Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D
2 kwietnia 2018
Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.
Ogólnym celem tej procedury jest stworzenie niestandardowych form do wysiewu komórek, które służą do tworzenia samodzielnie składających się pierścieni tkankowych o różnych wymiarach. Ta metoda pozwala nam tworzyć trójwymiarowe pierścienie tkankowe z komórek ludzkich, które można wykorzystać do oceny struktury, wytrzymałości i funkcji tkanki. Podstawową zaletą tej techniki jest to, że jest to prosta metoda wytwarzania form do samodzielnego składania tkanek o niestandardowych wymiarach.
Aby rozpocząć procedurę, użyj oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo, aby stworzyć rysunek formy w żądanych wymiarach. Wyślij plik CAD do drukarki 3D o wysokiej rozdzielczości. Wydrukuj formę w plastiku z błyszczącym wykończeniem, które jest stabilne w temperaturze 50 stopni Celsjusza.
Dokładnie umyj wydrukowaną formę za pomocą pędzla, detergentu i wody. Opłucz formę wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na stojaku. Ważne jest, aby wybrać tworzywo sztuczne wydrukowane w 3D, które jest stabilne w temperaturze utwardzania PDMS.
Pozostałości, które przenoszą się na PDMS podczas ogrzewania, mogą wpływać na tworzenie pierścieni. Następnie odmierz 25 gramów bazy PDMS w jednorazowej łódce do ważenia. Dodaj utwardzacz w stosunku wagowym 1:10 i energicznie mieszaj, aż baza i utwardzacz dokładnie się wymieszają.
Następnie przymocuj taśmę laboratoryjną po bokach formy, aby utworzyć ścianę o wysokości około jednego centymetra wokół twarzy z wydrukowanymi dołkami. Upewnij się, że w ściance taśmy nie ma żadnych szczelin. Wlej mieszaninę PDMS do formy wydrukowanej w 3D.
Odgazuj PDMS w komorze próżniowej przez 30 do 60 minut lub do momentu, gdy nie pozostaną żadne pęcherzyki. Utwardź PDMS w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez dwie do czterech godzin lub do momentu, gdy PDMS będzie wystarczająco twardy, aby można go było usunąć z formy. Następnie usuń taśmę i ostrożnie oddziel negatyw PDMS od formy.
Inkubuj ujemny PDMS w piekarniku w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez godzinę, aby upewnić się, że jest w pełni utwardzony. Następnie dokładnie umyj negatyw detergentem i wodą. Opłucz formę wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.
Przed wykonaniem formy agarozowej należy w autoklawie negatyw, parę kleszczy i wszelkie inne pożądane narzędzia. Aby rozpocząć produkcję, przygotuj i autoklaw co najmniej 50 mililitrów dwuprocentowej agarozy w DMEM. Przygotuj studzienki agarozowe na dzień przed siewem pierścieniowym.
Odpipetować cztery mililitry stopionej agarozy do autoklawowanego negatywu PDMS, uważając, aby nie przepełnić formy. Następnie odpipetować stopioną agarozę do zagłębień w studzienkach agarozy. Użyj końcówki pipety, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.
Ostateczna powierzchnia agarozy musi być płaska. Pozostaw agarozę do ostygnięcia na około 10 minut. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie oddzielić schłodzoną formę agarozową od negatywu PDMS.
Umieść formę stroną zadrukowaną do góry w jednym dołku na płycie sześciodołkowej. Dodać odpowiednią kompletną pożywkę hodowlaną do dołka na płytkę, tak aby studzienki agarozowe były całkowicie zanurzone. Zrównoważ studzienki agarozowe w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przed użyciem.
Najpierw, w 15-centymetrowym naczyniu hodowlanym, hoduj komórki mięśni gładkich aorty szczura w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5 procent dwutlenku węgla, aż do osiągnięcia 70 procent konfluencji. Po przygotowaniu i zrównoważeniu pożądanej formy agarozy w ciągu nocy, dwukrotnie przepłucz naczynie hodowlane pięcioma mililitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanami. Po usunięciu PBS dodaj do naczynia trzy mililitry 0,25 procent trycyny.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie do trzech minut lub do momentu, gdy komórki wyjmą się z naczynia. Zneutralizować trypcynę trzema mililitrami kompletnej pożywki hodowlanej. Przenieś komórki do stożkowej probówki i delikatnie pipetuj komórki, aż do całkowitego zawieszenia.
Rozcieńczyć zawiesinę komórek równą objętością barwnika błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Następnie odwirować zawiesinę w temperaturze 200 razy G przez pięć minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w kompletnej pożywce hodowlanej, aby osiągnąć stężenie 10 milionów komórek na mililitr.
Najważniejszymi krokami zapewniającymi spójne tworzenie pierścieni jest optymalizacja liczby komórek i pożywki hodowlanej dla używanej linii komórkowej. Następnie uzyskaj zrównoważone studzienki agarozowe. Ostrożnie zassać całe podłoże zarówno z zewnętrznej strony agarozy, jak i z wnętrza studzienek agarozowych, uważając, aby nie przebić dna studzienek.
Odpipetować 50 mikrolitrów zawiesiny komórek do każdej studzienki. Dodaj dwa mililitry świeżej pożywki na zewnątrz studzienek agarozowych, nie pozwalając, aby pożywka rozlała się do studzienek. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięcioprocentowej atmosferze CO2, aby umożliwić agregację komórek.
Następnie odessać pożywkę spoza agarozy. Dodaj 4,5 mililitra świeżej pożywki do dołka na płytkę, aby dołki agarozy zostały napełnione, a cała forma agarozy była całkowicie zanurzona. Kontynuuj inkubację płytki, aż pierścienie tkankowe będą wystarczająco rozwinięte, wymieniając pożywkę każdego dnia.
Następnie delikatnie zsuń każdy pierścień tkankowy z jego słupka za pomocą kleszczy. Natychmiast zamocuj pierścienie do histologii lub użyj pierścieni do oceny funkcjonalnej lub mechanicznej. Druk 3D pozwolił na bardziej elastyczne projektowanie form.
Średnice słupków można było łatwo zmieniać, jak pokazano moje pierścienie komórek mięśni gładkich szczura wykonane wokół słupków o średnicy dwóch, czterech i dwunastu milimetrów. Pierścienie tkankowe zostały również przygotowane z pierwotnych ludzkich SMC, ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych oraz SMC pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Pierścienie wykorzystano jako modele tkanek in vitro do oceny funkcji tkanek i wytrzymałości mechanicznej.
Chociaż metoda ta została pierwotnie zaprojektowana do wytwarzania i modelowania tkanki naczyniowej, może być również stosowana do wytwarzania segmentów innych typów tkanek, takich jak chrząstki, mięśnie szkieletowe i tkanka sercowa. Ta metoda zapewnia naukowcom prosty sposób tworzenia niestandardowych form do wytwarzania pierścieni tkankowych 3D o różnych wymiarach. Pierścienie te mogą być wykorzystywane do oceny struktury, właściwości mechanicznych i funkcji tkanek inżynieryjnych wykonanych z różnych typów komórek.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę tworzenia samoorganizujących się pierścieni tkankowych o różnych rozmiarach przy użyciu niestandardowej formy wydrukowanej w technologii 3D. Proces obejmuje wykonanie negatywów z PDMS oraz odlewanie agarozy w celu utworzenia studzienek do agregacji komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Inżynieria tkankowa
- Hodowla komórkowa
- Druk 3D
Wstęp
- Samoorganizujące się pierścienie tkankowe mogą być wykorzystywane do badania struktury i funkcji tkanek.
- Druk 3D umożliwia tworzenie dostosowanych projektów form.
- Technikę tę można zastosować do różnych typów tkanek, w tym do tkanek naczyniowych i sercowych.
- Optymalizacja liczby komórek oraz warunków hodowli jest kluczowa dla pomyślnego uformowania pierścienia tkankowego.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody wytwarzania pierścieni tkankowych o określonych wymiarach.
- Ocena właściwości mechanicznych i funkcjonalności inżynieryjnych tkanek.
- Zapewnienie platformy do badania różnych typów komórek w inżynierii tkankowej.
Zastosowane metody
- Projektowanie form przy użyciu oprogramowania CAD i ich druk 3D ze stabilnego tworzywa sztucznego.
- Tworzenie negatywów z PDMS oraz dołków z agarozy do wysiewania komórek.
- Wysiewanie komórek do dołków z agarozy i umożliwienie im agregacji w pierścienie tkankowe.
- Ocena powstałych pierścieni tkankowych pod kątem właściwości strukturalnych i funkcjonalnych.
Główne wyniki
- Z różnych typów komórek, w tym z ludzkich komórek mięśni gładkich, pomyślnie uformowano pierścienie tkankowe.
- Metoda wykazała elastyczność w zakresie projektowania form oraz wytwarzania tkanek.
- Pierścienie wykorzystano do ocen in vitro funkcji tkankowej oraz wytrzymałości mechanicznej.
- Różne wymiary pierścieni tkankowych uzyskano poprzez zmianę średnic trzpieni w formach.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia prosty i skuteczny sposób tworzenia niestandardowych pierścieni tkankowych.
- Można go dostosować do różnych zastosowań w inżynierii tkankowej.
- Technika ta usprawnia badanie tkanek inżynieryjnych oraz ich właściwości.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym generowaniey dostosowanych do potrzeb, wolnych od rusztowań pierścieni tkankowych do modelowania przedklinicznego, co wspomaga mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów na leki. Poprzez zapewnienie precyzyjnej kontroli nad wymiarami i składem tkanki, zwiększa ona pewność prognostyczną w procesach walidacji celów terapeutycznych oraz opracowywania testów na wczesnym etapie. Podejście to ogranicza zależność od systemów opartych na rusztowaniach, co poprawia relewantność translacyjną w zastosowaniach związanych z przesiewaniem leków oraz modelowaniem chorób.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zastosowanie samoorganizujących się pierścieni tkankowych, co pozwala wyjaśnić funkcjonalność szlaków i stopień zaangażowania celu.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie powtarzalnego systemu oceny modulacji celu w kontekście tkanki 3D.
- Wartość predykcyjna: Usprawnia selekcję projektów w portfolio dzięki generowaniu wyników funkcjonalnych, które korelują z odpowiedziami tkanek na zastosowane związki.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na wytwarzanie standaryzowanych, wolnych od rusztowań pierścieni tkankowych, odpowiednich do ilościowej oceny wpływu związków na mechanikę i funkcje tkanek.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnemu tworzeniu studzienek agarozowych, co ogranicza zmienność w późniejszych kampaniach przesiewowych.
- Skalowalność: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy dla wielu typów komórek i modeli tkankowych, wspierając efektywne kaskady oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez tworzenie pierścieni tkankowych, które naśladują strukturę oraz właściwości mechaniczne tkanki natywnej.
- System istotny dla chorób: Wspiera modelowanie tkanek naczyniowych, serca, mięśni szkieletowych i chrząstki z wykorzystaniem pierwotnych źródeł komórkowych lub komórek pochodnych z komórek macierzystych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza funkcjonalnych i histologicznych punktów końcowych, które pozwalają na podjęcie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) przed rozpoczęciem badań in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych, umożliwiając tworzenie tkanek w oparciu o postawione hipotezy, co z kolei wspiera identyfikację wiodących kandydatów poprzez fenotypowanie funkcjonalne i mechaniczne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera minimalizację ryzyka mechanistycznego, umożliwiając zespołom ocenę tworzenia, wytrzymałości i funkcji tkanek zależnych od celu w kontrolowanym środowisku 3D.
- Screening: Dostarcza pierścienie tkankowe gotowe do analizy o spójnych wymiarach, co umożliwia niezawodny screening związków pod kątem fenotypów na poziomie tkankowym.
- Analityka: Dostarcza ilościowe wyniki, w tym średnicę tkanki, siłę skurczu oraz markery histologiczne do analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do zastosowań przedklinicznych poprzez generowanie modeli tkankowych przydatnych do oceny mechanicznej, funkcjonalnej i histologicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Pozycjonuje proces z wykorzystaniem formy drukowanej w 3D jako platformę wielokrotnego użytku do generowania różnorodnych pierścieni tkankowych w ramach różnych projektów i typów komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w interakcjach tkanka-cel.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki możliwości dostosowania procesu produkcji form o niskiej wariancji.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając szybką iterację modeli tkankowych bez artefaktów związanych z rusztowaniem.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wczesnych danych funkcjonalnych dotyczących modeli inżynierii tkankowej.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu CAD, druku 3D oraz sterylnych technik hodowli tkanek.
- Wymaga dostępu do drukarki 3D zdolnej do wytwarzania gładkich, termostabilnych elementów plastikowych oraz standardowego sprzętu do przygotowania PDMS/agarozy.
- Wymaga standaryzacji parametrów projektowania form, gęstości zasiewu komórek i warunków hodowli w ramach zespołów w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy stosowaniu metody dla różnych typów komórek lub tkanek docelowych, w szczególności w odniesieniu do stężenia agarozy i średnicy słupka.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność precyzyjnego formowania agarozy w celu uniknięcia deformacji studzienek oraz znaczenie optymalizacji liczby komórek na studzienkę dla uzyskania spójnej formacji pierścieni.
