Izolacja i pomiary oddechowe mitochondriów Arabidopsis thaliana
5 stycznia 2018
Ponieważ mitochondria stanowią tylko niewielki procent komórki roślinnej, muszą zostać oczyszczone do szeregu badań. Mitochondria można wyizolować z różnych organów roślinnych poprzez homogenizację, a następnie wirowanie w gradiacji różnicowej i gęstości w celu uzyskania wysoce oczyszczonej frakcji mitochondrialnej.
Ogólnym celem wyizolowania nienaruszonych i czystych mitochondriów roślinnych jest badanie oddychania, składu mitochondriów, biogenezy i metabolizmu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w biologii energii roślin, takie jak znaczenie mitochondriów i tolerancja na stres w zmieniających się warunkach środowiskowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że ze stosunkowo niewielkich ilości tkanki roślinnej można wyizolować wystarczającą ilość czystych, nienaruszonych i funkcjonalnych mitochondriów.
Procedurę zademonstrują Wenhui Lyu i Jennifer Selinski z mojego laboratorium. W dniu izolacji mitochondriów umyj nalewak gradientowy i rurkę perystaltyczną PVC wodą dejonizowaną, aby przygotować gradienty. Nachylić się tak, aby ustawić dwie probówki wirówkowe o pojemności 50 ml na lodzie, tak aby wylot rurki perystaltycznej dotykał ścianki probówek.
Następnie przekręć czarną dźwignię w dół, aby zamknąć połączenie między komorą wewnętrzną i zewnętrzną. Umieść nalewak gradientowy z mieszadłem magnetycznym w komorze wewnętrznej na mieszadle magnetycznym. Następnie wlej 35 ml roztworu o dużym gradiencie do komory wewnętrznej.
Dozować połowę roztworu o dużym gradicynie przez pompę perystaltyczną w ilości 300 ml na godzinę do dwóch probówek wirówkowych, utrzymywanych na lodzie. Następnie wlej 35 ml roztworu gradientu światła do komory zewnętrznej. Natychmiast przekręć czarną dźwignię do połowy, aby wznowić połączenie między komorą wewnętrzną i zewnętrzną, aby roztwory delikatnie się wymieszały.
Wyrzuć całą mieszaninę gradientową z komór z szybkością 60 ml na godzinę, aby utworzyć dwa ciągłe gradienty od 0% do 4,4% PVP. Zawsze utrzymuj pochyłości na lodzie przed użyciem. Ważne jest, aby nie przekopywać tkanki roślinnej, w przeciwnym razie mitochondria ulegną rozpadowi.
Aby uzyskać pojedynczy preparat, należy wyciąć całą tkankę rozety z co najmniej 80 czterotygodniowych roślin Arabidopsis, uprawianych na glebie. Następnie dodaj połowę pokrojonych tkanek roślinnych do schłodzonego dużego moździerza i tłuczka, zawierającego 75 ml podłoża do mielenia. Następnie za pomocą ścierniska zwilżyć cztery warstwy materiału filtracyjnego o wielkości porów od 20 do 25 m.
Za pomocą plastikowego lejka przefiltruj jednorodność przez wszystkie cztery warstwy materiału filtracyjnego i zbierz ją do stożkowej kolby o pojemności 500 ml. Użyj dodatkowych 75 ml środka do mielenia, aby zmielić drugą połowę tkanki. Następnie połącz cały homogenat w materiale filtracyjnym, aby odfiltrować jak najwięcej.
Użyj 150 ml pożywki do mielenia, aby zmielić całą pozostałą tkankę na materiale filtracyjnym i przefiltrować do kolby stożkowej o pojemności 500 ml. Rozprowadź przefiltrowany homogenat w ośmiu wstępnie schłodzonych plastikowych probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml. I odwirować przy 2 500 g w czterech stopniach Celsjusza, w wirniku o stałym kącie, przez pięć minut.
Po przelaniu supernatantu do czystych probówek wirówkowych, ponownie odwirować w temperaturze 17 500 g, w temperaturze czterech stopni Celsjusza, przez 20 minut, w wirniku o stałym kącie. Pozostawić 3 ml supernatantu w probówce. Następnie za pomocą cienkiego pędzla delikatnie ponownie zawiesić granulat w pozostałym supernatancie.
Dodaj 10 ml buforu do płukania o pojedynczej mocy do każdej z probówek i połącz wszystkie cztery probówki w jednej probówce wirówkowej, co daje w sumie dwie probówki. Dostosuj objętość do 50 ml za pomocą buforu do płukania o pojedynczej mocy i powtórz kroki wirowania. Używając bardzo małej ilości buforu do mycia, rozprowadź osad za pomocą drobnego pędzla, a następnie użyj zakraplacza, aby zebrać surowy osad mitochondrialny w probówce.
Następnie ostrożnie ułóż zawiesinę mitochondrialną za pomocą zakraplacza, na dwóch ciągłych gradientach od 0% do 4% PVP. Użyj buforu do płukania o pojedynczej mocy, aby zrównoważyć ciężar probówek i przeprowadzić wirowanie przy 40 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez 40 minut. Pamiętaj o wyłączeniu hamulca.
Ostrożnie zassać górne pięć centymetrów roztworu powyżej pasma mitochondrialnego. Następnie rozprowadź roztwór mitochondrialny w dwóch czystych probówkach i napełnij buforem do płukania o pojedynczej mocy. Przykryj ujście probówki plastikową folią parafinową i odwróć ją kilka razy, aby równomiernie rozprowadzić gradient gęstości koloidalnej i mitochondria.
Następnie odwirować w temperaturze 31 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z powolnym hamowaniem. Zassać supernatant i wyregulować objętość probówki do 50 ml za pomocą bufora płuczącego o pojedynczej mocy. Odwróć kilka razy, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie.
Odwirować roztwór o stężeniu 31 000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z powolnym hamowaniem. Odessać supernatant, a następnie zebrać osad mitochondrialny w 500 l buforu do przemywania o pojedynczej mocy, używając pipety ze zmodyfikowaną końcówką o pojemności 200 l. Przy otwartym tłoku dodać 970 l nasyconego powietrzem medium oddechowego do komory reakcyjnej.
Następnie dodać 150 g całkowitego białka mitochondrialnego, za pomocą zmodyfikowanej pipety, i 500 M trifosforanu adenozyny do komory reakcyjnej, aby określić oddychanie mitochondrialne. Użyj magnetycznego mieszadła, aby w sposób ciągły mieszać zawiesinę mitochondrialną. Po zamknięciu tłoka kliknij przycisk Rozpocznij nagrywanie, aby zarejestrować zużycie tlenu.
Poczekaj minutę lub dwie, aby sprawdzić, czy istnieje liniowy ślad zużycia tlenu, wskazujący stabilne zużycie tlenu. Następnie dodaj 5 mM bursztynianu i rejestruj zużycie tlenu przez około dwie minuty. Dodaj 1 mM difosforanu adenozyny i rejestruj wskaźnik zużycia tlenu przez kolejne dwie minuty.
Następnie dodaj 1 mM wodoru dinukleotydu nikotynamidoadeninowego i kontynuuj rejestrowanie zużycia tlenu przez około cztery do ośmiu minut. Następnie dodaj odczynniki, aby zahamować szlak cytochromu C i rejestruj zużycie tlenu za pomocą alternatywnej oksydazy przez około dwie minuty. KCN, myksotiazol i antymycyna A są truciznami układu oddechowego.
Ważne jest, aby postępować zgodnie z instrukcjami bezpieczeństwa zawartymi w kartach charakterystyki charakterystyki. Należy pamiętać, że różne kraje będą miały różne przepisy dotyczące stosowania tych inhibitorów w naszych eksperymentach. Następnie dodaj 5 mM ditiotreitolu i 10 mM pirogronianu, aby aktywować alternatywną oksydazę.
I nagrywaj przez kolejne pięć do siedmiu minut. Na koniec dodaj 500 mM galusanu N-propylu i nagrywaj przez dwie minuty. Reprezentatywny gradient, wykazujący obecność zielonkawo-białej frakcji mitochondrialnej w pobliżu dna roztworu gradientowego.
Tyrakooidy i inne zanieczyszczenia obecne na wierzchu roztworu gradientowego są oznaczone ciemnozielonymi paskami. Reprezentatywne ślady zużycia tlenu przez mitochondria, aby pokazać integralność błony zewnętrznej przed pomiarem zużycia tlenu. Integralność membrany zewnętrznej była dobrze zachowana i około 90% nienaruszona.
Reprezentatywne ślady zużycia tlenu przez mitochondria, po dodaniu substratów, inhibitorów i efektorów. Wyniki wskazują na upośledzony szlak cytochromu c i alternatywnej oksydazy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować i analizować mitochondria roślinne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł dotyczy izolowywania nienaruszonych i czystych mitochondria roślinnych w celu zbadania różnych aspektów biologii energetycznej roślin. Metoda ta pozwala naukowcom uzyskać funkcjonalne mitochondria z małych ilości tkanki roślinnej, ułatwiając badania nad oddychaniem, składem i metabolizmem.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biologia roślin
- Badania nad mitochondriami
- Metabolizm energetyczny
Tło
- Mitochondria są kluczowe dla oddychania i produkcji energii w roślinach.
- Rozumienie funkcji mitochondrialnych jest istotne dla badań nad tolerancją roślin na stres.
- Techniki izolowywania są konieczne ze względu na niewielką procentową zawartość mitochondria w komórkach roślinnych.
- Badania mogą dostarczyć wglądu w reakcje roślin na zmiany środowiskowe.
Cel badania
- Izolowanie czystych i nienaruszonych mitochondria z tkanek roślinnych.
- Badanie ról mitochondria w oddychaniu i metabolizmie.
- Zbadanie związku między mitochondriami a tolerancją na stres u roślin.
Stosowane metody
- Homogenizacja tkanek roślinnych.
- Różnicowa centrifugacja do oddzielenia ułamków mitochondrialnych.
- Centrifugacji gradientowej gęstości do dalszej czystości.
- Przygotowanie gradientów z użyciem wody dejonizowanej i specjalnych rurek.
Główne wyniki
- Udane izolowanie funkcjonalnych mitochondria z małych próbek roślinnych.
- Demonstracja procedury przez Wenhui Lyu i Jennifer Selinski.
- Wgląd w skład i funkcje mitochondria.
- Potencjalne zastosowania w badaniach nad biologią energetyczną roślin.
Wnioski
- Metoda zapewnia niezawodny sposób badania mitochondria roślinnych.
- Izolowany mitochondria może być wykorzystywany do odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii roślin.
- Technika ta poprawia rozumienie reakcji roślin na stres środowiskowy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation of functional mitochondria from plant tissues enables mechanistic de-risking of energy metabolism pathways in early discovery. This method supports target validation by providing purified organelles for substrate-specific respiration assays, improving predictive confidence in pathway interrogation. The approach facilitates translational continuity from basic mitochondrial function to stress tolerance models relevant to agricultural biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of mitochondrial respiration pathways using defined substrates and inhibitors to clarify functional targets in energy metabolism.
- Operational Value: Provides reproducible isolation of intact mitochondria from small tissue quantities, supporting assay standardization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative oxygen consumption measurements that enable dose-response analysis of respiratory inhibitors and activators.
- Operational Value: Establishes a scalable purification workflow yielding 2-3 mg mitochondria from 100 g leaf tissue for high-throughput screening preparation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by linking mitochondrial function to stress tolerance phenotypes under changing environmental conditions.
- Operational Value: Ensures mitochondrial integrity preservation (>90% intact outer membrane) for reliable preclinical-like functional readouts.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by supplying purified mitochondria for hypothesis testing of respiratory chain components and metabolic pathway modulation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification through substrate-specific oxidation measurements (e.g., NADH, succinate) and inhibitor studies to de-risk mechanistic assumptions.
- Screening: Delivers standardized mitochondrial preparations with consistent respiratory rates (100-250 nmol O₂ min⁻¹ mg⁻¹ protein) for reliable compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements of oxygen consumption rates to assess cytochrome and alternative oxidase pathway activities.
- Translational Research: Connects mitochondrial respiration metrics to stress tolerance mechanisms, supporting risk-adjusted advancement decisions in trait development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across Arabidopsis organs (leaf, root, flower) for sustained mitochondrial biology programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in mitochondrial target validation through direct measurement of respiratory pathway capacities.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via differential and density gradient centrifugation yielding pure mitochondrial pellets.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions on energy metabolism targets by clarifying substrate utilization and inhibitor sensitivity profiles.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on functional respiration data from physiologically relevant plant mitochondrial systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue homogenization and centrifugation techniques to avoid mitochondrial breakdown.
- Dependent on specialized instrumentation including fixed-angle rotors capable of 40,000 g and peristaltic gradient pourers.
- Necessitates cross-team standardization of gradient preparation and mitochondrial handling procedures for consistent yields.
- Adaptation considerations include optimizing grinding medium and filtration parameters for different Arabidopsis tissue types.
- Practical limitations include the need to maintain gradients on ice and avoid overgrinding to preserve mitochondrial integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Preparation of Grinding Medium, Wash Buffer, and Gradient Solutions
2:22
Homogenization and Mitochondrial Isolation
6:30
Oxygen Consumption Measuurements
8:42
Results: Isolation of Purified Mitochondrial Protein and Oxygen Consumption Measurement of Purified Mitochondria Obtained from Arabidopsis thaliana Plants
9:37
Conclusion
