Name: Spożycie fluorescencyjnych, magnetycznych nanocząstek w celu określenia zdolności wchłaniania płynów przez owady (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Poznaj metodę oceny pobierania płynów przez owady za pomocą fluorescencyjnych nanocząstek magnetycznych. Technika ta pozwala badać mechanizmy karmienia i strukturę aparatu gębowego u muchówek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez grant National Science Foundation (NSF) nr. IOS 1354956. Dziękujemy dr Andrew D. Warrenowi (McGuire Center for Lepidoptera and Biodiversity, Florida Museum of Natural History, University of Florida) za zgodę na wykorzystanie zdjęć motyli.

1. Gatunki owadów, przygotowanie roztworów i konfiguracja stacji żywienia
UWAGA: Motyle kapuściane (Pieris rapae L., Pieridae) zostały wybrane jako gatunki reprezentatywne dla Lepidoptera, ponieważ były używane w poprzednich badaniach nad zdolnościami pobierania płynów i morfologią aparatu gębowego22,23. Muchy domowe (Musca domestica L., Muscidae) i muchy butelkowe (Calliphora vomitoria L., Calliphoridae) są używane, ponieważ często obserwuje się je żerujące na porowatych powierzchniach13.
<ol>
	<li>Zamów P. rapae jako larwy u dostawcy owadów i hoduj je na sztucznej diecie (patrz Tabela Materiałów) do momentu, aż przepoczwarzą się i pojawią się jako dorosłe osobniki w komorze środowiskowej ustawionej na 23 °C i fotoperiod 18L:6D. Zamówienie M. domestica i C. vomitoria jako poczwarki i hodują je w tych samych warunkach środowiskowych co P. rapae. Nie karm dorosłych motyli i much po ich wyłonieniu się z poczwarek przed eksperymentami żywieniowymi.</li>
	<li>Przygotuj 20% roztwór sacharozy (kontrola) i 20% roztwór nanocząstek sacharozy, aby przetestować wchłanianie płynów. Przygotuj roztwór nanocząstek, dodając fluorescencyjne nanocząstki magnetyczne (tlenek żelaza z powłoką z kwasu poliakrylowego, o średnicy około 20 nm)24 do 20% roztworu sacharozy (1 mg/ml dH2O nanocząstki z 20% roztworem sacharozy, 1:1). Przygotować 1x roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10x rozcieńczony do 1x w dH2O, pH 7,4), który jest używany do sekcji.</li>
	<li>Ustaw stację karmienia, która składa się z ręcznego manipulatora z zaciskiem i oddzielnego stolika do karmienia (płaska platforma) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Umieść wklęsłe szkiełko na etapie karmienia i umieść w pobliżu nylonowe filtry siatkowe o średnicy porów 11, 20, 30, 41 lub 60 μm oraz filtry membranowe o średnicy porów 1, 5, 8 lub 10 μm w pobliżu do eksperymentów żywieniowych.</li>
</ol>
2. Protokół żywienia
<ol>
	<li>Zawiń ciała, nogi i skrzydła owadów w złożoną bibułkę. Ustaw owada tak, aby odsłonięta była tylko głowa i aparat gębowy. Umieść skrzydła owada między dwoma szkiełkami mikroskopowymi, które są trzymane razem przez zacisk na manipulatorze tak, aby owad był zawieszony nad etapem żerowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Podać 30 μl kropli 20% roztworu sacharozy lub 20% roztworu nanocząstek sacharozy za pomocą mikropipety do środka wklęsłego szkiełka. Umieść pojedynczą bibułę filtracyjną o określonej wielkości porów na wklęsłym szkiełku tak, aby środek bibuły filtracyjnej był wyrównany z kroplą roztworu nanocząstek. Kontakt kropli z bibułą filtracyjną powoduje, że roztwór rozprowadza się wzdłuż bibuły filtracyjnej, wypełniając pory (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
	UWAGA: Bibułę filtracyjną umieszcza się na kropli, a nie na odwrót, aby zminimalizować potencjalną obecność nanocząstek na bibułie filtracyjnej, w której żerują owady.</li>
	<li>Ustaw owada za pomocą manipulatora tak, aby tylko dystalne obszary aparatu gębowego mogły stykać się ze zwilżoną bibułą filtracyjną na etapie karmienia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Użyj szpilki do owadów, aby wysunąć aparat gębowy na bibułę filtracyjną i pozwól owadowi żerować przez 45 sekund.</li>
	<li>Aby zminimalizować ryzyko żerowania owadów na płynnych foliach, które mogą znajdować się na powierzchni bibuły filtracyjnej, należy ustawić aparaty gębowe tak, aby stykały się z częścią bibuły filtracyjnej, która dotyka płaskiej części szkiełka (tj. nie bezpośrednio nad wklęsłą częścią szkiełka). Jeśli owad nie wyrazi zainteresowania karmieniem, aparat gębowy można przytrzymać do bibuły filtracyjnej za pomocą szpilki do owadów na czas karmienia.</li>
</ol>
3. Sekcje
<ol>
	<li>Umieść roztwór PBS w szkiełku zegarkowym o średnicy 50 mm, tak aby roztwór był wystarczający do pokrycia ciała owada. Umieść szkiełko zegarka pod stereoskopem i umieść sprzęt do preparowania owadów (sprężynowe nożyczki do mikrosekcji, szpilki do owadów, cienkie kleszcze preparacyjne) obok stereoskopu.</li>
	<li>Po karmieniu wyjmij owada z bibuły i trzymaj go z zamkniętymi skrzydłami. Usuń głowę, nogi i skrzydła owada za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania i umieść owada w roztworze PBS w szkiełku zegarka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>W razie potrzeby znieczulij owady przed sekcjami. Użyj kleszczy, aby przytrzymać owada za naskórek w pobliżu dystalnej części brzucha. Ręką dominującą użyj sprężynowych nożyczek do mikropreparowania, aby przeciąć naskórek w kierunku przednim wzdłuż bocznej strony brzucha, zaczynając od tylnego końca, aż do osiągnięcia klatki piersiowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby upewnić się, że przecięty jest tylko naskórek i że przewód pokarmowy wewnątrz owada nie jest uszkodzony (Rysunek 2).</li>
	<li>Wykonaj dodatkowe nacięcia naskórka nożyczkami preparacyjnymi, aby otworzyć brzuch i odsłonić przewód pokarmowy w środku (<silna klasa = "xfig">Ryc. 2). Usuń naskórek brzucha, ciało tłuszczowe i inne struktury za pomocą szpilek przeciw owadom i przenieś je na zewnątrz szkła zegarka w celu późniejszego usunięcia, pozostawiając tylko klatkę piersiową i przewód pokarmowy w szkiełku zegarka. 
	UWAGA: Sekcja ujawni plon, który jest strukturą przypominającą worek (przedłużenie przewodu pokarmowego) znajdującą się w pobliżu połączenia klatki piersiowej i brzucha.</li>
	<li>Jeśli uprawa nie jest odsłonięta, wykonaj nożyczkami dodatkowe nacięcia w klatce piersiowej, aż plon zostanie odsłonięty. Gdy uprawa jest widoczna, odetnij pozostałe części owada, pozostawiając tylko przewód pokarmowy z plonem w szkiełku zegarka (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2). 
	UWAGA: Roślina z rzędu Lepidoptera jest prawie przezroczysta i ma charakter podobny do celofanu, co może być trudne do rozpoznania, jeśli nie jest wypełniona płynami i nie rozszerza się lub jeśli zostanie przecięta podczas sekcji.</li>
	<li>Użyj cienkich kleszczy preparacyjnych, aby umieścić uprawę na szkiełku nakrywkowym (24 mm x 24 mm) w celu późniejszego obrazowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Oznaczanie spożytych nanocząstek
<ol>
	<li>Umieść uprawę na szkiełku nakrywkowym za pomocą cienkich kleszczy preparacyjnych, uważając, aby nie dopuścić do pęknięcia plonu. Użyj kanału CY3 (lub kontrastu fazowego) w odwróconym mikroskopie konfokalnym do obrazowania w 20-krotnym powiększeniu. Zobrazuj uprawę natychmiast po rozcięciu, aby zapobiec jej wyschnięciu.</li>
	<li>Mieszadło magnetyczne (41.3 mm długości i 8 mm średnicy) trzymać w dłoni, która nie kontroluje etapu operacyjnego mikroskopu. Machaj mieszadłem magnetycznym w przód i w tył w pobliżu uprawy (około 10 mm odległości od uprawy), tak aby każdy ruch w przód iw tył trwał około jednej sekundy (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Podczas gdy mieszadło magnetyczne jest potrząsane, sprawdź uprawę pod kątem nanocząstek. Powoli przesuwaj stopień operacyjny do przodu i do tyłu, patrząc przez soczewkę okularową mikroskopu pod kątem ruchu nanocząstek wewnątrz prawie przezroczystej uprawy. Jeśli nanocząstki są obecne w uprawie, co wskazuje na pozytywne karmienie, zareagują i będą falować zgodnie z mieszadłem magnetycznym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
</ol>

<ol><li>Vijaysegaran, S., Walter, G. H., Drew, R. A. I. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/aesa/article-abstract/90/2/184/28469/Mouthpart-Structure-Feeding-Mechanisms-and-Natural">Mouthpart structure, feeding mechanisms, and natural food sources of adult Bactrocera (Diptera: Tephritidae).</a> Ann Entomol Soc Am. 90, 184-201 (1997).</li>
<li>Lehnert, M. S., Monaenkova, D., Andrukh, T., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrophobic-hydrophilic+dichotomy+of+the+butterfly+proboscis%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Hydrophobic-hydrophilic dichotomy of the butterfly proboscis.</a> J R Soc Interface. 10, 1-10 (2013).</li>
<li>Zhao, J., Wu, J., Yan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erection+mechanism+of+glossal+hairs+during+honeybee+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+biol%22%5BJournal%5D)">Erection mechanism of glossal hairs during honeybee feeding.</a> J Theor biol. 386, 62-68 (2015).</li>
<li>Redak, R. A., Purcell, A. H., Lopes, J. R. S., Blua, M. J., Mizell, R. F. 3rd, Andersen, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+xylem+fluid-feeding+insect+vectors+of+Xylella+fastidiosa+and+their+relation+to+disease+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Review+Entomol%22%5BJournal%5D)">The biology of xylem fluid-feeding insect vectors of Xylella fastidiosa and their relation to disease epidemiology.</a> Ann. Review Entomol. 49, 243-270 (2004).</li>
<li>Büttiker, W., Krenn, H. W., Putterill, J. F. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF02526872">The proboscis of eye-frequenting and piercing Lepidoptera (Insecta).</a> Zoomorphology. 116, 77-83 (1996).</li>
<li>Light, J. E., Smith, V. S., Allen, J. M., Durden, L. A., Reed, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+mammalian+sucking+lice+%28Phthiraptera%3A+Anoplura%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of mammalian sucking lice (Phthiraptera: Anoplura).</a> BMC Evol Biol. 10, (2010).</li>
<li>Krenn, H. W., Aspock, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form%2C+function+and+evolution+of+the+mouthparts+of+blood-feeding+Arthropoda%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Form, function and evolution of the mouthparts of blood-feeding Arthropoda.</a> Arthropod Struct Dev. 41, 101-118 (2012).</li>
<li>Lehnert, M. P., Pereira, R. M., Koehler, P. G., Walker, W., Lehnert, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Cimex+lectularius+using+heat+combined+with+dichlorvos+resin+strips%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Vet+Entomol%22%5BJournal%5D)">Control of Cimex lectularius using heat combined with dichlorvos resin strips.</a> Med Vet Entomol. 25, 460-464 (2011).</li>
<li>Zaspel, J. M., Kononenko, V. S., Goldstein, P. Z. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10905-007-9090-3">Another blood feeder? Experimental feeding of a fruit-piercing moth species on human blood in the Primorye Territory of far eastern Russia (Lepidoptera: Noctuidae: Calpinae).</a> J Insect Behav. 20, 437-451 (2007).</li>
<li>Barth, F. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarth%2C+FG+%22Insects+and+flowers%3A+the+biology+of+a+partnership%22">Insects and flowers: the biology of a partnership</a>. , Princeton University Press. Princeton. (1991).</li>
<li>Foil, L. D., Adams, W. V., McManus, J. M., Issel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bloodmeal+residues+on+mouthparts+of+Tabanus+fuscicostatus+%28Diptera%3A+Tabanidae%29+and+the+potential+for+mechanical+transmission+of+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Bloodmeal residues on mouthparts of Tabanus fuscicostatus (Diptera: Tabanidae) and the potential for mechanical transmission of pathogens.</a> J Med Entomol. 24, 613-616 (1987).</li>
<li>Monaenkova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butterfly+proboscis%3A+combining+a+drinking+straw+with+a+nanosponge+facilitated+diversification+of+feeding+habits%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Butterfly proboscis: combining a drinking straw with a nanosponge facilitated diversification of feeding habits.</a> J R Soc Interface. 9, 720-726 (2012).</li>
<li>Lehnert, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouthpart+conduit+sizes+of+fluid-feeding+insects+determine+the+ability+to+feed+from+pores%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Mouthpart conduit sizes of fluid-feeding insects determine the ability to feed from pores.</a> Proc. R. Soc. B. 284, (2017).</li>
<li>Grimaldi, D., Engel, M. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrimaldi%2C+D+%22Evolution+of+the+insects%22">Evolution of the insects</a>. , Cambridge University Press. New York, NY. (2005).</li>
<li>Adler, P. H., Foottit, R. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAdler%2C+PH+%22Insect+biodiversity%3A+science+and+society%22">Insect biodiversity: science and society</a>. , Wiley Blackwell. Chichester, UK. (2009).</li>
<li>Tsai, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+artificial+proboscis+for+probing+minute+amount+of+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoporous artificial proboscis for probing minute amount of liquids.</a> Nanoscale. 3, (2011).</li>
<li>Krenn, H. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004350050053">Proboscis sensilla in Vanessa cardui (Nympahlidae, Lepidoptera): Functional morphology and significance of flower-probing.</a> Zoomorphology. 118, 23-30 (1998).</li>
<li>Plateau, J. A. F. Experimental and theoretical researches on the figures of equilibrium of liquid mass withdrawn from the action of gravity. (Transl). <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/14786445708642346">Annual Report of the Board Regents Smithsonian Institution</a>. , Government Printing Office. Washington, DC. 207-285 (1863).</li>
<li>Socha, J. J., Westneat, M. W., Harrison, J. F., Waters, J. S., Lee, W. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+phase-contrast+x-ray+imaging%3A+a+new+technique+for+the+study+of+animal+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time phase-contrast x-ray imaging: a new technique for the study of animal form and function.</a> BMC Biol. 5, 6(2007).</li>
<li>Westneat, M. W., Socha, J. J., Lee, W. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+biological+structure%2C+function+and+physiology+using+synchrotron+x-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Advances in biological structure, function and physiology using synchrotron x-ray imaging.</a> Annu Rev Physiol. 70, 119-142 (2008).</li>
<li>Lee, W. -K., Socha, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+hemolymph+flow+in+the+heart+of+a+grasshopper+%28Schistocerca+americana%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of hemolymph flow in the heart of a grasshopper (Schistocerca americana).</a> BMC Physiology. 9, 2(2009).</li>
<li>Lehnert, M. S., Mulvane, C. P., Brother, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouthpart+separation+does+not+impede+butterfly+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Struct+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouthpart separation does not impede butterfly feeding.</a> Arthropod Struct Dev. 43, 97-102 (2014).</li>
<li>Lehnert, M. S., Beard, C. E., Gerard, P. D., Kornev, K. G., Adler, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+lepidopteran+proboscis+in+relation+to+feeding+guild%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Structure of the lepidopteran proboscis in relation to feeding guild.</a> J Morphol. 277, 167-182 (2016).</li>
<li>Yan, H., Sung, B., Kim, M. -H., Kim, C. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1591/1/4/045032">A novel strategy for functionalizable photoluminescent magnetic nanoparticles.</a> Mater. Res. Express. 1, 045032(2014).</li>
<li>Kingsolver, J. G., Daniel, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanics+and+energetics+of+nectar+feeding+in+butterflies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">On the mechanics and energetics of nectar feeding in butterflies.</a> J Theor Biol. 76, 167-179 (1979).</li>
<li>Krenn, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding+mechanisms+of+adult+Lepidoptera%3A+Structure%2C+function%2C+and+evolution+of+the+mouthparts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Feeding mechanisms of adult Lepidoptera: Structure, function, and evolution of the mouthparts.</a> Ann Rev Entomol. 55, 307-327 (2010).</li>
<li>Tsai, C. -C., Monaenkova, D., Beard, C. E., Adler, P. H., Kornev, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradox+of+the+drinking-straw+model+of+the+butterfly+proboscis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Paradox of the drinking-straw model of the butterfly proboscis.</a> J Exp Biol. 217, 2130-2138 (2014).</li>
<li>Bauder, J. A. S., Handschuh, S., Metscher, B. D., Krenn, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+morphology+of+the+feeding+apparatus+and+evolution+of+proboscis+length+in+metalmark+butterflies+%28Lepidoptera%3A+Riodinidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+J+Linn+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional morphology of the feeding apparatus and evolution of proboscis length in metalmark butterflies (Lepidoptera: Riodinidae).</a> Biol J Linn Soc. 110, 291-304 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Funkcjonalność aparatu gębowego owadów jest historycznie wnioskowana z badań morfologii ogólnej (np. funkcjonalność trąbki lepidoptera związana ze słomką do picia25,26); Jednak ostatnie badania, które uwzględniają dowody eksperymentalne, spowodowały zmianę paradygmatu w naszym rozumieniu złożoności aparatu gębowego owadów i relacji struktura-funkcja 2,12,13,22,27.</su...

Wiele grup owadów ma aparaty gębowe (trąbki) przystosowane do żywienia się płynami, takimi jak nektar, gnijące owoce, przepływy soków (np. Diptera1, Lepidoptera2, Hymenoptera3), ksylem (Hemiptera4), łzy (Lepidoptera5) i krew (Phthiraptera6, Siphonaptera7, Diptera7, Hemiptera8, Lepidoptera9). Zdolność owadów do odżywiania się płynami jest istotna dla zdrowia ekosystemu (np. zapylanie10), przenoszenie chorób4,11, biodywersyfikacja2,12, oraz badania ewolucji konwergentnej13. Pomimo dużej różnorodności źródeł pożywienia, cechą niektórych owadów żywiących się płynami jest zdolność do pozyskiwania niewielkich ilości płynów, które mogą być ograniczone do kropelek o rozmiarach mikro lub nano, płynnych filmów lub porowatych powierzchni.
Biorąc pod uwagę ogromną różnorodność owadów żywiących się płynami (ponad 20% wszystkich gatunków zwierząt14,15) oraz ich zdolność do odżywiania się różnymi źródłami pożywienia, zrozumienie ich zachowań żywieniowych i mechanizmów pobierania płynów jest ważne w wielu dziedzinach. Na przykład funkcjonalność aparatu gębowego owadów odegrała rolę w rozwoju technologii biomimetycznej, np. urządzeń mikroprzepływowych, które mogą wykonywać takie zadania, jak pozyskiwanie niewielkich ilości płynów przy użyciu metod podobnych do tych stosowanych przez owady16. Podstawowym problemem w badaniach nad mechanizmami wchłaniania płynów jest jednak nie tylko ustalenie, w jaki sposób owady żywią się płynami, ale także uzyskanie dowodów eksperymentalnych, które potwierdzają ten mechanizm. Używanie wyłącznie zachowania (np. sondowanie za pomocą trąby12,17) jako wskaźnika żerowania jest niewystarczające, ponieważ nie potwierdza pomyślnego pobierania płynów ani nie zapewnia środków do określenia trasy, którą płyny przemieszczają się podczas przechodzenia przez owada. Ponadto przeprowadzanie eksperymentów z małymi ilościami płynów lepiej odzwierciedla naturalne scenariusze żywienia, w których płyny są zasobem ograniczającym2,12.
Rentgenowskie obrazowanie z kontrastem fazowym zostało użyte z motylem Monarch (Danaus plexippus L.), aby ocenić, jak motyle żywią się małymi ilościami płynów z porowatych powierzchni12. Motyle monarchy wykorzystują działanie kapilarne przez przestrzenie między wypustkami kutykularnymi (grzbietowymi legulae) wzdłuż trąbki, aby wprowadzić płyny ograniczone do małych porów do kanału pokarmowego. Napływające płyny tworzą film na ścianie kanału pokarmowego, który rośnie i zapada się w płynny mostek przez niestabilność plateau12,18, który jest następnie transportowany do jelita motyla przez działanie pompy ssącej w głowie. Chociaż obrazowanie z kontrastem fazowym rentgenowskim jest optymalnym narzędziem do wizualizacji przepływu płynów wewnątrz owadów12,19,20,21, technika ta nie jest łatwo dostępna i potrzebna jest wygodniejsza metoda do szybkiej oceny zdolności owadów do pobierania płynów i ich spożywania.
Aby ustalić, czy mechanizm karmienia D. plexippus dotyczy innych Lepidoptus, a także much (Diptera) (obie grupy żywią się płynami z porowatych powierzchni), Lehnert et al.13 zastosował technikę oceny zdolności owadów do żerowania na małych ilościach płynów z porowatych powierzchni, która jest szczegółowo opisana tutaj. Chociaż przedstawiony tutaj protokół dotyczy badań, w których wykorzystuje się mokre i porowate powierzchnie, metodologia może zostać zmieniona w przypadku innych badań, takich jak te dotyczące mechanizmów odżywiania się w basenie. Ponadto zastosowania obejmują inne dziedziny, w tym mikrofluidykę i technologię inspirowaną biologią.

<table><tbody><tr><td>20% roztwór sacharozy</td><td>Cukier</td><td></td> Domino <td>Cukier potrzebny do wytworzenia roztworu sacharozy z dH2O</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10X stężenie rozcieńczone do 1X w dH2O do sekcji owadów</td></tr><tr><td>Suwak wklęsły z pojedynczym wgłębieniem</td> Suwak <td>AmScope</td><td>BS-C6</td><td>jest niezbędny do konfiguracji</td></tr> <tr>etapu karmienia<td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>NY6004700 (60 &micro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>NY4104700 (41 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>NY3004700 (30 &mikro; m)</td> <td>Nylonowe filtry siatkowe i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>NY2004700 (20 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania</td></tr> owadów <tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700 (11 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>TCTP04700 (10 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>TETP04700 (8 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>TMTP04700 (5 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>EMD Millipore</td><td>RTTP04700 (1 &mikro; m)</td> <td>Filtry z siatki nylonowej i filtry izoporowe potrzebne do wytworzenia porowatej powierzchni do żerowania owadów</td></tr><tr><td>Nożyczki do mikropreparowania tęczówki</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>623555</td><td>Nożyczki używane do preparacji</td></tr><tr><td>Szpilki do owadów</td> <td>Produkty Bioquip</td><td>1208B1</td><td>Szpilki używane podczas sekcji i prób karmienia</td></tr><tr><td>Bardzo cienkie kleszcze preparacyjne</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>624684</td><td>Sprzęt do preparacji</td></tr><tr><td>Leica M205 C Stereoskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205 C</td><td>Stereoskop używany do sekcji</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>Mikroskop fluorescencyjny używany do wykrywania nanocząstek magnetycznych</td></tr><tr><td>Fisherbrand PTFE Jednorazowy pręt</td> mieszający <td>Fisherscientific</td><td>S68067</td><td>Magnes używany do wykrywania nanocząstek</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34155</td><td>Chusteczki używane do zabezpieczania owadów podczas prób karmienia</td></tr><tr><td>Poczwarki muchy domowej (Musca domestica)</td><td>Mantisplace.com</td><td></td><td>owadów do eksperymentów</td></tr><tr><td>Poczwarki muchy butelkowej niebieskiej (Calliphora vomitoria)</td><td>Mantisplace.com</td><td></td><td>owadów do eksperymentów</td></tr><tr><td>Larwy motyla kapuścianego (Pieris rapae) Carolina</td><td>Biological Supply Company</td><td>144102</td><td>owady do eksperymentów</td></tr><tr><td>Finnpipette F1&nbsp;</td><td>Mikropipeta ThermoFisher Scientific</td><td>4641080N</td><td>do dozowania płynów Końcówki</td></tr><tr><td>do pipet Finntip 250</td><td>Końcówki do mikropipet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9400250</td></tr><tr><td>Mikroskop Szkiełka nakrywkowe szklane (=szkiełka nakrywkowe) (24 x 24 mm)</td>Szkiełka nakrywkowe <td>AmScope</td><td>CS-S24-100</td><td>do oglądania plonu owada pod mikroskopem konfokalnym</td></tr></tbody></table>

spożycie fluorescencyjnych, magnetycznych nanocząstek w celu określenia zdolności wchłaniania płynów przez owady

The Ingestion of Fluorescent, Magnetic Nanoparticles for Determining Fluid-uptake Abilities in Insects

Owady żywiące się płynami spożywają różne płyny, które są obecne w środowisku w postaci kałuż, filmów lub ograniczonych do małych porów. Badania nad akwizycją płynów wymagają oceny struktury aparatu gębowego i relacji funkcjonalnych; Jednak mechanizmy absorpcji płynów są historycznie wnioskowane na podstawie obserwacji architektury strukturalnej, czasami bez towarzyszących dowodów eksperymentalnych. W tym artykule przedstawiamy nową metodę oceny zdolności wchłaniania płynów przez motyle (Lepidoptera) i muchy (Diptera) przy użyciu niewielkich ilości płynów. Owady są karmione 20% roztworem sacharozy zmieszanym z fluorescencyjnymi, magnetycznymi nanocząstkami z bibuł filtracyjnych o określonych rozmiarach porów. Plon (struktura wewnętrzna służąca do przechowywania płynów) jest usuwany z owada i umieszczany w mikroskopie konfokalnym. Uprawa macha magnesem w celu określenia obecności nanocząstek, które wskazują, czy owady są w stanie połykać płyny. Metodologia ta została wykorzystana do ujawnienia powszechnego mechanizmu odżywiania (działanie kapilarne i tworzenie mostków cieczowych), który jest potencjalnie wspólny dla Lepidoptera i Diptera podczas żerowania z porowatych powierzchni. Ponadto metoda ta może być stosowana do badań nad mechanizmami żerowania wśród różnych owadów żywiących się płynami, w tym owadów ważnych dla przenoszenia chorób i biomimetyki, a także potencjalnie do innych badań obejmujących przewody o rozmiarach nano- lub mikro, w przypadku których transport cieczy wymaga weryfikacji.

Badanie wzorców zdolności do pobierania płynów u owadów wysysających wymaga określenia momentu, w którym następuje żerowanie. Protokół opisany w niniejszym opracowaniu jest wykorzystywany do testowania hipotezy ograniczonego rozmiaru porów u przedstawicieli rzędów Lepidoptera i Diptera13. Hipoteza ograniczonego rozmiaru porów zakłada, że owady wysysające nie mogą pobierać pokarmu z wypełnionych cieczą porów, jeśli średnica poru jest mniejsza od średnicy kanałów żer...

Owady żywiące się płynami mają zdolność pozyskiwania niewielkich ilości płynów z porowatych powierzchni. Protokół ten opisuje metodę bezpośredniego określania zdolności owadów do połykania cieczy z porowatych powierzchni za pomocą roztworów odżywczych z fluorescencyjnymi, magnetycznymi nanocząstkami.

Spożycie fluorescencyjnych, magnetycznych nanocząstek w celu określenia zdolności wchłaniania płynów przez owady

Fluid-feeding insects ingest a variety of liquids, which are present in the environment as pools, films, or confined to small pores. Studies of liquid ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena parametrów fizjologicznych żerowania u owadów żywiących się płynem przy użyciu roztworu sacharozy zmieszanego z fluorescencyjnymi nanocząstkami magnetycznymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie entomologii, takie jak struktura, funkcje, relacje części gębowych owadów i mechanizmy odżywiania się owadów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam określić, czy owady są w stanie spożywać płyny, które są obecne w postaci kałuż lub płynnych filmów.W tej demonstracji wykorzystano muchy butelkowe niebieskie, ponieważ ich zdolności do wchłaniania płynów i morfologia części gębowej są dobrze udokumentowane. Można użyć much domowych, motyli kapuścianych i innych owadów żywiących się płynnie. Zdobądź poczwarki much i umieść je w komorze środowiskowej z 18 godzinami światła dziennie i w temperaturze 23 stopni Celsjusza.Po tym, jak dorosłe osobniki wyjdą z poczwarek, nie karm ich przed eksperymentem. Do eksperymentalnego jedzenia przygotuj 20-procentowy roztwór sacharozy z 0,5 miligrama nanocząstek na mililitr. Następnie przygotuj stację karmienia składającą się z manipulatora, zacisku i stopnia karmienia.Na etapie k

the-ingestion-fluorescent-magnetic-nanoparticles-for-determining

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fluorescencyjne nanocząsteczki wytwarzane w naszym laboratorium są wykorzystywane do obrazowania stężeń jonów i strumieni jonowych w systemach biologicznych, takich jak komórki podczas sygnalizacji oraz płyn śródmiąższowy podczas homeostazy fizjologicznej.

Nanocząstki fluorescencyjne do pomiaru stężenia jonów w systemach biologicznych

W niniejszym artykule opisujemy metodę wykorzystującą multispektralną przepływową cytometrię obrazową do ilościowego oznaczenia internalizacji nanocząstek polianhydrydowych lub bakterii przez komórki RAW 264.7.

Analiza internalizacji komórkowej nanocząsteczek i bakterii przy użyciu wielospektralnej obrazującej cytometrii przepływowej

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Ten film demonstruje system mikroprzepływowy do testu immunologicznego opartego na magnetycznych nanocząsteczkach. System detekcji wykorzystuje urządzenie mikroprzepływowe zawierające pułapkę magnetyczną w swoich kanałach. Do kanałów wprowadzane są wstępnie uformowane immunokompleksy, składające się z pokrytych antygenem nanocząstek magnetycznych związanych z przeciwciałami pierwszorzędowymi i przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z peroksydazą. Immunokompleksy zostają wychwycone w...

Test immunologiczny oparty na nanocząstkach magnetycznych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

Śledzenie komórek za pomocą MRI zyskało niezwykłą uwagę w ostatnich latach. Protokół ten opisuje znakowanie komórek dendrytycznych cząstkami bogatymi w fluor (19F), zastosowanie tych komórek in vivo oraz monitorowanie zakresu ich migracji do drenującego węzła chłonnego za pomocą 19F/1H MRI i 19F MRS.

Monitorowanie migracji komórek dendrytycznych za pomocą rezonansu magnetycznego 19F / 1H

Analiza interakcji nanocząsteczek z określonymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej.

Wykrywanie oddziaływań nanocząstek fluorescencyjnych z pierwotnymi subpopulacjami komórek odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej

Użycie fluoroforów do obrazowania in vivo może być znacznie ograniczone przez opsonizację, szybki klirens, niską czułość wykrywania i cytotoksyczne działanie na gospodarza. Enkapsulacja fluoroforów w liposomach poprzez hydratację i ekstruzję filmu prowadzi do wygaszania i ochrony fluorescencji, co umożliwia obrazowanie in vivo o wysokiej czułości wykrywania.

Wygaszanie fluorescencji fluoroforu bliskiej podczerwieni w obudowie liposomalnej jako narzędzie do obrazowania optycznego in vivo

Ten manuskrypt opisuje nowatorską technikę, która pozwala na wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów po endocytozie nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie bezpośrednio w żywych komórkach. Metoda nie wymaga manipulacji komórkami i nie jest ograniczona w odniesieniu do docelowego genu lub gatunku.

Wykrywanie wewnątrzkomórkowej ekspresji genów w żywych komórkach pochodzenia mysiego, ludzkiego i świńskiego za pomocą nanocząstek znakowanych fluorescencyjnie

Ogólnym celem tego protokołu jest synteza funkcjonalnych nanosensorów do przenośnego, opłacalnego i szybkiego wykrywania specyficznie ukierunkowanych bakterii chorobotwórczych poprzez połączenie relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Badania przesiewowe patogenów przenoszonych przez żywność przy użyciu nanoczujnika magnetofluorescencyjnego: szybkie wykrywanie E. coli O157:H7

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Nanocząstki tlenku żelaza są syntetyzowane za pomocą niewodnego żelu zolowego i pokrywane anionowymi krótkimi cząsteczkami lub polimerem. Zastosowanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji i biotransformacji nanocząstek magnetycznych wewnątrz ludzkich komórek macierzystych wykazano za pomocą magnetometru do próbek wibracyjnych (VSM).

Wykorzystanie magnetometrii do monitorowania inkorporacji komórkowej, a następnie biodegradacji chemicznie syntetyzowanych nanocząstek tlenku żelaza

Poznaj metodę oceny pobierania płynów przez owady za pomocą fluorescencyjnych nanocząstek magnetycznych. Technika ta pozwala badać mechanizmy karmienia i strukturę aparatu gębowego u muchówek.

Spożycie fluorescencyjnych, magnetycznych nanocząstek w celu określenia zdolności wchłaniania płynów przez owady

Przeglądaj więcej filmów