Zastosowanie pomiarów elektrofizjologicznych do badania aktywności transporterów elektroobojętnych

Metoda gigantycznych plam w połączeniu z mikroelektrodami jonoselektywnymi jest wszechstronną metodą stosowaną do wykrywania i ilościowego określania strumieni jonów. W szczególności służy do pomiaru strumieni protonów generowanych przez aktywność elektroobojętnego transportera jonów, wymiennika sód-wodór lub NHE, który ulega ekspresji na błonie komórkowej. Wymiennik sodowo-wodorowy generuje gradient protonów w bliskiej odległości od błony plazmatycznej, oznaczony tutaj jako pomarańczowy pierścień.

Ten gradient protonów w poprzek błony komórkowej jest mierzony za pomocą zapisu klamry krosowej całej komórki w połączeniu z techniką wykorzystującą mikroelektrodę selektywną dla protonów. Mikroelektroda selektywna protonów jest przesuwana blisko powierzchni ogniwa, gdzie rejestruje strumień protonów wychodzących z komórek, pokazany tutaj w pozycji A. I od powierzchni komórki, gdzie rejestruje stężenie wolnych protonów obecnych w roztworze wskazanym przez pozycję B. A następnie, z powrotem do pozycji A, blisko błony komórkowej, w powtarzalnym, oscylacyjnym ruchu. Różnica napięcia między A a B jest rejestrowana i zależy od przedstawiciela aktywności NHE.

Jony transportujące, takie jak protony, przez błonę komórkową, wpływają na proces niezbędny do życia. Dlatego zmiany pH są ściśle regulowane przez szereg cząsteczek, w tym wymiennik sodowo-protonowy, system wykluczania protonów przez błonę plazmatyczną. Oscylująca mikroelektroda pH w połączeniu z zaciskaniem łat na całe ogniwo to nowatorskie podejście do badania strumienia protonów, w którym pośredniczy aktywność wymiennika sodowo-protonowego.

Zastosowanie tych metod pozwala przezwyciężyć niektóre z głównych ograniczeń zwykle stosowanych technik pomiaru aktywności wymieniacza sodowo-protonowego, takich jak umiarkowana czułość i rozdzielczość czasowa oraz dobra kontrola środowiska wewnątrzkomórkowego. Zademonstruję te metody wraz z moim współpracownikiem, dr Victorem Babichem. Narratorem będzie dr Matthew Henry.

Zamierzamy zademonstrować zastosowanie tej metody, mierząc aktywność izoformy trójki wymiennika sodowo-protonowego, która jest głównym regulatorem wchłaniania soli z wody przez jelito i epithilium nerkowe. Mikroelektrody selektywne protonowe do pomiaru stężenia protonów są wykonane ze standardowych rurek ze szkła borokrzemowego. Elektrody ze szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej 1,2 milimetra i bez żarnika są ciągnięte za pomocą pionowego ściągacza, przy użyciu konwencjonalnego protokołu podwójnego ciągnięcia.

Uzyskuje się końcówkę pipety o średnicy od dwóch do trzech mikrometrów. Pipety umieszcza się w uchwycie na słoik końcówką pipety skierowaną do góry. Następnie przygotowuje się mieszaninę do silikonowania pipet.

Wlewa się go do słoika i szczelnie zamyka pokrywkę. Pipety inkubuje się z mieszaniną silikonową przez 24 do 48 godzin. Zachowaj ostrożność, pamiętaj o przygotowaniu mieszaniny i silikonowaniu pipet w temperaturze pokojowej w dobrze wentylowanym oparze chemicznym.

Z powrotem napełnij pipetę odpowiednią żywicą jonoselektywną i ostrożnie umieść ją pionowo w uchwycie słoika, końcówką pipety skierowaną w dół. Aby przygotować się do zaciskania krosowego, należy rozpocząć od wyciągnięcia pipet do mocowania krosowego z cienkościennego szkła borokrzemianowego o średnicy zewnętrznej dwóch milimetrów i średnicy wewnętrznej 1,4 milimetra w ściągaczu pionowym przy użyciu konwencjonalnego protokołu podwójnego ciągnięcia. Użyj mikrokuźni zamontowanej na stoliku mikroskopu odwróconego, aby wykonać szeroką końcówkę pipety.

Umieść pipetę w pobliżu grubego drutu platynowego mikrokuźni. Włącz ogrzewanie za pomocą przełącznika nożnego, który steruje włączaniem i wyłączaniem prądu. Podgrzej szkło o niskiej temperaturze topnienia, które pokrywa środek grubego drutu platynowego mikrokuźni, a następnie przesuń końcówkę pipety bliżej stopionego miękkiego szkła.

Ogrzewanie przesuwa drut platynowy lekko w kierunku środka. Drut platynowy powraca do pozycji wyjściowej, a końcówka pipety pęka. Powtarzaj procedurę, aż uzyskasz pożądaną średnicę końcówki, a na koniec podgrzej, aby wygładzić końcówkę.

Końcówki do pipet mają średnicę 10 mikrometrów po wypolerowaniu za pomocą mikrokuźni. Zastosowanie grubego drutu platynowego jest korzystne, ponieważ po włączeniu prądu następuje niewielkie rozszerzanie się i mniejsza możliwość przegrzania drutu i pipety przy nadmiernym prądzie. Po dysocjacji komórek za pomocą trypsyny i zablokowaniu trypsynizacji, komórki są utrzymywane na wytrząsarce z kołysaniem, aby zapobiec tworzeniu się grudek.

Odbywa się to do dwóch godzin po próbpsynizacji. Zestaw elektrofizjologiczny składa się z regulatora temperatury do regulacji temperatury roztworu w systemie perfuzyjnym. Wszystkie eksperymenty wykonywane są w temperaturze około 37 stopni Celsjusza.

Oraz przełącznik filtrów optycznych do sterowania kołem filtrów do obrazowania fluorescencyjnego. Sterownik zaworu systemu perfuzyjnego do regulacji otwierania i zamykania zaworów systemu perfuzyjnego. I regulator temperatury do regulacji temperatury komory nagrywającej.

Oscyloskop do obserwacji przebiegów i wzmacniacz z zaciskiem krosowym. Komputer z tym oprogramowaniem Capmeter. I elektrometr do rejestrowania jonoselektywnego sygnału mikroelektrody.

I wzmacniacz różnicowy do wzmacniania sygnału elektrometru. Stanowisko do elektrofizjologii wyposażone jest również w mikroskop odwrócony ze stopniem sterowania, dwa mikromanipulatory ze sterownikami umieszczonymi po lewej i prawej stronie mikroskopu, system perfuzyjny z wbudowaną grzałką roztworu. Po zamontowaniu pipety mikroelektrody jonoselektywnej do mikromanipulatora, należy ponownie napełnić pipetę do zaciskania plastrów roztworem wewnątrzkomórkowym.

Upewnij się, że roztwór dotrze do końcówki pipety. Może to wymagać kilku delikatnych stuknięć w celu wyeliminowania pęcherzyków na końcówce pipety. Następnie zamontuj pipetę do mocowania plastra na głowicy zestawu do elektrofizjologii.

Delikatnie przenieś zdrowo wyglądające komórki do komory rejestracyjnej wypełnionej określoną objętością roztworu kąpieli. Ważne jest, aby stopień czołowy był ustawiony pod kątem 45 stopni do osi poziomej. Zapewnia to kąt przystawienia pipety, który jest odpowiedni do utworzenia wysoce wytrzymałego uszczelnienia.

Podczas gdy pipeta z zaciskiem krosowym jest zanurzona w roztworze do kąpieli, należy przyłożyć niewielką ilość dodatniego ciśnienia do pipety, aby zmniejszyć ryzyko zablokowania końcówki. Wybierz komórkę i zbliż się do niej z niewielką ilością nadciśnienia. Przestań przesuwać pipetę z zaciskiem krosowym, gdy końcówka znajdzie się blisko ogniwa.

Obniż mikroelektrodę jonoselektywną w roztworze kąpieli, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej końcówki pipety z zaciskiem krosowym. Gdy pipeta jest umieszczona centralnie nad celą, zainicjuj uszczelnienie, przykładając niewielką ilość podciśnienia. Uszczelnienie mega-omowe uzyskuje się w ciągu kilku sekund.

Upewnij się, że potencjał podtrzymania jest utrzymywany przez amplifier na poziomie zero miliwoltów. Na koniec rozerwij błonę komórkową serią krótkich impulsów ssania i rozpocznij nagrywanie. Korzystając z metody zapisu gigantycznej plamy, możliwe jest szybkie perfuzjowanie roztworów w szklanej pipecie za pomocą systemu perfuzji wewnątrzpipetowej w celu modyfikacji wewnątrzkomórkowej zawartości jonów, lipidów i białek.

Umieść pipetę mikroelektrody jonoselektywnej blisko ogniwa trzymanego przez pipetę z zaciskiem krosowym i rozpocznij oscylację pipety mikroelektrodowej jonoselektywnej, przesuwając ją do i z ogniwa. Zastosowanie tej techniki pozwala na badanie regulacji molekularnej wymiennika sodowo-wodorowego. Wykorzystując metodę gigantycznych plam, wewnątrzkomórkowy skład ATP i lipidów został zmodyfikowany za pomocą systemu perfuzyjnego w pipetach.

Wewnątrzkomórkowa perfuzja apyrazy, która hydrolizuje wewnątrzkomórkowe ATP i zmniejsza zawartość fosfoinozytolu, spowodowała 50% spadek aktywności izoformy trzeciej NHE. Wpływ apirazy na aktywność NHE3 nie został odwrócony przez wewnątrzkomórkową perfuzję fosfoinozytydu PIP2. Zostało to jednak odwrócone przez wewnątrzkomórkową perfuzję fofonozytydu PIP3.

Pomiar aktywności NHE opiera się na połączeniu metod selektywnej mikroelektrody protonowej i zaciskania kropek. Pozwala to na badanie molekularnych podstaw stojących za różnicową regulacją NHE przez fosfoinozytydy i kaskady sygnałowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć aktywność wymiennika sodowo-protonowego za pomocą oscylacyjnej mikroelektrody pH w połączeniu z zaciskaniem wszystkich łatek ogniw.

I przykład możliwego zastosowania tych metod.