie kwasu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli komórek glejaka wielopostaciowego pochodzących od pacjentów

Tutaj prezentujemy proste podejście wykorzystujące specyficzne podłoża hodowlane, które pozwala na tworzenie kultur wzbogaconych o neurony i astrocyty, lub kultur gleju neuronów z kory embrionalnej, o wysokiej wydajności i odtwarzalności.

Model hodowli komórkowej do badania roli interakcji neuron-glej w niedokrwieniu

Tutaj prezentujemy łatwy w użyciu test do analizy migracji glejaka (GBM) na neuronach o wzorcach. Opracowaliśmy makro w oprogramowaniu FiJi do łatwego ilościowego określania migracji komórek GBM na neuronach i zaobserwowaliśmy, że neurony modyfikują zdolność inwazyjną komórek GBM.

Wspólna hodowla komórek macierzystych podobnych do glejaka na neuronach wzorcowych w celu zbadania migracji i interakcji komórkowych

Tutaj przedstawiamy metodę biodruku 3D mysich astrocytów korowych do biofabrykacji tkanek podobnych do neuronów w celu zbadania funkcjonalności astrocytów w ośrodkowym układzie nerwowym i mechanizmów obejmujących komórki glejowe w chorobach neurologicznych i leczeniu.

Biodrukowanie 3D mysich astrocytów korowych do inżynierii tkanki neuronalnej

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji 3D-drukowanych biologicznie kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC. Ten model kokultury, wygenerowany w rusztowaniu hydrożelowym w formatach 96- lub 384-dołkowych, wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i wzrost neurytów w ciągu 7 dni oraz pokazuje ekspresję markerów dojrzałości dla obu typów komórek.

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

Prezentujemy metodę replikacji mikrośrodowiska guza glejaka na froncie inwazyjnym, która obejmuje przepływ płynu śródmiąższowego. Ten model to hydrożel hialuronowo-kolagenowy I we wkładzie do hodowli tkankowej, w którym można zastosować głowicę ciśnieniową płynu. Inwazję można określić ilościowo, a komórki można wyizolować lub poddać lizie.

Fotopolimeryzowalny model inwazyjnego mikrośrodowiska glejaka z przepływem śródmiąższowym z kwasem hialuronowym i kolagenem

Poznaj protokół 3D hodowli pierwotnych komórek glejowych szczura w hydrożelu HAMA do modelowania zapalenia układu nerwowego. Ta metoda umożliwia badanie interakcji komórkowych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości.

Ulepszone hodowle hydrożelowe 3D pierwotnych komórek glejowych do modelowania in vitro zapalenia układu nerwowego

Przeglądaj więcej filmów