Spożycie fluorescencyjnych, magnetycznych nanocząstek w celu określenia zdolności wchłaniania płynów przez owady

Ogólnym celem tej procedury jest ocena parametrów fizjologicznych żerowania u owadów żywiących się płynem przy użyciu roztworu sacharozy zmieszanego z fluorescencyjnymi nanocząstkami magnetycznymi. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie entomologii, takie jak struktura, funkcje, relacje części gębowych owadów i mechanizmy odżywiania się owadów. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam określić, czy owady są w stanie spożywać płyny, które są obecne w postaci kałuż lub płynnych filmów.

W tej demonstracji wykorzystano muchy butelkowe niebieskie, ponieważ ich zdolności do wchłaniania płynów i morfologia części gębowej są dobrze udokumentowane. Można użyć much domowych, motyli kapuścianych i innych owadów żywiących się płynnie. Zdobądź poczwarki much i umieść je w komorze środowiskowej z 18 godzinami światła dziennie i w temperaturze 23 stopni Celsjusza.

Po tym, jak dorosłe osobniki wyjdą z poczwarek, nie karm ich przed eksperymentem. Do eksperymentalnego jedzenia przygotuj 20-procentowy roztwór sacharozy z 0,5 miligrama nanocząstek na mililitr. Następnie przygotuj stację karmienia składającą się z manipulatora, zacisku i stopnia karmienia.

Na etapie karmienia trzymaj karmę za pomocą wklęsłego suwaka. Przygotuj również różne nylonowe filtry siatkowe i filtry membranowe o różnych rozmiarach porów, aby zakryć wklęsłą szkiełko. Zacznij od zawinięcia ciał, nóg i skrzydeł owadów w złożoną bibułkę.

Pozostaw odsłonięte tylko część głowy i usta. Robiąc to, zabezpiecz owada, ściskając jego skrzydła razem. Teraz zabezpiecz skrzydełka owinięte bibułą między dwoma szkiełkami mikroskopowymi.

Następnie zaciśnij dwie prowadnice i przymocuj zacisk do manipulatora. Następnie zabezpiecz owada powyżej etapu karmienia za pomocą manipulatora. Następnie umieść 30 mikrolitrów roztworu zasilającego na środku wklęsłego szkiełka i przykryj roztwór porowatym kawałkiem bibuły filtracyjnej.

Kropla rozprzestrzeni się wzdłuż bibuły filtracyjnej, wypełniając pory. Następnie ustaw owada tak, aby dystalne obszary części gębowej mogły stykać się ze zwilżoną bibułą filtracyjną tak, aby można było dotrzeć tylko do płaskiej części szkiełka, a owad nie mógł żerować z obszaru wklęsłego. Teraz użyj szpilki do owadów, aby wysunąć części gębowe na bibułę filtracyjną i pozwól owadowi żerować przez 45 sekund.

Jeśli owad nie wyrazi zainteresowania karmieniem, przytrzymaj aparat gębowy przy bibule filtracyjnej przez 45 sekund za pomocą szpilki. Na tym kończy się protokół karmienia. Do sekcji załaduj 50-mililitrowe szkiełko zegarkowe z wystarczającą ilością PBS, aby pokryć ciało owada.

Ustaw to wraz ze wszystkimi narzędziami preparacyjnymi pod mikroskopem. Teraz usuń owada z bibuły, trzymając jego skrzydła zamknięte. Następnie usuń głowę, nogi i skrzydła za pomocą sprężynowych nożyczek do mikropreparowania i umieść klatkę piersiową i brzuch w PBS.

Aby wypreparować jelito, najpierw chwyć dystalny kutykul brzucha i przetnij naskórek w kierunku przednim wzdłuż bocznej strony od tylnego końca do klatki piersiowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby przeciąć tylko naskórek i nie uszkodzić przewodu pokarmowego. Następnie usuń naskórek brzucha, ciało tłuszczowe i inne struktury za pomocą szpilek przeciw owadom, aż w szkiełku zegarka pozostanie tylko klatka piersiowa i przewód pokarmowy.

Teraz zidentyfikuj uprawę. Jest to struktura przypominająca worek, znajdująca się w pobliżu połączenia klatki piersiowej i brzucha. W razie potrzeby wykonaj dodatkowe nacięcia w klatce piersiowej, aby odsłonić plon.

Następnie odetnij pozostałą klatkę piersiową, pozostawiając tylko przewód pokarmowy i plon. Aby przetestować obecność połkniętych nanocząstek, zacznij od użycia cienkich kleszczy preparacyjnych, aby przenieść uprawę na szkiełko nakrywkowe w celu obrazowania. Zachowaj ostrożność, aby zapobiec pęknięciu uprawy.

Natychmiast zobrazuj uprawę w odwróconym mikroskopie konfokalnym przy 20-krotnym powiększeniu przy użyciu kanału CY3 lub kontrastu fazowego. Aby zidentyfikować połknięte nanocząstki, machnij magnetycznym prętem mieszającym około 10 milimetrów od uprawy. Spraw, aby każdy ruch w przód iw tył trwał około jednej sekundy.

Machając magnesem, powoli przesuwaj stolik operacyjny, aby zeskanować ruch nanocząstek wewnątrz prawie przezroczystej uprawy. Jeśli nanocząstki są obecne w uprawie, będą falować zgodnie z mieszadłem magnetycznym. Owad żywiący się roztworem z porowatej powierzchni musi wytworzyć stabilny mostek cieczy poprzez niestabilność plateau, aby pokonać ciśnienie kapilarne, które utrzymuje ciecz w porach.

Przewiduje się, że rozmiar przewodu pokarmowego owadów określi najmniejszy rozmiar porów, z których mogą się odżywiać. Po tym, jak owady zostały wypreparowane w celu oceny, czy nanocząstki zostały połknięte, ich części gębowe zostały zobrazowane w celu zmierzenia rozmiaru kanału pokarmowego. W przypadku much zmierzono średnicę tchawicy rzekomej i otworu ustnego.

Analiza połkniętych nanocząstek sugeruje ścisły związek między rozmiarem przewodu dystalnej części gębowej a najmniejszym rozmiarem porów, z których owad może się pożywić. Związek ten nie jest widoczny w przypadku bliższych części gębowych. W związku z tym wychwyt płynów u muchówek nastąpiłby najpierw w tchawicy rzekomej, a nie w otworze ustnym, a działanie kapilarne musi odgrywać ważną rolę w karmieniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak karmić owady roztworem nanocząstek, preparować je w celu wyizolowania ich upraw, a następnie sprawdzać uprawę pod kątem nanocząstek. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować ostrożność podczas sekcji. Jeśli plon zostanie pęknięty, może rozlać płynną zawartość i nanocząsteczki, niszcząc w ten sposób próbkę.