Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli
22 grudnia 2017
Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.
Ogólnym celem tej procedury jest osiągnięcie wyczerpującej charakterystyki rodziny genów u roślin zgodnie z globalnym podejściem, obejmującym definicję struktury genu, odpowiednich motywów białkowych, lokalizacji chromosomów, duplikacji genów i wzorców ekspresji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące klasyfikacji roślin w rodzinach, takie jak światowa identyfikacja genomowa członków rodziny i ich transkryptomia zapewnia to poprzez analizę ekspresji genów. Główną zaletą całej procedury jest dostarczenie wyczerpującej listy etapów eksperymentalnych w celu uzyskania pełnej charakterystyki rodziny genów.
Procedurę tę można zastosować do dowolnej rodziny genów dowolnego gatunku roślin, dla której dostępne są dane genetyczne. Co więcej, podejście to dostarcza cennych informacji w celu zidentyfikowania interesujących kandydatów do badań funkcjonalnych. Całą procedurę zademonstruje Pietro Ariani z mojego laboratorium.
Otwórz stronę internetową Blast i kliknij sekcję dotyczącą blastów białkowych. W polu Wprowadź sekwencję zapytania wprowadź sekwencję aminokwasów białka, które będzie używane jako sonda do identyfikacji innych członków rodziny. Używaj białka, które ma wszystkie ważne cechy, które charakteryzują rodzinę.
Następnie w polu wybierz zestaw wyszukiwania, wybierz bazę danych białek referencyjnych oraz interesujący nas organizm. Teraz w wyborze programu terenowego wybierz algorytm PSI-BLAST. W razie potrzeby kliknij parametry algorytmu, aby dostosować zaawansowane parametry, takie jak maksymalna sekwencja docelowa i macierz punktacji.
Wartość E to próg, który dla tego wyszukiwania jest zmniejszany z 005 do 001. Kliknij przycisk BLAST, aby uruchomić analizę. Spośród wszystkich sekwencji wyświetlających względne dopasowania do zapytania usuń zaznaczenie wpisów, które wyraźnie nie należą do rodziny.
W tym celu należy kliknąć na znacznik wyboru w kolumnie "Wybierz dla PSI-BLAST". Następnie uruchom drugą iterację PSI-BLAST, klikając przycisk Przejdź. Wszystkie nowo zidentyfikowane sekwencje zostaną podświetlone na żółto.
Ponownie odznacz trafienia, które nie należą do rodziny. Kontynuuj ten proces, aż algorytm nie znajdzie żadnego odpowiedniego wpisu lub osiągnie zbieżność. Po wyeliminowaniu wszystkich wyników fałszywie dodatnich zbierz sekwencje aminokwasowe w pliku sformatowanym w formacie FASTA i prześlij plik do pakietu oprogramowania bioinformatycznego.
Następnie zaznacz wszystkie zaimportowane sekwencje na liście i kliknij przycisk wyrównania/złożenia na pasku narzędzi. Następnie kliknij parowanie wielokrotne wyrównanie i wybierz WYRÓWNANIE MIĘŚNI i OK. Wyrównanie zostanie teraz wykonane przy użyciu ustawień domyślnych. Teraz zwizualizuj logo sekwencji dopasowania i sprawdź wizualnie geny, aby wyszukać wyniki fałszywie dodatnie.
Dalsza analiza parametrów fizycznych i domen białek, rozmieszczenia chromosomów, duplikacji i organizacji intronów eksonów jest opisana w protokole tekstowym. Następnie przeanalizuj relacje między członkami rodziny ATL poprzez konstrukcję wysokiej jakości drzewa filogenetycznego oraz definicję nomenklatury rodzinnej. Po pierwsze, pobierz arabskie sekwencje ATL systeliana, wymagane jako odniesienia dla nomenklatury genów winorośli winogronowej, z bazy danych UmoProt w celach informacyjnych.
Następnie utwórz plik FASTA zawierający wszystkie sekwencje nukleotydowe winorośli i członków rodziny genów Arabidopsis do analizy filogenetycznej. Teraz przejrzyj stronę główną filogenezy Francja i wybierz potok analizy filogenezy. W większości przypadków wystarczy jedno kliknięcie, ale w razie potrzeby możliwe jest wybranie określonych ustawień zaawansowanych za pomocą opcji zaawansowanych lub nawet w pełni spersonalizowanej analizy za pomocą opcji a la carte.
Następnie wprowadź nazwę analizy i prześlij plik FASTA. Następnie kliknij przycisk Prześlij, aby uruchomić analizę. Jeśli ta procedura spowoduje wyświetlenie komunikatu o błędzie, wykonaj każdy krok procesu tworzenia pakietu filogenetycznego indywidualnie.
Najpierw przejdź do strony głównej oprogramowania MUSCLE i prześlij plik FAPSA. Wybierz Pearson FASTA jako format wyjściowy i prześlij. Następnie pobierz plik w formacie FASTA i wyeliminuj wszelkie źle wyrównane pozycje.
Otwórz narzędzie serwera G-block, prześlij plik FASTA wyrównania, wybierz DNA jako typ sekwencji i wybierz rygorystyczność, która najlepiej pasuje do analizy. W przypadku dopasowania rodziny genów ATL winorośli należy wybrać wszystkie trzy proponowane opcje dla mniej rygorystycznej selekcji ze względu na dużą rozbieżność sekwencji. Następnie kliknij przycisk Pobierz bloki, aby uruchomić analizę.
Aby zapisać wyniki, kliknij wynikowe wyrównanie u dołu strony wyjściowej i utwórz nowy plik FAPSA. G-bloki eliminują źle wyrównaną pozycję w rozbieżnych regionach DNA lub wyrównanie popychające, dzięki czemu staje się ono bardziej odpowiednie do analizy filogenetycznej. W tym kroku wybór parametru impericle dla rygorystyczności kolumn ma kluczowe znaczenie, aby upewnić się, że są one obciążeniem trzech.
Aby uzupełnić drzewo, przechodzimy na stronę główną Phylogeny France. Tam wybierz potok a la carte i usuń zaznaczenie następujących opcji: wielokrotne wyrównanie i kuratorowanie wyrównania. Następnie kliknij utwórz przepływ pracy, prześlij plik FASTA z wyselekcjonowanymi blokami G, wybierz procedurę bootstrapowania i użyj domyślnych parametrów i ustawień.
Na koniec kliknij przycisk Prześlij, aby uruchomić analizę. Na tym kończy się proces krok po kroku. Teraz, gdy drzewo filogeniczne jest już wykonane, zwiń słabo podparte gałęzie z wartościami bootstrap mniejszymi niż 70%Następnie pobierz końcowe wyniki w formacie Newick do dalszej analizy.
Protokół tekstowy zawiera instrukcje dotyczące przypisywania nazwy genu na podstawie filogenezy. Dla tego protokołu utwórz plik w formacie tekstowym z wystukanymi, liniowymi wartościami ekspresji znormalizowanymi przez armę pobranymi z biblioteki ekspresji genów. Uporządkuj wartości dla każdego genu rodziny w tych samych wierszach wzorca.
Następnie wykonaj hierarchiczną analizę dwuklastrową przy użyciu oprogramowania do przeglądania wielu eksperymentów. Najpierw prześlij roboczą macierz danych i wybierz plik tekstowy. Wybierz tablicę jednokolorową i usuń znacznik z adnotacji ładunku, jeśli adnotacja automatyczna nie jest zapewniona.
Wybierz skrajną lewą górną wartość wyrażenia w podglądzie tabeli wyrażeń i kliknij przycisk ładowania. Następnie dostosuj dane, stosując transformację Log2 i normalizację genu/wiersza. Następnie ustaw odpowiedni limit skali.
Teraz oblicz grupowanie hierarchiczne. W polu optymalizacji kolejności wybierz opcję Optymalizuj kolejność liści genów i optymalizuj kolejność liści próbki. Następnie w polu wyboru metody sprzężenia wybierz średnie grupowanie sprzężeń, a w polu wyboru macierzy odległości wybierz korelację Pearsona.
Następnie kliknij przycisk OK, aby uruchomić analizę. Wyświetl wyniki w lewym panelu okna i wyeksportuj mapę cieplną, klikając Zapisz obraz w menu plików. Najbardziej podobny gen do Arabidopsis thaliana ATL2, zgodnie z poszukiwaniami BLAST-P, został wykorzystany do zbadania członków rodziny ATL w genomie winorośli.
Analiza PSI BLAST zbiegła się po kilku cyklach, dostarczając listę przypuszczalnych genów w rodzinie genów. Obecność kanonicznej domeny pierścienia H2 dla każdego kandydata oceniono poprzez oględziny wyrównania mięśni. To zawęziło poszukiwania do 96 genów winorośli.
Do nomenklatury wykorzystano analizę filogenetyczną zidentyfikowanych genów porównujących je z rodziną genów ATL rzodkiewnika. 13 z 96 ATL winorośli gronowej otrzymało specyficzny identyfikator jako ortolog genu ATL Arabidopsji. Mapowanie zidentyfikowanych genów do globalnego atlasu ekspresji genów winorośli winogronowej przy użyciu hierarchicznej analizy dwuklastrowej wykazało, że wszystkie 96 genów ulega ekspresji w co najmniej jednej tkance i można zidentyfikować pięć klastrów ekspresji.
Podobne podejście zastosowano do badania ekspresji tych genów w odpowiedzi na stresy biotyczne. Rodzina genów ATL była bezpośrednio zaangażowana w odpowiedź na zakażenie patogenem, przy czym 62 geny wykazywały znaczącą modulację w co najmniej dwóch stanach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak radzić sobie z oprogramowaniem używanym do charakteryzowania rodziny genów.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby dokładnie zdefiniować charakterystykę danej rodziny genów i odpowiadającą jej sondę używaną do identyfikacji członków całej rodziny genomów. Zgodnie z tą procedurą, możliwe jest zbadanie ewolucji rodziny genów i funkcji P30 poprzez stworzenie dodatkowych drzew filogenetycznych na podstawie niektórych gatunków innych niż gatunki wymagane do przypisania nomenklatury rodzin genów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakteryzacji rodziny genów w winorośli, skupiając się szczególnie na Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL) E3 ubiquitin ligases. Metoda ma na celu zapewnienie kompleksowego zrozumienia struktury genu, motywów białkowych, lokalizacji chromosomowej, duplikacji genów i wzorców ekspresji.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Genetyka roślin
- Charakteryzacja genów
- Ubiquitin Ligases
Tło
- Rozumienie rodzin genów jest kluczowe dla klasyfikacji roślin.
- Analiza ekspresji genów pomaga w identyfikacji członków rodziny.
- Charakteryzacja może ujawnić funkcjonalne kandydatów do dalszych badań.
- Ta metoda jest stosowana do każdego gatunku roślin z dostępnymi danymi genetycznymi.
Cel badania
- Osiągnięcie wyczerpującej charakteryzacji rodziny genów.
- Zdefiniowanie struktury genu i powiązanych motywów białkowych.
- Analiza duplikacji genów i wzorców ekspresji.
Stosowane metody
- Globalna genomiczna identyfikacja członków rodziny genów.
- Analiza transkryptomowa dla profilowania ekspresji genów.
- Eksperymentalne kroki dla kompletnej charakteryzacji rodziny genów.
- Zastosowanie procedury do różnych gatunków roślin.
Główne wyniki
- Kompleksowa lista eksperymentalnych kroków dostarczona.
- Identyfikacja interesujących kandydatów do badań funkcjonalnych.
- Wgląd w klasyfikację rodzin genów u roślin.
- Demonstracja procedury przez Pietro Arianiego.
Wnioski
- Procedura oferuje systematyczne podejście do charakteryzacji rodzin genów.
- Zwiększa zrozumienie genetyki i ewolucji roślin.
- Cenne dla przyszłych badań w biologii roślin.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Genome-wide identification and meta-analysis of gene families, such as ATL E3 ubiquitin ligases in grapevine, enable systematic target validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. This workflow supports predictive confidence in functional genomics, informing candidate prioritization for trait engineering and stress adaptation studies. The approach is broadly applicable to any plant species with genomic data, enhancing portfolio decision-making in agricultural R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cataloging of gene family members for hypothesis-driven target selection.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene structure, duplication, and conserved motifs.
- Facilitates functional annotation and prioritization of candidates for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized gene family datasets for assay development and screening workflows.
- Enables reproducible identification of expression patterns across tissues and conditions.
- Supports scalable analysis of gene function and response to biotic stressors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression clusters with phenotypic outcomes relevant to stress adaptation.
- Enables continuity from discovery genomics to trait validation in preclinical plant models.
- Supports risk-adjusted advancement of gene candidates for functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical trait validation in plant biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Supports genome-wide hypothesis testing and gene family classification for target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression profiles for candidate triage.
- Analytics: Provides hierarchical clustering and phylogenetic outputs to compare gene family members.
- Translational Research: Links gene expression modulation to stress response phenotypes in plants.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable informatics workflow adaptable to any plant gene family with available genomic data.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target selection.
- Operational Value: Standardizes gene family characterization and expression analysis across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for candidate advancement and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for trait engineering and stress adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics, phylogenetics, and gene expression analysis.
- Depends on access to genomic databases, alignment tools, and clustering software.
- Necessitates standardized data processing and annotation protocols across teams.
- Adaptable to diverse plant species and gene families with available sequence data.
- Stringency in alignment and clustering parameters is critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Identifying Putative Gene Family Members, Making Alignments, and Sequence Logos
3:33
Phylogenetic Analysis and Nomenclature
6:51
Tissue Expression Meta-analysis
8:27
Results: Identified ATL Gene Family Members in the Grapevine Genome
9:52
Conclusion
