Name: Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Poznaj mikroskopię immunofluorescencyjną γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA. Ta metoda umożliwia wizualizację pojedynczych uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt był wspierany przez niemiecką Fundację José Carrerasa na rzecz białaczki (DJCLS 14 R/2017).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki II Wydziału Medycznego Mannheim Uniwersytetu w Heidelbergu. Uzyskano pisemną świadomą zgodę od wszystkich osób.
1. Przygotowanie materiałów
<ol>
	<li>Podstawowy roztwór przeciwzakrzepowy: Przygotować podstawowy roztwór przeciwzakrzepowy zawierający 200 j.m. heparyny na ml w 0,9% chlorku sodu. Napełnić każdą z probówek zbiorczych (objętość 9 ml) 2 ml podstawowego roztworu antykoagulantu przed pobraniem próbek krwi lub szpiku kostnego.</li>
	<li>Roztwór do lizy krwinek czerwonych: Przygotować 10-krotny roztwór do lizy krwinek czerwonych z 82,91 g chlorku amonu, 7,91 g wodorowęglanu amonu i 2 ml 0,5 M roztworu kwasu etylenodiaminotetraoctowego do pH 8,0 poprzez rozpuszczenie środków w wodzie podwójnie destylowanej do całkowitej objętości 1 l.</li>
	<li>Roztwór utrwalający: Dodać 8,3 μl 1 M roztworu wodorotlenku potasu do 360 mg paraformaldehydu (PFA) w probówce do mikromiareczkowania. Napełnij probówkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) do oznaczenia 1 ml na probówce i podgrzej probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C, aby uzyskać 1 ml 36% roztworu PFA. Przenieść 1 ml 36% roztworu PFA do probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 8 ml PBS do 1 ml 36% roztworu PFA, aby uzyskać 9 ml 4% roztworu podstawowego PFA. Podwielokrotnić 4% roztwór podstawowy PFA i przechowywać w temperaturze -18 °C do momentu użycia do utrwalenia komórek. 
	UWAGA: 1) Roztwór wodorotlenku potasu jest. Należy pamiętać o ochronie oczu i skóry. 2) PFA jest rakotwórczy. Unikać kontaktu ze skórą i wdychania. Przygotuj roztwór utrwalający pod maską.</li>
	<li>Roztwór permeabilizacyjny: Dodaj 50 μl Octoxinol 9 do 50 ml PBS, aby uzyskać roztwór około 0,1% Octoxinol 9.</li>
	<li>Roztwór blokujący: Przygotować 5% i 2% roztwory blokujące, mieszając środek blokujący białko z PBS i przechowywać w temperaturze 6 – 8 °C.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Fibroblasty w hodowli komórkowej: Hoduj ludzkie fibroblasty linii komórkowej NHDF w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 4 mM glutaminą i 1% penicyliną/streptomycyną.
	<ol>
		<li>Przygotowanie szkiełka mikroskopowego z przylegającymi fibroblastami
		<ol>
			<li>Usunąć pożywkę z kolby (75cm2 obszaru wzrostu) z wykładniczo rosnącymi fibroblastami NHDF. Dodać 10 ml PBS do kolby. Delikatnie umyć przylegające fibroblasty, ręcznie potrząsając kolbą przez 1 minutę.</li>
			<li>Wyjąć PBS i dodać 1 ml trypsyny do kolby. Delikatnie wstrząsnąć kolbą, aby upewnić się, że wszystkie przylegające komórki są pokryte trypsyną. Usunąć trypsynę z kolby. Umieścić kolbę w inkubatorze na 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Wyjąć kolbę z inkubatora i dodać do niej 10 ml pożywki RPMI 1640. Kilkakrotnie pipetować pożywkę w górę i w dół, aby rozproszyć fibroblasty.</li>
			<li>Odpipetować 0,3 ml rozproszonych fibroblastów na każde z dwóch pól szkiełka mikroskopowego i umieścić szkiełko w inkubatorze na 24 godziny, tak aby fibroblasty przylegały do szkiełka. W celu barwienia immunologicznego γH2AX i 53BP1 w jądrach fibroblastów przejdź do kroku 3.1.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Próbki od pacjentów
	<ol>
		<li>Próbki krwi: Użyj probówek pobranych, które zostały wypełnione 2 ml podstawowego roztworu antykoagulantu i dodaj 7 ml krwi do probówek. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej (tj. 18–20 °C). Następnego dnia wyizolować spoczynkowe komórki jednojądrzaste w fazie G0/G1 przez wirowanie w gradiacji gęstości (etap 2.2.3).</li>
		<li>Próbki szpiku kostnego: Użyć probówek wypełnionych 2 ml roztworu podstawowego antykoagulantu (krok 1.1) i dodać 7 ml szpiku kostnego do probówek. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej (tj. 18 - 20 °C). Następnego dnia wyizolować spoczynkowe komórki jednojądrzaste w fazie G0/G1 przez wirowanie w gradiacji gęstości (etap 2.2.3). Użyj mikrokulek CD34 i kolumn separacji komórek do izolacji komórek CD34 +.</li>
		<li>Izolacja komórek jednojądrzastych metodą wirowania w gradionym gradieniu gęstości 
		UWAGA: Komórki jednojądrzaste są izolowane z próbek krwi i szpiku kostnego przez wirowanie w gradiacji gęstości17,18,19.
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć heparynizowaną próbkę krwi w stosunku 1:1 za pomocą PBS, a heparynizowaną próbkę szpiku kostnego w stosunku 1:3 za pomocą PBS. Delikatnie zawieś komórki, dwukrotnie wciągając je i wyjmując z pipety.</li>
			<li>Dodaj objętość pożywki o gradiencie gęstości do świeżej probówki. Delikatnie ułóż rozcieńczoną krew lub szpik kostny na pożywce o gradiencie gęstości. Uważaj, aby nie mieszać dwóch warstw.</li>
			<li>Odwirować probówkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i 400 x g. Odciągnąć górną warstwę osocza za pomocą pipety. Następnie ostrożnie zbierz komórki jednojądrzaste w warstwie powyżej pożywki o gradiencie gęstości. Przenieś komórki jednojądrzaste do świeżej probówki.</li>
			<li>Dodać co najmniej trzy objętości PBS do komórek jednojądrzastych w probówce. Delikatnie zawieś komórki, dwukrotnie wciągając je i wyjmując z pipety. Wirować probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej i 400 x g.</li>
			<li>Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać 10 ml 4 °C, 1x roztwór do lizy dla krwinek czerwonych. Delikatnie zawiesić komórki, dwukrotnie wciągając je i wyjmując z pipety, a następnie umieść probówkę na lodzie na 5 minut. Następnie dodać 30 ml PBS w temperaturze 4 °C i odwirowywać probówkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej i 400 x g.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotowanie cytospinów
		<ol>
			<li>Przygotować dwie cytospiny z komórkami jednojądrzastymi próbek pacjenta (tj. jedną cytospinę do barwienia immunofluorescencyjnego γH2AX i jedną cytospinę do barwienia immunofluorescencyjnego γH2AX i 53BP1) przez odwirowanie (300 x g, 10 min) 1,0 x 105 komórek dla każdego preparatu (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3 i 4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. γH2AX i 53BP1 Barwienie immunofluorescencyjne
<ol>
	<li>Utrwalanie i przenikanie: Utrwalić komórki za pomocą 200 μl 4% PFA przez 10 minut. Po utrwaleniu delikatnie przemyj komórki trzy razy 30 ml PBS przez 5 minut każdy na wytrząsarce laboratoryjnej. Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 200 μl 0,1% oktoksynolu 9 przez 10 minut. Delikatnie umyj komórki trzy razy 30 ml 5% roztworu blokującego przez 5 minut każda na wytrząsarce laboratoryjnej. Zablokuj komórki w 30 ml świeżego 5% roztworu blokującego na 1 godzinę.</li>
	<li>Inkubacja z przeciwciałami
	<ol>
		<li>Inkubować jeden preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-γH2AX (1:500), a drugi preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-γH2AX (1:500) i poliklonalnym króliczym przeciwciałem anty-53BP1 (1:500) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Po inkubacji delikatnie przemyć komórki 3 razy 30 ml 2% roztworu blokującego na każde 5 minut na wytrząsarce laboratoryjnej.</li>
		<li>Usunąć roztwór blokujący i inkubować pierwszy preparat komórek z sprzężonym z Alexa488 kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim (1:500), a drugi preparat komórek z koniugowanym kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim (1:500) i sprzężonym z Alexa555 przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi osła (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłoże montażowe: Umieść szkiełko z komórkami w misce i delikatnie umyj komórki trzy razy 30 ml PBS na każde 5 minut na wytrząsarce laboratoryjnej. Usunąć PBS i zamontować komórki z pożywką montażową zawierającą 4,6-diamidyno-2-fenyloindol. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym, aby nie osadzały się pęcherzyki powietrza. Odczekać co najmniej 3 godziny na stwardnienie podłoża mocującego przed analizą komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.</li>
</ol>
4. Analiza ognisk γH2AX i 53BP1
<ol>
	<li>Mikroskopia fluorescencyjna: Analizuj ogniska γH2AX i 53BP1 w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla DAPI, Alexa 488 i Cy3 podczas obrazowania przy 100-krotnym powiększeniu obiektywu. Rejestruj obrazy za pomocą aparatu i przetwarzaj je za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania.</li>
</ol>

<ol><li>Hoeijmakers, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+maintenance+mechanisms+for+preventing+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome maintenance mechanisms for preventing cancer.</a> Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).</li>
<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+and+decay+of+the+primary+structure+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Instability and decay of the primary structure of DNA.</a> Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>IAEA. Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture. , 
 <a target="_blank" href="https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf">https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf</a> (1994).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+NHEJ-derived+reciprocal+chromosomal+translocations+does+not+require+Ku70%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70.</a> Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Scully, R., Xie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+strand+break+repair+functions+of+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Double strand break repair functions of histone H2AX.</a> Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).</li>
<li>Walters, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+ongoing+DNA+damage+in+multiple+myeloma+cells+as+revealed+by+constitutive+phosphorylation+of+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX.</a> Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).</li>
<li>Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+expression+of+phosphorylated+histone+H2AX+in+tumors+in+relation+to+DNA+double-strand+breaks+and+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability.</a> DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).</li>
<li>Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GammaH2AX+in+cancer+cells%3A+a+potential+biomarker+for+cancer+diagnostics%2C+prediction+and+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence.</a> Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).</li>
<li>Chen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK2V617F+promotes+replication+fork+stalling+with+disease-restricted+impairment+of+the+intra-S+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+of+DNA+damage+and+alteration+of+the+DNA+damage+response+in+myelodysplastic+syndromes+and+acute+myeloid+leukemias%5BTitle%5D)+AND+%22Leuk+Res%22%5BJournal%5D)">Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias.</a> Leuk Res. 57, 112-118 (2017).</li>
<li>Panier, S., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+repair%3A+53BP1+comes+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).</li>
<li>Escribano-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+cycle-dependent+regulatory+circuit+composed+of+53BP1-RIF1+and+BRCA1-CtIP+controls+DNA+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice.</a> Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+White+Blood+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Separation of White Blood Cells.</a> Nature. 204, 793-794 (1964).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood.+Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1+g%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Invest+Suppl%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g.</a> Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Bain, B., Pshyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+reactivity+in+mixed+leukocyte+cultures+after+separation+of+mononuclear+cells+on+Ficoll-Hypaque%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque.</a> Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).</li>
<li>Popp, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+reduced+and+conventional+absorbed+radiation+doses+using+3rd+generation+dual-source+CT+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Radiol+Open%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology.</a> Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).</li>
<li>Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+DNA+damage+after+multi-detector+row+CT%3A+a+quantitative+biomarker+of+low-level+radiation+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure.</a> Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Lobrich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+formation+and+repair+of+DNA+double-strand+breaks+after+computed+tomography+examinations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+fixatives+for+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell fixatives for immunostaining.</a> Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).</li>
<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of cell membranes.</a> Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).</li>
<li>Rothkamm, K., Lobrich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+lack+of+DNA+double-strand+break+repair+in+human+cells+exposed+to+very+low+x-ray+doses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 jest przydatną metodą analizy powstawania i naprawy DSB w szerokim spektrum obszarów badawczych. Krytycznymi parametrami, które wpływają na wynik eksperymentów, są faza cyklu komórkowego, czynniki używane do utrwalania i przenikania komórek, wybór przeciwciał oraz sprzęt i oprogramowanie mikroskopu fluorescencyjnego.
Wpływ cyklu komórkowego na wzorce ognisk γH2AX wykazano poprzez wykładniczy wzrost normalnych fibroblastów linii komórkowej NHDF. O...

DNA jest ciągle uszkadzane przez endogenne (np. stres replikacyjny, reaktywne formy tlenu, wewnętrzna niestabilność DNA) i egzogenne (np. rodniki chemiczne, napromieniowanie) źródła (Rysunek 1)1,2,3,4. Wśród uszkodzeń DNA szczególnie poważnymi zmianami są pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB), które mogą indukować śmierć komórki lub kancerogenezę. Na komórkę i cykl komórkowy może powstać około 50 DSB5. W komórkach ssaków rekombinacja homologiczna (HR) i niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) rozwinęły się jako główne szlaki naprawy DSB (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). HR występuje w późnej fazie S/G2 i wykorzystuje nienaruszoną chromatydę siostrzaną jako matrycę do potencjalnie bezbłędnej naprawy. Dla porównania, NHEJ jest aktywny przez cały cykl komórkowy i potencjalnie mutagenny, ponieważ pary zasad mogą być dodawane lub recięte przed podwiązaniem złamanych końców. Ponadto, alternatywne łączenie końców może być włączone jako powolny mutagenny mechanizm naprawy zapasowej w przypadku niedoboru NHEJ6,7.
DSB indukuje fosforylację histonu H2AX w Serine 139 w regionie kilku par megazasad wokół każdego DSB. Tworzące się ogniska jądrowe nazywane są ogniskami γH2AX i są wykrywalne za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej8. γH2AX promuje rekrutację kolejnych białek reagujących na DSB i bierze udział w przebudowie chromatyny, naprawie DNA i transdukcji sygnału9. Ponieważ uważa się, że każde ognisko γH2AX reprezentuje pojedynczy DSB, możliwe jest ilościowe określenie DSB za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, co wykazano w liniach komórek nowotworowych i próbkach pacjentów10,11,12,13,14. 53BP1 (białko wiążące p53 1) jest kolejnym kluczowym białkiem pośredniczącym w naprawie DSB. Bierze udział w rekrutacji białek reagujących na DSB, sygnalizacji punktów kontrolnych i synapsie DSB ends15. Ponadto 53BP1 odgrywa kluczową rolę w wyborze ścieżki naprawy DSB. Uruchamia naprawę DSB w kierunku NHEJ, podczas gdy HR jest zapobieżony16. Biorąc pod uwagę rzeczywiste funkcje γH2AX i 53BP1 w naprawie DSB, jednoczesna analiza γH2AX i 53BP1 za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej może być użyteczną metodą do precyzyjnej analizy powstawania i naprawy DSB.
Ten manuskrypt zawiera krok po kroku protokół do przeprowadzenia mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1 w jądrach komórkowych. W szczególności technika ta jest stosowana w normalnych fibroblastach linii komórkowej NHDF, w napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim limfocytach zdrowej osoby oraz w komórkach CD34+ pacjenta z ostrą białaczką szpikową. Szczegóły metody zostały wskazane w kontekście przedstawionych wyników.

<table><tbody><tr><td>Pożywka RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>ratiopharm</td><td>PZN 3029843</td><td>&nbsp; Heparyna 5 000 j.m. / ml</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku sodu 0,9%</td> <td>B. Braun</td><td>PZN 1957154</td><td>Składnik roztworu podstawowego antykoagulantu</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Premium</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-02</td><td>Pożywka do izolacji komórek jednojądrzastych</td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny 10X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59427C</td><td>Enzym do dysocjacji fibroblastów w hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>CD34 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-702</td><td>Izolacja szpikowych komórek progenitorowych CD34+</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe diagnostyczne</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER-203B-CE24</td><td>Szkiełka mikroskopowe</td></tr><tr><td>Megafuge 1.0 R</td><td>Heraeus</td><td>75003060</td><td>&nbsp; Wirówka stołowa&nbsp;</td></tr><tr>Urządzenie <td></td><td></td><td></td><td>Cytospin</td></tr><tr><td>Pokrywka</td><td>Heraeus</td><td>76003422</td><td>Pokrywka do pracy bez mikrorurek</td></tr><tr><td>Pojemnik Cyto</td><td>Heraeus</td><td>75003416</td><td>Pojemnik Cyto z 2 stożkowymi otworami</td></tr><tr><td>Uchwyt na klips</td><td>Heraeus</td><td>75003414</td><td>Nośnik do trzymania pojemnika na cyto i szkiełka</td></tr><tr><td>Wkładka nośna</td><td>Heraeus</td><td>75003417</td><td>Wkładka podporowa do trzymanie nosidełka z klipsem</td></tr><tr><td>Triton X-100 (Octoxinol 9)</td><td>Thermo Scientific</td><td>85112</td><td>Detergent do przepuszczalności błon komórkowych</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu roztwór 1M</td><td>Merck Millipore</td><td>109107</td><td>Niezbędny do przygotowania roztworu paraformaldehydu</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Środek utrwalający</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Zrównoważony roztwór soli</td></tr><tr><td>Chemiblocker</td><td>Merck Millipore</td><td>2170</td><td>Środek blokujący</td></tr><tr><td>Mysz monoklonalna anty-&gamma; Przeciwciało H2AX (JBW301)</td><td>Merck Millipore</td><td>05-636</td><td>Pierwszorzędowe przeciwciało do wykrywania &gamma; H2AX</td></tr><tr><td>Poliklonalne królicze przeciwciało anty-53BP1 (NB100-304)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-304</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do wykrywania 53BP1</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało przeciw-mysie</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-sprzężone przeciwciało przeciwko królikowi</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Pożywka montażowa Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Zawiera DAPI do barwienia DNA</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>490035</td></tr><tr><td>Kamera CCD Cool Cube 1</td><td>Metasystems</td><td>H-0310-010-MS</td><td>System kamer do zapisu cyfrowego</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Isis</td><td>Metasystems</td><td>Nie dotyczy</td><td>Oprogramowanie mikroskopu</td></tr></tbody></table>

mikroskopia immunofluorescencyjna γh2ax i 53bp1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych dna

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Pęknięcia dwuniciowe DNA (DSB) są poważnymi uszkodzeniami DNA. Analiza powstawania i naprawy DSB jest istotna w szerokim spektrum obszarów badawczych, w tym integralności genomu, genotoksyczności, biologii radiacyjnej, starzenia się, nowotworów i opracowywania leków. W odpowiedzi na DSB, histon H2AX jest fosforylowany w serynie 139 w regionie kilku par megazasad, tworząc dyskretne ogniska jądrowe wykrywalne za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Ponadto 53BP1 (białko wiążące p53 1) jest kolejnym ważnym białkiem reagującym na DSB, promującym naprawę DSB poprzez niehomologiczne łączenie końców, jednocześnie zapobiegając rekombinacji homologicznej. Zgodnie ze specyficznymi funkcjami γH2AX i 53BP1, połączona analiza γH2AX i 53BP1 za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej może być rozsądnym podejściem do szczegółowej analizy DSB. Rękopis ten zawiera protokół krok po kroku uzupełniony o notatki metodyczne dotyczące wykonywania tej techniki. W szczególności wykazano wpływ cyklu komórkowego na wzorce ognisk γH2AX w prawidłowych fibroblastach linii komórkowej NHDF. Ponadto wartość ognisk γH2AX jako biomarkera jest przedstawiona w napromieniowanych promieniowaniem rentgenowskim limfocytach zdrowej osoby. Wreszcie, niestabilność genetyczna jest badana w komórkach CD34+ pacjenta z ostrą białaczką szpikową za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Analiza ognisk γH2AX w komórkach jest najdokładniejsza w fazie G0/G1 oraz fazie G2, kiedy ogniska γH2AX pojawiają się jako wyraźne fluorescencyjne kropki (Rysunek 5A). W przeciwieństwie do tego, analiza ognisk γH2AX w komórkach podczas fazy S jest utrudniona przez rozproszone w całym jądrze plamki γH2AX spowodowane procesem replikacji (Rysunek 5B).
Fiksację komórek prze...

Ten manuskrypt zawiera protokół do analizy pęknięć dwuniciowych DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej γH2AX i 53BP1.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Ogólnym celem mikroskopii immunofluorescencyjnej gamma-H2AX i 53BP1 jest analiza powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA w różnych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rakiem, takie jak to, w jaki sposób powstaje niestabilność genetyczna w komórkach nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można wizualizować pojedyncze pęknięcia dwustrunowe DNA i analizować procesy naprawcze.Procedurę zademonstruje Susanne Brendel, technik naszego laboratorium. Rozpocznij eksperyment od przygotowania roztworów, zaczynając od podstawowego roztworu antykoagulantu z 200 jednostkami międzynarodowymi heparyny na mililitr w 0,9% chlorku sodu. Napełnij każdą z probówek dwumililitrami podstawowego roztworu antykoagulantu przed pobraniem próbek krwi lub szpiku kostnego.Następnie przygotuj 10-krotny roztwór do lizy dla krwinek czerwonych z 82,91 gramami chlorku amonu, 7,91 gramami wodorowęglanu amonu i dwoma mililitrami 0,5 molowego roztworu kwasu etylenodiamiendetetyczkowego do pH 8,0, rozpuszczając środki w wodzie podwójnie destylowanej na łączną objętość jednego litra. Następnie przygotuj roztwór utrwalający, dodając 8,3 mikrolitra jednomolowe

immunofluorescence-microscopy-h2ax-53bp1-for-analyzing-formation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ilościowe oznaczanie pęknięć obu nici DNA z wykorzystaniem formowania γH2AX jako markera molekularnego stało się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX po narażeniu komórek na promieniowanie.

Ilościowe oznaczanie ognisk &gamma;H2AX w odpowiedzi na promieniowanie jonizujące

Ilościowe oznaczanie pęknięć dwuniciowych DNA na podstawie ognisk γH2AX stało się nieocenionym narzędziem, szczególnie w radiobiologii, służącym do oceny radiowrażliwości tkanek oraz efektów związków modyfikujących działanie promieniowania. W niniejszym materiale demonstrujemy zastosowanie testu immunofluorescencyjnego do ilościowego oznaczania ognisk γH2AX w próbkach tkanek.

Ilościowe oznaczenie ognisk $\gamma$H2AX w próbkach tkanek

Analiza mikroskopowa ognisk γH2AX, które tworzą się po fosforylacji H2AX w Ser-139 w odpowiedzi na pęknięcia dwuniciowe DNA, stała się nieocenionym narzędziem w radiobiologii. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy przeciwciało przeciwko monometylowanej histonie H3 w lizynie 4 jako marker epigenetyczny aktywnie transkrybowanej euchromatyny, aby ocenić przestrzenną dystrybucję powstawania indukowanych promieniowaniem ognisk γH2AX w jądrze komórkowym.

Ocena rozkładu przestrzennego $\gamma$H2AX po napromieniowaniu jonizującym

W tym filmie opisujemy metodę immunofluorescencji, aby zobrazować lokalizację białek naprawy DNA γH2AX i 53BP1 w miejscach pęknięć dwuniciowego DNA w napromieniowanych jądrach komórkowych.

Oparta na immunofluorescencji wizualizacja interakcji białek naprawy DNA

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii immunofluorescencyjnej do wykrywania specyficznych białek odpowiedzi na uszkodzenia DNA zlokalizowanych w miejscach pęknięć dwuniciowych DNA w ludzkich komórkach jednojądrzastych. Białka są rozpoznawane przez specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe, które z kolei wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi znakowanymi fluoroforem, które fluoryzują podczas wizualizacji mikroskopowej, umożliwiając wizualizację białek jako odrębnych ognisk...

Mikroskopia immunofluorescencyjna do analizy pęknięć dwuniciowych DNA

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Naprawa pęknięć dwuniciowego DNA jest procesem dynamicznym, wymagającym nie tylko tworzenia kompleksów naprawczych w miejscach pęknięć, ale także ich rozwiązania po usunięciu zmiany. W tym przypadku używamy mikroskopii immunofluorescencyjnej do przejściowych i długotrwałych pęknięć dwuniciowych jako narzędzia do analizy tego mechanizmu utrzymania genomu.

Charakterystyka procesów naprawy DNA przy przejściowych i długotrwałych pęknięciach dwuniciowego DNA za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej

Reakcja na uszkodzenia DNA wywołana promieniowaniem, aktywowana przez wiązkę neutronów używaną w terapii wychwytywania neutronów borowych (BNCT), nie została w pełni ustalona. Protokół ten zapewnia procedurę krok po kroku do wykrywania ognisk indukowanych promieniowaniem (RIF) białek naprawczych poprzez barwienie immunofluorescencyjne w liniach komórkowych ludzkiego raka jelita grubego po napromieniowaniu wiązką zmieszaną z neutronami.

Obrazowanie immunofluorescencyjne uszkodzeń DNA i ognisk naprawczych w ludzkich komórkach raka jelita grubego

Po uszkodzeniu DNA, ludzkie komórki aktywują niezbędne szlaki naprawcze, aby przywrócić integralność swojego genomu. W tym miejscu opisujemy metodę immunofluorescencji pośredniej jako sposób na wykrycie białek naprawy DNA, analizę ich przestrzennej i czasowej rekrutacji oraz pomoc w badaniu interakcji białko-białko w miejscach uszkodzenia DNA.

Wizualizacja oddziaływania białek naprawy DNA za pomocą immunofluorescencji

Ten protokół przedstawia metodę oceny powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA poprzez jednoczesne wykrywanie ognisk γH2AX i 53BP1 w jądrach interfazowych ludzkich limfocytów obwodowych traktowanych bleomycyną.

Podwójna immunofluorescencja γH2AX i 53BP1 w ludzkich limfocytach obwodowych

Tutaj prezentujemy prosty i szybki protokół wykrywania oddziaływań białek w miejscach uszkodzenia DNA.

Test ligandów zbliżeniowych do lokalizacji białek w miejscach uszkodzenia DNA

Poznaj mikroskopię immunofluorescencyjną γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA. Ta metoda umożliwia wizualizację pojedynczych uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych.

Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Przeglądaj więcej filmów