Name: Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Poznaj metodę łączącą mikroelektrody jonoselektywne z patch clampingiem do pomiaru aktywności wymiennika sodowo-wodorowego (NHE). Technika ta umożliwia precyzyjne badanie transportu protonów przez błonę komórkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Ericowi Fishbackowi (Des Moines University, Des Moines, Iowa, USA) za pomoc w kręceniu i edycji filmu. Komórki podobne do fibroblastów PS120 stabilnie eksprymujące NHE3-wt lub NHE3-YRK zostały dostarczone dzięki uprzejmości dr Marka Donowitza (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).

Uwaga: Do rejestracji aktywności transporterów elektroneutralnych za pomocą samo-referencyjnej elektrody jonoselektywnej (ISE) w połączeniu z techniką patch clamp wymagane są dwa wzmacniacze: wzmacniacz patch clamp do utrzymania komórki w konfiguracji whole-cell oraz wzmacniacz o wysokiej impedancji (elektrometr) do rejestracji aktywności transportera za pomocą ISE (patrz Tabela materiałów). Wzmacniacz patch clamp jest bezpośrednio podłączony do terminala karty akwizycji danych. Elektrometr jest podłączony do wzmacniacza różnicowego służącego do filtrowania i wzmacniania sygnału. Wzmacniacz różnicowy jest podłączony do terminala karty akwizycji danych. W poprzednich badaniach20 wykorzystywano Capmeter, oprogramowanie do patch clamp monitorujące pojemność komórki (patrz Tabela materiałów). Komora rejestracyjna i roztwory perfuzyjne są utrzymywane w temperaturze 37 °C.
1. Przygotowanie pipet do ISE
<ol>
	<li>Wytnij pipety z kapilar borokrzemianowych do średnicy zewnętrznej 1,2 mm (patrz Tabela materiałów) za pomocą wyciągarki do pipet2 .</li>
	<li>Wypoleruj pipetę za pomocą mikrokuźni. Średnica końcówki pipety powinna wynosić 2-3 µm.</li>
	<li>Umieść pipety w uchwycie słoikowym do pipet końcówką skierowaną do góry (patrz Tabela materiałów). 
	UWAGA: Kroki 1.4-1.6 należy przeprowadzić w dobrze wentylowanej dygestorium chemicznym.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę do silikonizacji składającą się z 1 kropli (~150 µL) bis(dimetylamino)dimetylosilanu i 10 kropli tetrachlorku węgla (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Wlej mieszaninę do silikonizacji do słoika i szczelnie zamknij pokrywkę.</li>
	<li>Inkubuj słoik z mieszaniną do silikonizacji przez 24-48 h w dygestorium chemicznym w temperaturze pokojowej, aż mieszanina całkowicie odparuje.</li>
	<li>Wypełnij pipetę od tyłu odpowiednią żywicą jonoselektywną, aby utworzyć kolumnę o długości około 2-4 mm. 
	UWAGA: Do rejestracji aktywności NHE można użyć Hydrogen ionophore I cocktail B (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Opukaj końcówkę pipety, aby rozprowadzić żywicę jonoselektywną do samego końca, a następnie umieść pipetę pionowo w uchwycie słoikowym końcówką skierowaną w dół.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem stereoskopowym, czy koktajl żywiczny dotarł do końca końcówki. W razie potrzeby zastosuj nadciśnienie, aby przepchnąć żywicę do końca.</li>
	<li>Wypełnij połowę pipety od tyłu odpowiednim roztworem (~ 100 μL). W przypadku użycia ionophore I cocktail B należy zastosować 100 mM KCl i 10 mM HEPES o pH 7,0.</li>
	<li>Podłącz ISE do elektrometru i umieść końcówkę ISE w roztworze kąpieli używanym do rejestracji. Wyzeruj elektrometr.</li>
	<li>Przetestuj odpowiedź H+-selektywnej ISE poprzez zmianę pH roztworu kąpieli. Średnia odpowiedź H+-selektywnej ISE wynosi ~ 58 mV na jednostkę pH.</li>
	<li>Okresowo oceniaj odpowiedź ISE w celu kalibracji.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pipet do techniki patch-clamp do rejestracji
UWAGA: Zaleca się metodę opisaną przez Donalda Hilgemanna w jego artykule na temat rejestracji jednokanałowej21.
<ol>
	<li>Wytnij pipety do techniki giant patch z kapilar z borokrzemianowego szkła (2,0 mmOD / 1,5 mm ID) za pomocą wyciągarki do pipet2,22,23.</li>
	<li>Użyj mikrokuźni zamontowanej na stole mikroskopu odwróconego, aby wykonać szeroką końcówkę pipety (10 - 22 μm)23. Roztop kropelkę (~ 0,5 mL) miękkiego szkła na grubym platynowym drucie mikrokuźni. 
	UWAGA: Do wykonania pipet do techniki giant patch wymagany jest stosunkowo gruby drut platynowy (~0,5 mm).</li>
	<li>Ustaw pipetę do patch-clampu blisko kropelki miękkiego szkła i przykładaj pełne ciepło, aż końcówka zacznie się cofać. Podczas nagrzewania drut platynowy będzie lekko przesuwał się w stronę środka.</li>
	<li>Wyłącz ogrzewanie i wciśnij końcówkę pipety w zmiękczoną kropelkę szkła. Stygnący drut cofnie się, odrywając końcówkę pipety.</li>
	<li>Ponownie zastosuj ciepło, aby wygładzić końcówkę pipety i uzyskać pożądaną średnicę. Średnica końcówki zależy od wielkości komórki poddawanej badaniu (w niniejszym badaniu 8 - 10 μm).</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Podgrzać bufor fosforanowy (PBS) bez Ca2+ i Mg2+, roztwór trypsyny z EDTA oraz pożywkę wzrostową do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie buforem PBS. Dla płytki do hodowli komórek o średnicy 35 mm należy użyć 1 mL buforu.</li>
	<li>Dodać 0,5 mL trypsyny do komórek w płytce do hodowli o średnicy 35 mm. 
	Uwaga: Gdy komórki zaczną przybierać okrągły kształt, należy potrząsnąć płytką, aby odspoić komórki.</li>
	<li>Zatrzymać działanie trypsyny, dodając 5 mL (ilość dla płytki do hodowli komórek o średnicy 35 mm) pełnej pożywki wzrostowej uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej. 
	UWAGA: Czas inkubacji z trypsyną zależy od rodzaju komórek.</li>
	<li>Umieścić komórki na wytrząsarce z funkcją kołysania, aby zapobiec tworzeniu się agregatów.</li>
	<li>Wykorzystać komórki w czasie do 2 h po trypsynizacji. 
	UWAGA: Czas ten może się różnić w zależności od linii komórkowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie wewnątrzpipetowego systemu perfuzji
<ol>
	<li>Odetnij odpowiedni odcinek rurki kwarcowej (150 µm OD / 75 µm ID), aby przygotować linię perfuzji wewnątrzpipetowej.</li>
	<li>Wsuń jeden koniec rurki kwarcowej do końcówki pipety o pojemności 200 µL. Przyklej rurkę kwarcową do końcówki, a następnie odetnij koniec końcówki ostrym ostrzem żyletki.</li>
	<li>Połącz linię perfuzji (rurkę kwarcową przyklejoną do końcówki) z krótkim odcinkiem rurki silikonowej, która będzie służyć jako zbiornik dla roztworu do perfuzji wewnątrzpipetowej.</li>
	<li>Połącz rurkę silikonową ze strzykawką, aby wytworzyć nadciśnienie.</li>
	<li>Wsuń wolny koniec rurki kwarcowej przez polietylenową rurkę uchwytu pipety w porcie perfuzyjnym (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Sprawdź drożność linii perfuzji, używając roztworu pipetowego.</li>
</ol>
5. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Przygotować silnie buforowany roztwór do pipety do rejestracji NHE (115 mM aspar긴ianu potasu (KAsp), 1 mM EGTA, 0,5 mM MgCl2, 10 mM Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, 12,5 mM PIPES, 12,5 mM MOPS oraz 12,5 mM MES, pH 6,0 skorygowane kwasem asparginowym). 
	UWAGA: Przygotować roztwór stokowy do pipety i przefiltrować go. Mg-ATP dodać przed rozpoczęciem rejestracji.</li>
	<li>Za każdym razem przygotować świeży roztwór do kąpieli (140 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 oraz 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).</li>
</ol>
6. Rejestracja aktywności transportera
<ol>
	<li>Utrzymywać komorę rejestracyjną oraz wszystkie roztwory w temperaturze 37 °Cponieważ aktywność transportera jest zależna od temperatury.</li>
	<li>Umieść komórki w komorze pomiarowej. Odczekaj, aż opadną one na dno komory, ale nie dopuść do ich przywarcia do ścianek komory.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią komórkę. Zmierz średnicę komórki za pomocą mikrometru okularowego. Wybierz komórki o podobnych średnicach. 
	UWAGA: Zazwyczaj duża komórka posiada większą powierzchnię komórkową i potencjalnie więcej transporterów eksponowanych na swojej błonie plazmatycznej, co przekłada się na wyższą aktywność transporterów. Nie musi to być jednak zawsze prawdą, ponieważ aktywność transporterów zależy od konkretnego transportera oraz badanego typu komórek.</li>
	<li>Zamocuj pipetę mikroelektrody selektywnej jonowo do mikromanipulatora, wypełnij pipetę do patch-clampingu od tyłu roztworem wewnątrzkomórkowym i upewnij się, że roztwór dotarł do końcówki pipety.2. 
	UWAGA: Usunięcie pęcherzyków powietrza z końcówki pipety może wymagać kilku delikatnych uderzeń.</li>
	<li>Zamocuj pipetę do patch-clampingu do głowicy układu elektrofizjologicznego2,22,23. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zachować kąt nachylenia głowicy ok. 45 stopni względem osi poziomej, ponieważ zapewnia to kąt wprowadzenia pipety odpowiedni do utworzenia bardzo szczelnego uszczelnienia (seal).</li>
	<li>Przyłożyć niewielkie nadciśnienie (~ 5 cm H2O)2do pipety patch, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki, a następnie umieść ją w roztworze kąpielowym.</li>
	<li>Przestań przesuwać pipetę do patch-clampu, gdy jej końcówka znajdzie się blisko komórki.</li>
	<li>Zredukuj ciśnienie dodatnie w momencie, gdy pipeta dotyka komórki, a następnie zastosuj niewielkie ciśnienie ujemne (~ 5 cm H2O)2O) aby uzyskać &gt;uszczelnienie rzędu 1000 MΩ (gigaomowe) na błonie komórkowej za pomocą pipety patchowej23.</li>
	<li>Umieść pipetę do patch-clampu z komórką w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co elektroda ISE, a następnie przesuń pipetę z komórką w pobliże elektrody ISE (~ 5 – 10 µm)2,5 ale należy unikać kontaktu komórki z ISE (Rycina 1A).</li>
	<li>Upewnij się, że potencjał holdingowy wynosi 0 mV.</li>
	<li>Przerwij uszczelnienie za pomocą serii krótkich zasysań, aby uzyskać konfigurację whole-cell.</li>
	<li>Powoli przesuwaj elektrodę ISE (lub pipetę do patch-clampu) w lewo-prawo lub w górę-dół, aby zarejestrować aktywność transportera (Rycina 1B).</li>
	<li>Zarejestruj co najmniej 5–8 pików (Rysunek 1C, od A do B).</li>
	<li>Podczas rejestracji należy stosować perturbacje prostokątne w celu monitorowania jakości uszczelnienia oraz pojemności błony komórkowej (Rysunek 1).</li>
	<li>Oszacuj H+ strumień (<img alt="symbol J&lt;sub&gt;H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&lt;/sub&gt;, równanie stanu równowagi statycznej, metody zapisu chemicznego." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">) z różnicy w wolnych H+ stężenie pomiędzy powierzchnią komórki a roztworem objętościowym (ΔH+) 
	<img alt="Wzór na równowagę chemiczną, JH+=(moli/s), obejmuje ΔH+, współczynniki dyfuzji; schemat do analizy." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"> 
	<img alt="Równanie równowagi wiązania; wzór do analizy oddziaływań ligandów." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 3"> 
	UWAGA: <img alt="Symbol współczynnika dyfuzji D&lt;sub&gt;H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&lt;/sub&gt; dla badań transportu jonów w chemii." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 4"> i <img alt="Schemat chromatografii, wzór D_B, metoda rozdziału chemicznego, eksperyment badawczy." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 5"> czy H+ oraz współczynników dyfuzji buforu odpowiednio, BT jest całkowite stężenie buforu, KD jest stała dysocjacji buforu, r jest promieniem komórki, a <img alt="Równowaga statyczna, równanie ΔBᵢ/ΔH; analiza wzoru, badania edukacyjne, koncepcja fizyczna." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 6"> wyznacza zmianę stanu stacjonarnego w stężeniu związanego H+ dla niewielkiej zmiany stężenia wolnych jonów H++. H+ oznacza wolny proton w roztworze. Aby zachować spójność z poprzednimi badaniami, H+ strumienie są przeliczane na jednostki strumienia elektrofizjologicznego poprzez obliczenie równoważników prądowych strumieni (<img alt="symbol J&lt;sub&gt;H&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt;&lt;/sub&gt;, równanie równowagi statycznej, metody zapisu chemicznego." src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1">(/faraday) w pA3,5].</li>
	<li>Znormalizuj strumień protonów do powierzchni komórki, którą można obliczyć na podstawie rozmiaru komórki, lub do pojemności błonowej.</li>
</ol>

<ol><li>Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potentiating+SLC+transporter+activity%3A+Emerging+drug+discovery+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities.</a> Biochem Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+fluxes+in+giant+excised+cardiac+membrane+patches+detected+and+quantified+with+ion-selective+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes.</a> J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).</li>
<li>Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biophysical+and+molecular+basis+of+intracellular+pH+sensing+by+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3.</a> FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+function+of+the+ubiquitous+mammalian+Na%2FH+exchanger+%28NHE1%29+in+relation+to+dimer+coupling+models+with+2Na%2F2H+stoichiometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry.</a> J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).</li>
<li>Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-+and+mechanosensitivities+of+sodium%2Fhydrogen+exchangers+analyzed+by+electrical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).</li>
<li>Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrogenic+kinetics+of+a+mammalian+intestinal+type+IIb+Na%28%2B%29%2FP%28i%29+cotransporter%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter.</a> J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).</li>
<li>Smith, P. J., Trimarchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+measurement+of+hydrogen+and+potassium+ion+flux+from+single+cells+and+epithelial+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).</li>
<li>Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+extracellular%2C+ion-selective+microelectrodes+to+study+the+function+of+heterologously+expressed+transporters+in+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243(2009).</li>
<li>Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+PJS+%22Electrochemical+Methods+for+Neuroscience%22">Electrochemical Methods for Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis. 373-406 (2007).</li>
<li>Orlowski, J., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+mammalian+sodium%2Fproton+exchanger+SLC9+gene+family%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family.</a> Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).</li>
<li>Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+origins+of+eukaryotic+sodium%2Fproton+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers%3A+physiology+and+link+to+hypertension+and+organ+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Nephrol+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia.</a> Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).</li>
<li>Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC9%2FNHE+gene+family%2C+a+plasma+membrane+and+organellar+family+of+Na%28%2B%29%2FH%28%2B%29+exchangers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).</li>
<li>Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+intestinal+Na%2B%2FH%2B+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange.</a> Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).</li>
<li>Girardi, A. C., Di Sole, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+mechanisms+of+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger-3+regulation+in+organ+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).</li>
<li>Bobulescu, I. A., Moe, O. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B%2FH%2B+exchangers+in+renal+regulation+of+acid-base+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance.</a> Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+and+intriguing+lives+of+PIP2+with+ion+channels+and+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters.</a> Sci STKE. (111), re19(2001).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NHE3+activity+is+dependent+on+direct+phosphoinositide+binding+at+the+N+terminus+of+its+intracellular+cytosolic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).</li>
<li>Alexander, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+surface+charge+dictates+the+structure+and+function+of+the+epithelial+Na%2B%2FH%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger.</a> EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).</li>
<li>Wang, T. M., Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca-dependent+nonsecretory+vesicle+fusion+in+a+secretory+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell.</a> J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).</li>
<li>Hilgemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHilgemann%2C+DW+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 307-328 (1995).</li>
<li>Hilgemann, D. W., Lu, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+membrane+patches%3A+improvements+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Giant membrane patches: improvements and applications.</a> Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).</li>
<li>Matsuoka, S., Takeuchi, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatsuoka%2C+S+%22Patch+Clamp+Techniques%22">Patch Clamp Techniques</a>. Okada, Y. , Springer. 207-218 (2012).</li>
<li>Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L'Allemain, G., Paris, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+mutation+abolishing+Na%2B%2FH%2B+antiport+activity+in+hamster+fibroblasts+precludes+growth+at+neutral+and+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).</li>
<li>Ogden, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVoipio%2C+J+%22Microelectrode+Techniques+-+The+Plymouth+Workshop+Handbook%22">Microelectrode Techniques - The Plymouth Workshop Handbook</a>. , The Company of Biologists Ltd. 275-316 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Pomimo kluczowych funkcji transporterów, dostępne metody badania ich aktywności są nieskuteczne i niewystarczające. Jednym z ograniczeń jest fakt, że dostępne metody mierzą ruch jonów pośredniczony przez aktywność transporterów bez uwzględnienia wahań wewnątrzkomórkowego składu jonowego podczas eksperymentu4. Przedstawiona metoda zapewnia precyzyjną kontrolę pozakomórkowego i wewnątrzkomórkowego składu jonowego oraz oferuje potężne narzędzie do modyfikowania wewnątrzkomórkowego składu jonów, białe...

Transport jonów i substancji rozpuszczonych przez błonę plazmatyczną jest niezbędny dla przetrwania komórek, a co za tym idzie, organizmów1. Selektywny transport jonów i substancji rozpuszczonych jest osiągany przez szereg wyspecjalizowanych białek kanałowych i transportowych. Mutacje w tych białkach często prowadzą do różnych stanów klinicznych, co sprawia, że białka kanałowe i transportowe stają się potencjalnymi celami leczenia farmakologicznego1. Niestety, zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw funkcji i regulacji kanałów i transporterów jest często ograniczone przez dostępne podejścia do badania ich aktywności2,3,4.
Konkretnie, transportery można z grubsza podzielić na dwie duże grupy w zależności od tego, czy zmieniają potencjał transbłonowy komórki podczas transportu substancji rozpuszczonych: zmieniające się transportery jonów elektrogenicznych [np. kotransporter sodowo-fosforanowy 2a (NaPi2a), wymiennik sodowo-wapniowy (NCX), itp.] lub niezmieniające się transportery jonów elektroneutralnych [np. wymiennik sodowo-protonowy (NHE), kotransporter sodowo-chlorkowy, NaPi2c, itp.]. Aktywność obu klas transporterów została szeroko przebadana przy użyciu wychwytu izotopów promieniotwórczych i barwników fluorescencyjnych przenikających błonę2. Oba podejścia szacują aktywność transporterów poprzez pomiar zmian w stężeniu masowym określonych jonów cytoplazmatycznych i obie metody mają ograniczenia, takie jak umiarkowana czułość i rozdzielczość czasowa oraz niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego. Rzeczywiście, aktywność wielu transporterów zależy od stężenia cytoplazmatycznego przenoszonych jonów (np. NHE3, NCX), a oczekuje się, że zmiany tych stężeń jonów będą odgrywać znaczącą rolę w regulacji aktywności transportera2,3,5. Precyzyjny pomiar tych mechanizmów regulacyjnych jest ograniczony przy użyciu klasycznych metod.
Aby przezwyciężyć te ograniczenia, do badania aktywności transportera stosuje się metody zaciskania krosowego2,6. W szczególności samoreferencyjne elektrody jonoselektywne (ISE)7,8 w połączeniu z systemem zaciskania krosówek umożliwiły ostatnio pomiar aktywności transportera elektroneutralnego3,4,5. ISE opierają się na fakcie, że aktywność transportera tworzy gradient jonów w bliskiej odległości od błony komórkowej. ISE poruszający się w górę i od błony komórkowej w powtarzalny, oscylacyjny sposób rejestruje różnicę napięcia (μV). Różnice napięć można przekształcić w wartości strumienia jonów za pomocą metody kalibracji, która stosuje pierwszą zasadę dyfuzji Ficka2,9. Podczas gdy ISE są używane do wykrywania strumienia jonów wychodzących z komórek, metoda patch clamp zarówno w konfiguracjach całej komórki, jak i na lewą stronę jest stosowana do kontrolowania potencjału błonowego i wewnątrzkomórkowego składu jonów. Co więcej, zastosowanie techniki giant patch clamp pozwala na modyfikację wewnątrzkomórkowego składu nie tylko jonów, ale także lipidów i białek3,5.
Podsumowując, wszechstronność metody zaciskania krostek w porównaniu z innymi metodami do badania aktywności transportera sprawiła, że zaciskanie łat jest odpowiednie do przezwyciężenia typowych ograniczeń tych innych metod. Połączenie samoreferencyjnych ISE i technik patch clamp oferuje unikalną możliwość pomiaru aktywności transporterów elektroneutralnych w ściśle kontrolowanym środowisku eksperymentalnym oraz odkrycia nowych biofizycznych i molekularnych właściwości transportu błony komórkowej3,4,5. Podejście to zostało z powodzeniem wykorzystane do badania aktywności NHE. Rodzina białek NHE ssaków katalizuje elektroneutralną wymianę netto zewnątrzkomórkowego sodu (Na+) na wewnątrzkomórkowy proton (H+)10,11 wykorzystując wewnętrzny gradient Na+. U ssaków rodzina białek NHE obejmuje 11 pokrewnych białek (NHE1-9 i NHA1-2) oraz specyficzne dla plemników NHE10,12,13.
NHE (rodzina SLC9a) są powszechnie spotykane w większości organizmów żywych, od prostych prokariontów do wyższych eukariontów i są zaangażowane w różne funkcje życiowe komórek10,11, w tym kontrolowanie obrony komórek przed zasoleniem u prokariontów, utrzymywanie homeostazy kwasowo-zasadowej i objętości komórek oraz regulowanie wchłaniania soli i wody w różnych wyspecjalizowanych nabłonkach10,12,14,15. Kluczowe role biologiczne NHE i znaczenie ich funkcji zostały określone w kilku badaniach; jednak niewiele badań dotyczyło biofizycznych i molekularnych właściwości NHE ssaków ze względu na ograniczenia metodologiczne4. Niedawne zastosowanie samoreferencyjnych ISE podczas zaciskania łatek w całych komórkach ujawniło nowe mechanizmy molekularne izoform NHE regulowanych przez zmiany w wewnątrzkomórkowych stężeniach jonów, białek i fosfolipidów3,4.
W szczególności, protokół zawarty w tym manuskrypcie przedstawia metody i podejścia do badania aktywności i regulacji izoformy NHE 3 (NHE3), głównego gracza w absorpcji Na+, Cl-, HCO3- i płynu w błonie granicznej nabłonka nerek i jelit14,16. Przedstawiono nowe informacje na temat różnic we wrażliwości aktywności NHE3 na wewnątrzkomórkowe fosfoinozytydy (4,5-bisfosforan fosfatydyloinozytylu [PI(4,5)P2] i fosfatydyloinozytod 3,4,5-trifosforan [PI(3,4,5]P3]). Białka transportu komórkowego, takie jak kanały i transportery, są regulowane przez fosfoinozytydy17, a NHE3 bezpośrednio wiąże zarówno PI(4,5)P2, jak i PI(3,4,5)P318. Opierając się na aktualnej literaturze, fosfoinozytyd może być istotny dla fizjologicznej lub patofizjologicznej regulacji NHE35,18,19. Nasze odkrycia potwierdzają odrębne role PI(4,5)P2 i PI(3,4,5)P3 w regulacji aktywności NHE3. To rozróżnienie było możliwe dzięki zastosowaniu technik ISE w połączeniu z nagrywaniem z użyciem clampu krosowego całej komórki. Technika ta umożliwia również kontrolę zawartości komórkowej fosfoinozytolu poprzez wewnątrzkomórkową perfuzję różnych fosfoinozytydów podczas pomiaru aktywności NHE3.

<table><tbody><tr><td>Wzmacniacz z zaciskiem krosowym</td> Urządzenia <td></td><td></td><td>molekularne</td></tr><tr><td>Dwukanałowy elektrometr różnicowy (HiZ-223)</td>Wzmacniacz różnicowy <td>Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>(DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do zaciskania krosowego oparte na MatLab</td><td>MatLab z zestawem</td><td></td> narzędzi do akwizycji <td>Zalecane</td></tr> <tr><td>jest oprogramowanie capmeterSystem kontroli temperatury ThermoClamp-1</td><td>&nbsp; AutoMate Scientific</td><td>03-11-LL</td><td>Nagrzewnica liniowa</td></tr><tr><td>Jednokanałowy regulator temperatury (TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Jednolufowe standardowe rurki ze szkła borokrzemianowego</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&nbsp; &nbsp;</td><td>Używany do elektrod jonoselektywnych</td></tr><tr><td>Słoik do przechowywania mikropipet</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimetyloamino)dimetylosilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Czterochlorek węgla</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Jonofor wodorowy I - koktajl B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne rurki borokrzemianowe</td><td>&nbsp; Instrument Sutter</td><td>B200-156-15</td><td>Używany do pipety z zaciskiem krosowym&nbsp;</td></tr><tr><td>Miękkie szkło (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Rurka kapilarna z krzemionki (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Używana do systemu perfuzji wewnątrzpipetowej</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Asparaginian potasu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>RURY</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apyraza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Bisfosforan fosfatydyloinozytolu(4,5) diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>3,4,5-trifosforan fosfatydyloinozytolu diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

Transport jonów przez błony komórkowe zapewnia precyzyjną kontrolę zawartości jonów wewnątrz i na zewnątrz komórki, która jest niezbędna do przetrwania komórki. W tych mechanizmach transportu pośredniczą działania wyspecjalizowanych białek transportowych. W szczególności dynamika pH jest precyzyjnie kontrolowana przez systemy wytłaczania protonów z błoną plazmatyczną (H+), takie jak rodzina białek wymiennika Na+/H+ (NHE). Pomimo szeroko zakrojonych wysiłków mających na celu zbadanie mechanizmów leżących u podstaw regulacji NHE, nasza obecna wiedza na temat biofizycznych i molekularnych właściwości rodziny NHE jest niewystarczająca ze względu na ograniczoną dostępność metod skutecznego pomiaru aktywności NHE. W tym manuskrypcie użyliśmy elektrod selektywnych H+ podczas nagrywania zaciskania łat na całe ogniwa, aby zmierzyć strumień H+ indukowany przez NHE. Zaproponowaliśmy to podejście, aby przezwyciężyć pewne ograniczenia zwykle stosowanych metod pomiaru aktywności NHE, takich jak wychwyt radioaktywny i przepuszczalność błon fluorescencyjnych. Pomiar aktywności NHE za pomocą opisanej metody umożliwia uzyskanie wysokiej czułości i rozdzielczości czasowej oraz skuteczniejszą kontrolę wewnątrzkomórkowych stężeń H+. Elektrody selektywne H+ opierają się na fakcie, że aktywność transportera tworzy gradient jonów w bliskiej odległości od błony komórkowej. Elektroda selektywna H+ poruszająca się w górę i od błony komórkowej w powtarzalny, oscylacyjny sposób rejestruje różnicę napięcia, która jest zależna od strumienia H+. Podczas gdy elektrody selektywne H+ są używane do wykrywania strumienia H+ wychodzącego z ogniwa, metoda patch clamp w konfiguracji całego ogniwa służy do kontrolowania wewnątrzkomórkowego składu jonowego. Co więcej, zastosowanie techniki giant patch clamp pozwala na modyfikację wewnątrzkomórkowego składu nie tylko jonów, ale także lipidów. Aktywność transportera izoformy 3 NHE (NHE3) zmierzono przy użyciu tego podejścia technicznego w celu zbadania molekularnych podstaw regulacji NHE3 przez fosfoinozytydy.

W celu zbadania regulacji aktywności NHE3 przez fosfoinosytolami zastosowano samoodnośną elektrodę jonoselektywną (ISE) podczas rejestracji metodą patch clamp w konfiguracji whole-cell. Wykorzystano komórki fibroblastopodobne PS12024, w których nie występuje ekspresja endogennych NHE błony komórkowej. W komórkach fibroblastopodobnych PS120 stabilnie wyeksprymowano NHE3 typu dzikiego (NHE3-wt) lub mutanty NHE3, które nie wiążą fosfoinosytoli [tyrozyna 501, arginina ...

Ten manuskrypt opisuje zastosowania elektrod selektywnych protonów i metod zaciskania krostek do pomiaru aktywności systemów transportu protonów. Metody te przezwyciężają pewne ograniczenia technik powszechnie stosowanych do badania aktywności transportu protonów, takie jak umiarkowana czułość, rozdzielczość czasowa i niewystarczająca kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

Metoda gigantycznych plam w połączeniu z mikroelektrodami jonoselektywnymi jest wszechstronną metodą stosowaną do wykrywania i ilościowego określania strumieni jonów. W szczególności służy do pomiaru strumieni protonów generowanych przez aktywność elektroobojętnego transportera jonów, wymiennika sód-wodór lub NHE, który ulega ekspresji na błonie komórkowej. Wymiennik sodowo-wodorowy generuje gradient protonów w bliskiej odległości od błony plazmatycznej, oznaczony tutaj jako pomarańczowy pierścień.Ten gradient protonów w poprzek błony komórkowej jest mierzony za pomocą zapisu klamry krosowej całej komórki w połączeniu z techniką wykorzystującą mikroelektrodę selektywną dla protonów. Mikroelektroda selektywna protonów jest przesuwana blisko powierzchni ogniwa, gdzie rejestruje strumień protonów wychodzących z komórek, pokazany tutaj w pozycji A. I od powierzchni komórki, gdzie rejestruje stężenie wolnych protonów obecnych w roztworze wskazanym przez pozycję B. A następnie, z powrotem do pozycji A, blisko błony komórkowej, w powtarzalnym, oscylacyjnym ruchu. Różnica napięcia między A a B jest rejestrowana i zależy od przedstawiciela aktywności NHE.Jony transportujące, takie jak protony, przez błonę komórkową, wpływają na proces niezbędny do życia. Dlatego zmiany pH są ściśle regulowane przez szereg cząsteczek, w tym wymiennik sodowo-protonowy, system wykluczania protonów przez błonę plazmatyczną. Oscylująca mikroelektroda pH w połączeniu z zaciskaniem łat na całe ogniwo to nowatorskie podejście do badania strumienia protonów, w którym pośredniczy aktywność wymiennika sodowo-protonowego.Zastosowanie tych metod pozwala przezwyciężyć niektóre z głównych ograniczeń zwykle stosowanych technik pomiaru aktywności wymieniacza sodowo-protonowego, takich jak umiarkowana czułość i rozdzielczość czasowa oraz dobra kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego. Zademonstruję te metody wraz z moim współpracownikiem, dr Victorem Babichem. Narratorem będzie dr Matthew Henry.Zamierzamy zademonstrować zastosowanie tej metody, mierząc aktywność izoformy trójki wymiennika sodowo-protonowego, która jest głównym regulatorem wchłaniania soli z wody przez jelito i epithilium nerkowe. Mikroelektrody selektywne protonowe do pomiaru stężenia protonów są wykonane ze standardowych rurek ze szkła borokrzemowego. Elektrody ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 milimetra i bez żarnika są ciągnięte za pomocą pionowego ściągacza, przy użyciu konwencjonalnego protokołu podwójnego ciągnięcia.Uzyskuje się końcówkę pipety o średnicy od dwóch do trzech mikrometrów. Pipety umieszcza się w uchwycie na słoik końcówką pipety skierowaną do góry. Następnie przygotowuje się mieszaninę do silikonowania pipet.Wlewa się go do słoika i szczelnie zamyka pokrywkę. Pipety inkubuje się z mieszaniną silikonową przez 24 do 48 godzin. Zachowaj ostrożność, pamiętaj o przygotowaniu mieszaniny i silikonowaniu pipet w temperaturze pokojowej w dobrze wentylowanym oparze chemicznym.Z powrotem napełnij pipetę odpowiednią żywicą jonoselektywną i ostrożnie umieść ją pionowo w uchwycie słoika, końcówką pipety skierowaną w dół. Aby przygotować się do zaciskania krosowego, należy rozpocząć od wyciągnięcia pipet do mocowania krosowego z cienkościennego szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej dwóch milimetrów i średnicy wewnętrznej 1,4 milimetra w ściągaczu pionowym przy użyciu konwencjonalnego protokołu podwójnego ciągnięcia. Użyj mikrokuźni zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego, aby wykonać szeroką końcówkę pipety.Umieść pipetę w pobliżu grubego drutu platynowego mikrokuźni. Włącz ogrzewanie za pomocą przełącznika nożnego, który steruje włączaniem i wyłączaniem prądu. Podgrzej szkło o niskiej temperaturze topnienia, które pokrywa środek grubego drutu platynowego mikrokuźni, a następnie przesuń końcówkę pipety bliżej stopionego miękkiego szkła.Ogrzewanie przesuwa drut platynowy lekko w kierunku środka. Drut platynowy powraca do pozycji wyjściowej, a końcówka pipety pęka. Powtarzaj procedurę, aż uzyskasz pożądaną średnicę końcówki, a na koniec podgrzej, aby wygładzić końcówkę.Końcówki do pipet mają średnicę 10 mikrometrów po wypolerowaniu za pomocą mikrokuźni. Zastosowanie grubego drutu platynowego jest korzystne, ponieważ po włączeniu prądu następuje niewielkie rozszerzanie się i mniejsza możliwość przegrzania drutu i pipety przy nadmiernym prądzie. Po dysocjacji komórek za pomocą trypsyny i zablokowaniu trypsynizacji, komórki są utrzymywane na wytrząsarce z kołysaniem, aby zapobiec tworzeniu się grudek.Odbywa się to do dwóch godzin po próbpsynizacji. Zestaw elektrofizjologiczny składa się z regulatora temperatury do regulacji temperatury roztworu w systemie perfuzyjnym. Wszystkie eksperymenty wykonywane są w temperaturze około 37 stopni Celsjusza.Oraz przełącznik filtrów optycznych do sterowania kołem filtrów do obrazowania fluorescencyjnego. Sterownik zaworu systemu perfuzyjnego do regulacji otwierania i zamykania zaworów systemu perfuzyjnego. I regulator temperatury do regulacji temperatury komory nagrywającej.Oscyloskop do obserwacji przebiegów i wzmacniacz z zaciskiem krosowym. Komputer z tym oprogramowaniem Capmeter. I elektrometr do rejestrowania jonoselektywnego sygnału mikroelektrody.I wzmacniacz różnicowy do wzmacniania sygnału elektrometru. Stanowisko do elektrofizjologii wyposażone jest również w mikroskop odwrócony ze stopniem sterowania, dwa mikromanipulatory ze sterownikami umieszczonymi po lewej i prawej stronie mikroskopu, system perfuzyjny z wbudowaną grzałką roztworu. Po zamontowaniu pipety mikroelektrody jonoselektywnej do mikromanipulatora, należy ponownie napełnić pipetę do zaciskania plastrów roztworem wewnątrzkomórkowym.Upewnij się, że roztwór dotrze do końcówki pipety. Może to wymagać kilku delikatnych stuknięć w celu wyeliminowania pęcherzyków na końcówce pipety. Następnie zamontuj pipetę do mocowania plastra na głowicy zestawu do elektrofizjologii.Delikatnie przenieś zdrowo wyglądające komórki do komory rejestracyjnej wypełnionej określoną objętością roztworu kąpieli. Ważne jest, aby stopień czołowy był ustawiony pod kątem 45 stopni do osi poziomej. Zapewnia to kąt przystawienia pipety, który jest odpowiedni do utworzenia wysoce wytrzymałego uszczelnienia.Podczas gdy pipeta z zaciskiem krosowym jest zanurzona w roztworze do kąpieli, należy przyłożyć niewielką ilość dodatniego ciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki. Wybierz komórkę i zbliż się do niej z niewielką ilością nadciśnienia. Przestań przesuwać pipetę z zaciskiem krosowym, gdy końcówka znajdzie się blisko ogniwa.Obniż mikroelektrodę jonoselektywną w roztworze kąpieli, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej końcówki pipety z zaciskiem krosowym. Gdy pipeta jest umieszczona centralnie nad celą, zainicjuj uszczelnienie, przykładając niewielką ilość podciśnienia. Uszczelnienie mega-omowe uzyskuje się w ciągu kilku sekund.Upewnij się, że potencjał podtrzymania jest utrzymywany przez amplifier na poziomie zero miliwoltów. Na koniec rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania i rozpocznij nagrywanie. Korzystając z metody zapisu gigantycznej plamy, możliwe jest szybkie perfuzjowanie roztworów w szklanej pipecie za pomocą systemu perfuzji wewnątrzpipetowej w celu modyfikacji wewnątrzkomórkowej zawartości jonów, lipidów i białek.Umieść pipetę mikroelektrody jonoselektywnej blisko ogniwa trzymanego przez pipetę z zaciskiem krosowym i rozpocznij oscylację pipety mikroelektrodowej jonoselektywnej, przesuwając ją do i z ogniwa. Zastosowanie tej techniki pozwala na badanie regulacji molekularnej wymiennika sodowo-wodorowego. Wykorzystując metodę gigantycznych plam, wewnątrzkomórkowy skład ATP i lipidów został zmodyfikowany za pomocą systemu perfuzyjnego w pipetach.Wewnątrzkomórkowa perfuzja apyrazy, która hydrolizuje wewnątrzkomórkowe ATP i zmniejsza zawartość fosfoinozytolu, spowodowała 50% spadek aktywności izoformy trzeciej NHE. Wpływ apirazy na aktywność NHE3 nie został odwrócony przez wewnątrzkomórkową perfuzję fosfoinozytydu PIP2. Zostało to jednak odwrócone przez wewnątrzkomórkową perfuzję fofonozytydu PIP3.Pomiar aktywności NHE opiera się na połączeniu metod selektywnej mikroelektrody protonowej i zaciskania kropek. Pozwala to na badanie molekularnych podstaw stojących za różnicową regulacją NHE przez fosfoinozytydy i kaskady sygnałowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć aktywność wymiennika sodowo-protonowego za pomocą oscylacyjnej mikroelektrody pH w połączeniu z zaciskaniem wszystkich łatek ogniw.I przykład możliwego zastosowania tych metod.

application-electrophysiology-measurement-to-study-activity-electro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Istnieją przeszkody techniczne w jednoczesnym pomiarze przepływu prądu przez wiele kanałów jonowych, a następnie w rozróżnieniu, jaka część prądu transbłonowego wynika z każdego typu kanału. Aby zaspokoić tę potrzebę, niniejsza metoda przedstawia sposób generowania krzywej IV dla poszczególnych typów kanałów z wykorzystaniem specyficznych komponentów częstotliwościowych.

Rekapitulacja krzywej IV kanału jonowego z wykorzystaniem składowych częstotliwościowych

Opisujemy metodę ilościowego określania aktywności przeciwtransportujących K+ ATPaz typu P poprzez heterologiczną ekspresję enzymów w oocytach Xenopus i mierzenie absorpcji Rb+ lub Li+ do pojedynczych komórek za pomocą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej. Metoda ta stanowi czułą i bezpieczną alternatywę dla eksperymentów ze strumieniem radioizotopów, ułatwiając złożone badania kinetyczne.

Pomiar transportu kationów przez Na,K- i H,K-ATPazę w oocytach Xenopus za pomocą spektrofotometrii absorpcji atomowej: alternatywa dla testów radioizotopowych

Tutaj prezentujemy metodę elektrofizjologiczną opartą na solidnych membranach z naciskiem na jej zastosowania do charakterystyki elektrogenicznych transporterów membranowych.

Wprowadzenie do elektrofizjologii opartej na membranach podpartych ciałem stałym

Protokoły zamkniętej pętli stają się coraz bardziej powszechne we współczesnej elektrofizjologii. Przedstawiamy prosty, wszechstronny i niedrogi sposób wykonywania złożonych protokołów elektrofizjologicznych w korowych neuronach piramidowych in vitro, przy użyciu komputera stacjonarnego i cyfrowej płytki akwizycyjnej.

Elektrofizjologia w czasie rzeczywistym: wykorzystanie protokołów zamkniętej pętli do badania dynamiki neuronów i nie tylko

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Transportery w błonach komórkowych umożliwiają różnicową segregację jonów przez błony komórkowe lub warstwy komórkowe i odgrywają kluczową rolę podczas fizjologii, naprawy i patologii tkanek. Opisujemy jonoselektywną, samoreferencyjną mikroelektrodę, która umożliwia pomiar określonych strumieni jonów w pojedynczych komórkach i tkankach in vivo.

Pomiar zewnątrzkomórkowych strumieni jonów za pomocą techniki jonoselektywnych mikroelektrod samoreferencyjnych

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

W pomiarach elektrofizjologicznych obecność potencjału dyfuzyjnego zakłóca precyzyjny pomiar potencjału odwrotnego poprzez zmianę potencjału elektrody. Za pomocą mostka solnego z mikro-agaru wpływ potencjału dyfuzyjnego jest zminimalizowany, co pozwala na bardziej precyzyjny pomiar liczby obrotów substratu odtworzonych rekombinowanych białek błonowych.

Mikroagarowa elektroda mostkowa solna do analizy szybkości wymiany protonów w rekombinowanych białkach błonowych

Nanociała są ważnymi narzędziami w biologii strukturalnej i stanowią ogromny potencjał dla rozwoju terapii. Jednak wybór nanociał o właściwościach hamujących może być wyzwaniem. W tym miejscu demonstrujemy zastosowanie elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM) do klasyfikacji nanociał hamujących i niehamujących ukierunkowanych na elektrogeniczne transportery błonowe.

Wybór nanociał hamujących ukierunkowanych na transporter za pomocą elektrofizjologii opartej na membranie podpartej ciałem stałym (SSM)

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

Do badania reakcji komórek pobudliwych in vitro, protokół opisuje optyczne monitorowanie zmian w generowaniu potencjału czynnościowego przez elektroporację na prostym pobudliwym modelu komórkowym genetycznie modyfikowanych komórek HEK z tet-on, jak również zmian napięcia transbłonowego z automatyczną ekstrakcją odpowiednich parametrów.

Monitorowanie wywołanych przez elektroporację zmian w generowaniu potencjału czynnościowego w genetycznie modyfikowanych ogniwach HEK Tet-On Spiking

Poznaj metodę łączącą mikroelektrody jonoselektywne z patch clampingiem do pomiaru aktywności wymiennika sodowo-wodorowego (NHE). Technika ta umożliwia precyzyjne badanie transportu protonów przez błonę komórkową.

Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Przeglądaj więcej filmów