Szybkie wykrywanie fenotypów neurorozwojowych w ludzkich neuronalnych komórkach prekursorowych (NPC)
2 marca 2018
Procesy neurorozwojowe, takie jak proliferacja, migracja i rozrost neurytów, są często zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych. W związku z tym przedstawiamy protokoły szybkiej i powtarzalnej oceny tych procesów neurorozwojowych u ludzkich NPC pochodzących z iPSC. Protokoły te pozwalają również na ocenę wpływu odpowiednich czynników wzrostu i terapii na rozwój NPC.
Ogólnym celem tego protokołu jest scharakteryzowanie wczesnych procesów rozwojowych mózgu ludzkich nerwowych komórek prekursorowych w szybki i powtarzalny sposób oraz określenie wpływu ważnych czynników zewnątrzkomórkowych na regulację tych procesów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na ważne pytania w dziedzinie neuropsychiatrii i zaburzeń neurorozwojowych, takie jak to, czy wszystkie osoby dotknięte chorobą mają tę samą nieprawidłowość komórkową, czy też, czy każda z nich wykazuje specyficzną dysfunkcję danej osoby? Główną zaletą naszego protokołu jest to, że jest szybki, wysoce powtarzalny i łatwy do wdrożenia.
Chociaż metoda ta może być wykorzystana do zapewnienia wglądu w zaburzenia neurorozwojowe, może być również wykorzystana do badania zaburzeń neurodegeneracyjnych i neuropsychiatrycznych, takich jak choroba Alzheimera i depresja. Wizualna demonstracja niektórych z tych metod jest konieczna, ponieważ niektóre techniki polegają na przenoszeniu komórek z jednej płytki do drugiej lub wymagają analiz morfologicznych, które najlepiej przekazać za pomocą wizualnej demonstracji. Aby podnieść ludzkie neuronalne komórki prekursorowe, odessać pożywkę i przemyć komórki raz solą fizjologiczną buforowaną 1X fosforanem.
Odessać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami i dodać 500 mikrolitrów roztworu odłączającego komórki 1X do studzienki z neuronalnymi komórkami prekursorowymi. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Następnie za pomocą pipety P1000 dodaj 500 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami utrzymywanej w temperaturze pokojowej w celu umycia i usunięcia komórek.
Następnie przenieś komórki w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Ponownie umyj studzienkę jednym mililitrem soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i przenieś popłuczynę do probówki. Następnie wiruj komórki w temperaturze 300 G przez pięć minut, aby uformować osad.
Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osad w jednym do pięciu mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża DMEM F12. Umieść 100 000 komórek w trzech dołkach na płytce 24-dołkowej. Po 46 godzinach dodaj tritiowaną tymidynę do pożywki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.
Następnie, po usunięciu pożywki, dodaj 300 mikrolitrów wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny EDTA i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby rozbić komórki i uwolnić DNA. Następnie włącz kombajn do kombajnów i pompę. Umieść bibułę filtracyjną w kombajnie do komórek.
Kontynuuj zbieranie probówek kombajnu komórkowego na pustą pustą tacę. Następnie naciśnij pranie wstępne, aby zwilżyć bibułę filtracyjną. Umieść probówki zbiorcze w dołkach na próbki i zacznij.
Użyj gorącego źródła światła, aby wysuszyć bibułę filtracyjną i ułóż odpowiednie fiolki na tacy. Wybij papierowe płytki do fiolek, a następnie dodaj dwa mililitry płynnego koktajlu scyntylacyjnego do każdej fiolki. Inkubować fiolki przez jedną godzinę w liczniku scyntylacyjnym przed uruchomieniem maszyny, aby uzyskać liczbę na minutę każdej próbki, która odzwierciedla aktywną syntezę DNA.
Wysiewaj 500 000 komórek w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym. Następnie mieszaj naczynie we wszystkich kierunkach, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 46 godzin.
Następnie dodaj dwa mikrolitry na mililitr pięciomilimolowego EdU do kultury i inkubuj przez dwie godziny. Następnie oddziel i zagnieźdź komórki. Do osadu komórkowego dodaj trzy mililitry 30% pożywki ekspansyjnej z lub bez czynników wzrostu lub leków.
Umieść jeden mililitr zawiesiny komórkowej na wstępnie pokrytych naczyniach i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Aby zbadać liczbę neuronalnych komórek prekursorowych w hodowli, po dwóch dniach oznacz i przygotuj probówki do mikrowirówek. Następnie odessać pożywkę ze studzienki i dodać 200 mikrolitrów roztworu do odrywania komórek 1X i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Po odłączeniu komórek dodaj 300 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej 1X fosforanem do każdej studzienki. Za pomocą pipety P1000 kilkakrotnie odpipetować roztwór komórek i odłączyć komórki od płytki. Następnie przenieś roztwór komórkowy do przygotowanej 1,5-mililitrowej probówki i odwróć probówkę dwa do trzech razy.
Za pomocą pipety pobrać 50 mikrolitrów komórek do połowy probówki i dodać do roztworu błękitu trypanowego w probówce o pojemności 0,5 mililitra. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru. Aby uformować neurosferę, należy odpipetować jeden mililitr 100% pożywki eksplatacyjnej do 35-milimetrowego naczynia bez żadnego podłoża powlekającego.
Następnie dodaj milion nerwowych komórek prekursorowych do każdej z tych płytek i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 do 96 godzin. Aby przygotować płytkę do migracji neurosfery, rozpuść podwielokrotności żelu naśladującego ECM w sześciu mililitrach 30% pożywki ekspandacyjnej. Dodaj jeden mililitr żelu naśladującego ECM z 30% podłożem ekspansywnym do jednego dołka sześciodołkowej płytki.
Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Aby pokryć płytki neurosfer, użyj pipety, aby zebrać komórki w pożywce z 35-milimetrowej czaszy i przenieś je do stożkowej probówki. Następnie obróć rurkę z prędkością 100 G, aby ogarnąć neurosfery.
Następnie ponownie zawieś granulat w jednym do trzech mililitrów wstępnie podgrzanego 30% podłoża rozprężnego. Następnie odpipetuj 200 mikrolitrów zawieszonych neurosfer do sześciodołkowej płytki zawierającej żel naśladujący ECM z 30% podłożem ekspansywnym i wstrząśnij płytką. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 48 godzin.
Odessać żel naśladujący ECM z 30% podłożem ekspansywnym, a następnie utrwalić komórki przez 30 minut za pomocą 4% paraformaldehydu. Aby przeanalizować neurosfery, uchwyć obrazy przy użyciu ustawień kontrastu fazowego przy 10-krotnym powiększeniu. Użyj oprogramowania NIH ImageJ, aby zmierzyć średnią migrację neurosfer.
Na ImageJ użyj narzędzia linii odręcznej, aby obrysować zewnętrzny kontur neurosfery. Następnie użyj funkcji miary, aby obliczyć obszar śladu i prześledzić wewnętrzną masę komórkową kuli. Odejmij wewnętrzną masę komórki od całkowitej powierzchni neurosfery, aby określić ilościowo średnią migrację.
Barwienie immunocytochemiczne przeprowadzono w celu zbadania ekspresji białek cytoszkieletu i czynników transkrypcyjnych, takich jak SOX2, PAX6 i gniazdyna, w nerwowych komórkach prekursorowych w trzecim pasażu. Następnie wykonano obrazy z kontrastem fazowym w celu identyfikacji komórek zawierających neuryty. Z obrazu wynika, że komórki z wyrostkami równymi lub dłuższymi niż dwa ciała komórkowe są uważane za zawierające neuryty, podczas gdy komórki z procesami krótszymi niż dwa ciała komórkowe nie są uważane za zawierające neuryty.
Aby potwierdzić powstawanie neurosfery, wykonano obrazy z kontrastem fazowym, które pokazują, że neurosfery zebrane w 72-godzinnym punkcie czasowym mają wielkość od 80 mikrometrów do 120 mikrometrów, a zatem mogą być wykorzystane do testu migracji. Aby określić zdolność proliferacyjną, nerwowe komórki prekursorowe hodowano w warunkach kontrolnych lub czynnika wzrostu fibroblastów i barwiono na obecność EdU. Obrazy fluorescencyjne z kontrastem fazowym pokazują, że komórki traktowane czynnikiem wzrostu fibroblastów mają wyższy odsetek komórek zaangażowanych w fazę S, jak wykazano przez barwienie EdU.
Następnie, aby sprawdzić przerost neurytów, komórki przebadano w warunkach kontrolnych i porównano z PACAP. Wykonano obrazy z kontrastem fazowym, które wykazały wzrost liczby komórek z neurytami poddanymi leczeniu PACAP. Następnie, aby zrozumieć migrację neurosfery, komórki potraktowano neuropeptydami PACAP.
Uzyskane obrazy z kontrastem fazowym wykazują zwiększoną migrację neurosfery w porównaniu z kontrolą. Nasz protokół zawiera wiele technik i testów, z których każda wymaga innej ilości czasu. Po opanowaniu przeciętny test może zająć od dwóch do trzech godzin na konfigurację i od 30 minut do trzech godzin na analizę.
Podczas wykonywania tych procedur ważne jest, aby upewnić się, że używasz wysokiej jakości nerwowych komórek prekursorowych oraz że komórki te są całkowicie zdysocjowane i równomiernie rozmieszczone we wszystkich warunkach, z wyjątkiem testu neurosfery. Po tych procedurach można przeprowadzić inne analizy, w tym Western blot, QRT-PCR, transkryptomikę, proteomikę i metabolomikę w celu scharakteryzowania mechanizmów leżących u podstaw rozliczeń. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół charakteryzuje wczesne procesy rozwoju mózgu w ludzkich komórkach prekursorowych neuronów (NPC) szybko i powtarzalnie. Definiuje również wpływ czynników pozakomórkowych na te procesy, co pomaga w zrozumieniu zaburzeń neuropsychiatrycznych i neurorozwojowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Rozwój nerwowy
- Neuropsychiatria
- Biologia komórkowa
Tło
- Procesy neurorozwojowe mogą być zaburzone w chorobach neuropsychiatrycznych.
- Zrozumienie tych procesów jest kluczowe dla rozwiązywania problemów z nieprawidłowościami komórkowymi u osób dotkniętych chorobą.
- Protokóły oceny NPC mogą dostarczyć informacji na temat różnych zaburzeń.
- Demonstracje wizualne zwiększają zrozumienie złożonych technik.
Cel badania
- Ocena procesów neurorozwojowych w ludzkich NPC pochodzących z iPSC.
- Ocena wpływu czynników wzrostu i leków na rozwój NPC.
- Badanie nieprawidłowości komórkowych w zaburzeniach neuropsychiatrycznych.
Wykorzystane metody
- Charakterystyka NPC poprzez analizy morfologiczne.
- Ocena wpływu czynników pozakomórkowych.
- Szybkie i powtarzalne protokoły postępowania z komórkami.
- Demonstracje wizualne dla złożonych technik.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie ocenia procesy neurorozwojowe.
- Czynniki wzrostu znacząco wpływają na rozwój NPC.
- Metodologia dostarcza informacji na temat zaburzeń neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych.
- Pomoc wizualna poprawia zrozumienie technik postępowania z komórkami.
Wnioski
- Protokół jest szybki, wysoce powtarzalny i łatwy do wdrożenia.
- Może odpowiadać na kluczowe pytania w neuropsychiatrii.
- Uzyskane spostrzeżenia mogą informować strategie terapeutyczne w przypadku zaburzeń.
Najczęściej zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Rapid phenotyping of human neural precursor cells (NPCs) enables early-stage interrogation of neurodevelopmental mechanisms relevant to neuropsychiatric and neurodevelopmental disorders. This approach provides a scalable, reproducible platform for assessing the impact of growth factors and compounds on proliferation, migration, and differentiation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. Integration of these assays into discovery pipelines accelerates disease-relevant hypothesis testing and portfolio triage for CNS drug development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assessment of disease-relevant cellular phenotypes in human NPCs.
- Supports functional validation of targets affecting proliferation, migration, and differentiation.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying responses to growth factors and candidate drugs.
- Provides a platform for comparative analysis across patient-derived and control NPCs.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-throughput assays for proliferation and migration readouts.
- Enables reproducible quantification of neurite outgrowth and neurosphere migration.
- Supports assay scalability and cross-laboratory reproducibility for compound screening.
- Prepares validated NPC systems for downstream molecular and phenotypic analyses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early cellular phenotypes with disease-relevant mechanisms implicated in neurodevelopmental disorders.
- Enables continuity from in vitro discovery to preclinical model validation.
- Supports identification of translational biomarkers linked to early neurodevelopmental processes.
- Facilitates risk-adjusted advancement of CNS therapeutic candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This NPC-based phenotyping platform fits at the intersection of early discovery, target validation, and preclinical research for CNS indications.
- Discovery Biology: Provides quantitative assays for hypothesis testing of proliferation, migration, and differentiation in human NPCs.
- Screening: Offers reproducible, scalable readouts for compound and growth factor effects on neurodevelopmental phenotypes.
- Analytics: Generates quantitative outputs (e.g., DNA synthesis, migration area) enabling statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Bridges early cellular phenotypes to disease mechanisms and potential biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput platform for diverse neurodevelopmental and neuropsychiatric research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target and pathway selection for CNS disorders.
- Operational Value: Delivers rapid, standardized, and reproducible assays for early-stage decision making.
- Strategic Value: Enables efficient go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in CNS portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurodevelopmental therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in human stem cell culture and neural differentiation protocols.
- Needs access to imaging, cell counting, and molecular analysis instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization for assay reproducibility.
- Adaptation may be needed for different hiPSC lines or disease models.
- Assay throughput and analysis time depend on operator proficiency and infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:08
Collecting NPCs for Plating of Experimental Conditions
2:30
Neural Precursor Cell DNA Synthesis Assay
3:47
S Phase Entry Assay
4:39
Neural Precursor Cell Number Assay
5:41
Neural Precursor Cell Neurosphere Migration Assay
7:58
Results: Use of Phase-contrast and Fluorescence Microscopy to Study the Proliferation, Migration, and Neurite Outgrowth of Neural Precursor Cells
9:51
Conclusion
