Mikroskopia immunofluorescencyjna γH2AX i 53BP1 do analizy powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA

Ogólnym celem mikroskopii immunofluorescencyjnej gamma-H2AX i 53BP1 jest analiza powstawania i naprawy pęknięć dwuniciowych DNA w różnych tkankach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniach nad rakiem, takie jak to, w jaki sposób powstaje niestabilność genetyczna w komórkach nowotworowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można wizualizować pojedyncze pęknięcia dwustrunowe DNA i analizować procesy naprawcze.

Procedurę zademonstruje Susanne Brendel, technik naszego laboratorium. Rozpocznij eksperyment od przygotowania roztworów, zaczynając od podstawowego roztworu antykoagulantu z 200 jednostkami międzynarodowymi heparyny na mililitr w 0,9% chlorku sodu. Napełnij każdą z probówek dwumililitrami podstawowego roztworu antykoagulantu przed pobraniem próbek krwi lub szpiku kostnego.

Następnie przygotuj 10-krotny roztwór do lizy dla krwinek czerwonych z 82,91 gramami chlorku amonu, 7,91 gramami wodorowęglanu amonu i dwoma mililitrami 0,5 molowego roztworu kwasu etylenodiamiendetetyczkowego do pH 8,0, rozpuszczając środki w wodzie podwójnie destylowanej na łączną objętość jednego litra. Następnie przygotuj roztwór utrwalający, dodając 8,3 mikrolitra jednomolowego roztworu wodorotlenku potasu do 360 miligramów paraformaldehydu lub PFA w probówce do mikromiareczkowania. Napełnij probówkę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami lub PBS do oznaczenia jednego mililitra probówki i podgrzej probówkę w bloku grzewczym w temperaturze 95 stopni Celsjusza, aby uzyskać jeden mililitr 36-procentowego roztworu PFA.

Przenieś jeden mililitr 36-procentowego roztworu PFA do 15-mililitrowej probówki. I dodaj osiem mililitrów PBS, aby uzyskać dziewięciomililitrowy czteroprocentowy roztwór podstawowy PFA. Podwielokrotnić czteroprocentowy roztwór podstawowy PFA i przechowywać go w temperaturze minus 18 stopni Celsjusza do momentu użycia do utrwalenia komórek.

Następnie należy przygotować roztwór permeabilizacyjny, dodając 50 mikrolitrów Octoxynol 9 do 50 mililitrów PBS, aby uzyskać roztwór około 0,1% Octoxynol 9. Na koniec należy przygotować pięcioprocentowe i dwuprocentowe roztwory blokujące, mieszając środek blokujący białko z PBS. Aby przygotować próbki krwi lub szpiku kostnego, należy pobrać probówki wypełnione dwoma mililitrami roztworu podstawowego antykoagulantu.

Pobrać siedem mililitrów krwi lub szpiku kostnego z probówki w sterylnych warunkach, odpowiednio przez nakłucie żyły lub nakłucie szpiku kostnego. Próbki należy przechowywać przez noc w temperaturze pokojowej. Po przechowywaniu przez noc rozcieńczyć heparynizowaną próbkę krwi jeden do jednego za pomocą PBS, a heparynizowaną próbkę szpiku kostnego w stosunku jeden do trzech za pomocą PBS.

Delikatnie zawieś komórki, dwukrotnie wciągając je i wyjmując z pipety. Następnie dodaj jedną objętość pożywki o gradiencie gęstości do świeżej probówki. Delikatnie ułóż rozcieńczoną krew lub szpik kostny na pożywce o gradiencie gęstości i uważaj, aby nie wymieszać dwóch warstw.

Odwirować probówkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej i 400 G. Odciągnąć górną warstwę osocza za pomocą pipety. Następnie ostrożnie zbierz komórki jednojądrzaste w warstwie powyżej pożywki o gradiencie gęstości. Przenieść komórki jednojądrzaste do świeżej probówki i dodać co najmniej trzy objętości PBS.

Delikatnie zawieś komórki, dwukrotnie wciągając je i wyjmując z pipety. Odwirować probówkę. Po wirowaniu usunąć supernatant.

Dodaj 10 mililitrów roztworu do lizy o czterech stopniach Celsjusza 1x na czerwone krwinki. Delikatnie zawiesić komórki, dwukrotnie wciągając je i wyjmując z pipety, a następnie umieść probówkę na lodzie na pięć minut. Następnie dodaj 30 mililitrów PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza i odwiruj probówkę.

Użyj mikrokulek CD34 i kolumn separacji komórek do izolacji komórek CD34-dodatnich. Przygotować dwa cytospiny z komórkami jednojądrzastymi z próbek pacjenta, odwirowując 1 razy 10 pięć komórek dla każdego preparatu. Utrwal komórki 200 mikrolitrami czteroprocentowego PFA przez 10 minut.

Po utrwaleniu delikatnie przemyj komórki trzy razy 30 mililitrami PBS przez pięć minut każdy na shakerze. Następnie przesiąkaj komórki 200 mikrolitrami 0,1% Octoxynolu 9 przez 10 minut. Delikatnie umyj komórki trzy razy 30 mililitrami pięcioprocentowego roztworu blokującego przez pięć minut każdy na wytrząsarce laboratoryjnej.

Zablokuj komórki w 30 mililitrach świeżego pięcioprocentowego roztworu blokującego na jedną godzinę. Utrwalenie i przepuszczalność komórek za pomocą czteroprocentowego paraformaldehydu w 0,1% Octoxynolu 9 wyraźnie zachowuje ogniska gamma-H2AX i 53BP1. Inkubować jeden preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-gamma-H2AX, a drugi preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-gamma-H2AX i poliklonalnym przeciwciałem królika anty-53BP1 przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Zdecydowanie zaleca się stosowanie sprawdzonych przeciwciał anty-gamma-H2AX i anty-53BP1. Po inkubacji delikatnie przemyć komórki trzy razy 30 mililitrami dwuprocentowego roztworu blokującego przez każde pięć minut na wytrząsarce laboratoryjnej. Następnie inkubuj pierwszy preparat komórek z sprzężonym kozim przeciwciałem wtórnym przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim Alexa 488, rozcieńczonym jeden na 500 w dwuprocentowym roztworze blokującym.

Drugi preparat komórek należy inkubować z koniugowanym kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko myszom Alexa 488 i sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi Alexa 555, rozcieńczonym jeden na 500 do dwuprocentowego roztworu blokującego. Delikatnie umyj komórki trzy razy 30 mililitrami PBS na wytrząsarce laboratoryjnej. Wyjmij PBS i zamontuj ogniwa za pomocą nośnika montażowego.

Ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe na podłoże montażowe, aby nie osadzały się pęcherzyki powietrza. Odczekaj co najmniej trzy godziny, aż podłoże montażowe stwardnieje przed analizą komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Na koniec przeanalizuj ogniska gamma-H2AX i 53BP1 w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla DAPI, Alexa 488 i Cy3 podczas obrazowania przy 100-krotnym powiększeniu obiektu.

Analiza ognisk gamma-H2AX w komórkach jest najdokładniejsza w fazie G0, G1 i fazie G2, gdy ogniska gamma-H2AX pojawiają się jako wyraźne kropki fluorescencyjne, jak pokazano na tym reprezentatywnym obrazie fibroblastów. Natomiast analiza ognisk gamma-H2AX w komórkach w fazie S jest skomplikowana przez rozproszone panjądrowe plamki gamma-H2AX spowodowane procesem replikacji. Barwienie immunofluorescencyjne gamma-H2AX zastosowano do ilościowego określenia pęknięć dwuniciowych DNA w napromienianych tkankach i wyjaśniono, że poziomy ognisk gamma-H2AX w napromienianych limfocytach są proporcjonalne do dawki napromieniowania.

Kolokalizacja ognisk gamma-H2AX i 53BP1 w komórkach CD34-dodatnich pacjenta z ostrą białaczką szpikową wskazuje na promowanie niehomologicznych mechanizmów naprawy połączeń końcowych za pośrednictwem 53BP1 w miejscach pęknięć podwójnej nici DNA. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać mikroskopię immunofluorescencyjną gamma-H2AX i 53BP1 w celu analizy pęknięć podwójnej nici DNA. Po tej procedurze w komórkach nowotworowych można przeprowadzić inne metody, takie jak immunoblotting ATM związanego z fosforem, ATR, kinaza punktu kontrolnego pierwszego, kinaza punktu kontrolnego 2 i TP53 w komórkach nowotworowych w celu analizy zmian odpowiedzi na uszkodzenie DNA.