Name: Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Naucz się izolować i hodować progenitorowe komórki nerwowe z mózgu myszy, a następnie wykonywać ChIP do analizy modyfikacji epigenetycznych H3K79me2. Ta metoda pozwala badać rozwój mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Henriette Bertemes za pomoc w ustanowieniu protokołu uprawy CGN w laboratorium. Ta praca metodyczna była wspierana przez finansowaną przez DFG CRC992 Medical Epigenetics poprzez finansowanie dla TV. Autorzy dziękują za wsparcie zespołu z Freiburg Galaxy: Pavankumar Videm, Björn Grüning i prof. Rolf Backofen, Bioinformatyk, Uniwersytet we Freiburgu, Niemcy, ufundowane przez Collaborative Research Centre 992 Medical Epigenetics (grant DFG SFB 992/1 2012) oraz niemieckiego Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań (grant BMBF 031 A538A RBC (de. NBI)).

<ol><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nat. Rev. Neurosci. 8, 427-437 (2007).</li>
<li>Kandel, E. R., Squire, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroscience%3A+breaking+down+scientific+barriers+to+the+study+of+brain+and+mind%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuroscience: breaking down scientific barriers to the study of brain and mind.</a> Science. 290, 1113-1120 (2000).</li>
<li>Götz, M., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development%3A+the+art+of+generating+cell+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Cortical development: the art of generating cell diversity.</a> Dev. Camb. Engl. 132, 3327(2005).</li>
<li>Hirabayashi, Y., Gotoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+neural+precursor+cell+fate+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of neural precursor cell fate during development.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 377-388 (2010).</li>
<li>Davis, A. A., Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-renewing+multipotential+stem+cell+in+embryonic+rat+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A self-renewing multipotential stem cell in embryonic rat cerebral cortex.</a> Nature. 372, 263-266 (1994).</li>
<li>Sauvageot, C. M., Stiles, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+controlling+cortical+gliogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms controlling cortical gliogenesis.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 12, 244-249 (2002).</li>
<li>McConnell, S. K., Kaznowski, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+dependence+of+laminar+determination+in+developing+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell cycle dependence of laminar determination in developing neocortex.</a> Science. 254, 282-285 (1991).</li>
<li>Desai, A. R., McConnell, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+restriction+in+fate+potential+by+neural+progenitors+during+cerebral+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Camb.+Engl%22%5BJournal%5D)">Progressive restriction in fate potential by neural progenitors during cerebral cortical development.</a> Dev. Camb. Engl. 127, 2863-2872 (2000).</li>
<li>Glickstein, M., Strata, P., Voogd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellum%3A+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cerebellum: history.</a> Neuroscience. 162, 549-559 (2009).</li>
<li>Marzban, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+commitment+in+the+developing+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cellular commitment in the developing cerebellum.</a> Front. Cell. Neurosci. 8, (2015).</li>
<li>Azevedo, F. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equal+numbers+of+neuronal+and+nonneuronal+cells+make+the+human+brain+an+isometrically+scaled-up+primate+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Equal numbers of neuronal and nonneuronal cells make the human brain an isometrically scaled-up primate brain.</a> J. Comp. Neurol. 513, 532-541 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+regulation+by+histone+methylation%3A+interplay+between+different+covalent+modifications+of+the+core+histone+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails.</a> Genes Dev. 15, 2343-2360 (2001).</li>
<li>Sanders, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+of+histone+H4+lysine+20+controls+recruitment+of+Crb2+to+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Methylation of histone H4 lysine 20 controls recruitment of Crb2 to sites of DNA damage.</a> Cell. 119, 603-614 (2004).</li>
<li>Martin, C., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+functions+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The diverse functions of histone lysine methylation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 838-849 (2005).</li>
<li>Greer, E. L., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation%3A+a+dynamic+mark+in+health%2C+disease+and+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone methylation: a dynamic mark in health, disease and inheritance.</a> Nat. Rev. Genet. 13, 343-357 (2012).</li>
<li>Ng, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+methylation+within+the+globular+domain+of+histone+H3+by+Dot1+is+important+for+telomeric+silencing+and+Sir+protein+association%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Lysine methylation within the globular domain of histone H3 by Dot1 is important for telomeric silencing and Sir protein association.</a> Genes Dev. 16, 1518-1527 (2002).</li>
<li>Kebede, A. F., Schneider, R., Daujat, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+types+and+sites+of+histone+modifications+emerge+as+players+in+the+transcriptional+regulation+contest%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Novel types and sites of histone modifications emerge as players in the transcriptional regulation contest.</a> FEBS J. 282, 1658-1674 (2015).</li>
<li>Roidl, D., Hacker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+during+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Histone methylation during neural development.</a> Cell Tissue Res. 356, 539-552 (2014).</li>
<li>Mersfelder, E. L., Parthun, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tale+beyond+the+tail%3A+histone+core+domain+modifications+and+the+regulation+of+chromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The tale beyond the tail: histone core domain modifications and the regulation of chromatin structure.</a> Nucleic Acids Res. 34, 2653-2662 (2006).</li>
<li>van Leeuwen, F., Gafken, P. R., Gottschling, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot1p+Modulates+Silencing+in+Yeast+by+Methylation+of+the+Nucleosome+Core%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dot1p Modulates Silencing in Yeast by Methylation of the Nucleosome Core.</a> Cell. 109, 745-756 (2002).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Woo Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RE-IIBP+Methylates+H3K79+and+Induces+MEIS1-mediated+Apoptosis+via+H2BK120+Ubiquitination+by+RNF20%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">RE-IIBP Methylates H3K79 and Induces MEIS1-mediated Apoptosis via H2BK120 Ubiquitination by RNF20.</a> Sci. Rep. 5, 12485(2015).</li>
<li>Vlaming, H., van Leeuwen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+upstreams+and+downstreams+of+H3K79+methylation+by+DOT1L%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">The upstreams and downstreams of H3K79 methylation by DOT1L.</a> Chromosoma. , (2016).</li>
<li>Jones, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+H3K79+methyltransferase+Dot1L+is+essential+for+mammalian+development+and+heterochromatin+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">The histone H3K79 methyltransferase Dot1L is essential for mammalian development and heterochromatin structure.</a> PLoS Genet. 4, e1000190(2008).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+mammalian+erythropoiesis+requires+the+Dot1L+methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Early mammalian erythropoiesis requires the Dot1L methyltransferase.</a> Blood. 116, 4483-4491 (2010).</li>
<li>Cattaneo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L-mediated+H3K79me2+modification+critically+regulates+gene+expression+during+cardiomyocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">DOT1L-mediated H3K79me2 modification critically regulates gene expression during cardiomyocyte differentiation.</a> Cell Death Differ. 23, 555-564 (2016).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modification+mapping+in+human+brain+reveals+aberrant+expression+of+histone+H3+lysine+79+dimethylation+in+neural+tube+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Histone modification mapping in human brain reveals aberrant expression of histone H3 lysine 79 dimethylation in neural tube defects.</a> Neurobiol. Dis. 54, 404-413 (2013).</li>
<li>Büttner, N., Johnsen, S. A., Kügler, S., Vogel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Af9%2FMllt3+interferes+with+Tbr1+expression+through+epigenetic+modification+of+histone+H3K79+during+development+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Af9/Mllt3 interferes with Tbr1 expression through epigenetic modification of histone H3K79 during development of the cerebral cortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7042-7047 (2010).</li>
<li>Roidl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOT1L+Activity+Promotes+Proliferation+and+Protects+Cortical+Neural+Stem+Cells+from+Activation+of+ATF4-DDIT3-Mediated+ER+Stress+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dayt.+Ohio%22%5BJournal%5D)">DOT1L Activity Promotes Proliferation and Protects Cortical Neural Stem Cells from Activation of ATF4-DDIT3-Mediated ER Stress In Vitro.</a> Stem Cells Dayt. Ohio. 34, 233-245 (2016).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29, 24-26 (2011).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat. Methods. 9, 357-359 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9, R137(2008).</li>
<li>Ramírez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Res. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Roidl, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoidl%2C+D+%22Histone+modifications+during+cerebral+cortex+development%22">Histone modifications during cerebral cortex development</a>. , (2015).</li>
<li>Turner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP+with+Native+Chromatin%3A+Advantages+and+Problems+Relative+to+Methods+Using+Cross-Linked+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Mapping+Protein%2FDNA+Interactions+by+Cross-Linking%22%5BJournal%5D)">ChIP with Native Chromatin: Advantages and Problems Relative to Methods Using Cross-Linked Material.</a> Mapping Protein/DNA Interactions by Cross-Linking. , Institut national de la santé et de la recherche médicale. (2001).</li>
<li>Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S., Whittemore, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cortical+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of cortical mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> J. Neurosci. Methods. 209, 219-226 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych

Istnieją dwa główne sposoby przeprowadzania immunoprecypitacji chromatyny w celu wykrycia genomowego zajętości modyfikacji histonów, czynników transkrypcyjnych, czytników kodów histonów, programów zapisujących lub gumek. Jedną z nich jest natywna metoda ChIP wykorzystująca trawioną nukleazą, natywną chromatynę do immunoprecypitacji, a druga to prezentowana metoda wykorzystująca utrwaloną, ścinaną chromatynę utrwaloną PFA, w której nukleosomy i inne białka przyłączone do DNA są kowalencyjnie związane z DNA<sup class="xref...

Funkcje sensoryczne, motoryczne i poznawcze mózgu są bardzo złożone i podatne na zmiany fizyczne i środowiskowe. Mózg składa się z trzech głównych części: tylnej, środkowej i przedniej części mózgu, które są głęboko połączone. W obrębie przodomózgowia kresomózgowie można podzielić na kresomózgowie grzbietowe (DT) i kresomózgowie brzuszne (VT). DT myszy składa się z sześciu warstw korowych, które są utworzone między E11.5 a E18.5 w sposób "na lewą stronę"1. VT obejmuje rozwijające się wypukłości zwojowe, które później tworzą zwoje podstawy2,3. W ośrodkowym układzie nerwowym ssaków można sklasyfikować kilka typów komórek, takich jak neurony, astrocyty lub oligodendrocyty4, które rozwijają się w sposób czasowo-przestrzenny5. Po pierwsze, neuronalne komórki progenitorowe (NPC) dają początek różnym rodzajom neuronów, interneuronów w VT i neuronów projekcyjnych w DT, a następnie komórkom glejowym (np. astrocyty6). Podczas rozwoju kory mózgowej najpierw tworzy się najbardziej powierzchowna warstwa (warstwa I), która zawiera komórki Cajal-Retzius. Następnie, między E12.5 a E14.5, NPC generują głębsze warstwy neuronów (VI, V), podczas gdy między 14,5 a 16,5 progenitorami powstają neurony górnej warstwy (IV-II) 7,8. Tożsamość neuronalna jest określana przez różne czasowo-przestrzenne programy transkrypcyjne indukowane morfogenem oraz dodatkowo przez programy epigenetyczne2.
Móżdżek, który jest zaangażowany w koordynację ruchową, znajduje się w tyłomózgowiu i rozwija się między E10 a mniej więcej P20 u myszy9. Zawiera korę móżdżku i jądra móżdżku10. Dorosła kora móżdżku składa się z trzech warstw, najbardziej zewnętrznej warstwy molekularnej, warstwy komórek Purkinjego i najbardziej wewnętrznej warstwy ziarnistej zawierającej ziarniste neurony10. Komórki ziarniste móżdżku są najmniejszymi neuronami i reprezentują około 80% wszystkich neuronów w mózgu kręgowców11. Rozwijają się z prekursorów znajdujących się w zewnętrznej strefie rozrodczej i migrują przez warstwę komórek Purkinjego do miejsca docelowego12. Podobnie jak w kresomózgowiu, rozwój móżdżku jest regulowany przez kilka ważnych morfogenów, które mają określone funkcje zależne od czasu i przestrzeni oraz inicjują określone programy transkrypcyjne10.
Rozwój warstw korowych i móżdżkowych jest kontrolowany przez transkrypcyjną ekspresję określonych morfogenów, a tym samym przez stan chromatyny DNA. W uproszczonym ujęciu stany chromatyny można podzielić na euchromatynę jako aktywną transkrypcyjnie i heterochromatynę jako obszary ciche transkrypcyjnie. Nukleosom jako podstawowa jednostka chromatyny zawiera dwie kopie każdego histonu rdzeniowego H2A, H2B, H3 i H4, otoczone 147 parami zasad klasy DNA13. Histony są silnie modyfikowane potranslacyjnie przez metylację, acetylację, fosforylację, ubikwitynację, sumoilację, ADP-rybozylację, deaminację i izomeryzację proliny14,15. Metylacja lizyny histonów jest uważana za najbardziej stabilną modyfikację histonów, która kontroluje transkrypcję, replikację, rekombinację16, odpowiedź na uszkodzenie DNA17 i imprinting genomowy18. Lizyny mogą być mono-, di- lub trimetylowane19 i pojawiają się nie tylko na dostępnych ogonach histonów, ale także w domenie globularnej histonów20. Specyficzne metylacje w H3K4 i H3K36 są głównie związane z euchromatyną, specyficzne metylacje w H3K9, H3K27 lub H4K20 występują głównie w regionach heterochromatycznych, chociaż wszystkie reszty znajdują się w ogonie histonowym14,19,21. Metylacja H3K79 znajduje się w domenie globularnej histonów i jest związana z aktywnością transkrypcyjną, ale także z obojętnymi transkrypcyjnie regionami genomu22. Modyfikacja jest ewolucyjnie zachowana, ponieważ zaobserwowano ją u drożdży, grasicy cielęcej, kurczaka i human23. H3K79 mono, di i trimetylacja (H3K79me1, me2, me3) są katalizowane przez metylotransferazy histonowe DOT1L24,25 i Nuclear SET Domain-Containing Protein 2 (Nsd2)26. DOT1L bierze udział w proliferacji, naprawie DNA i przeprogramowaniu komórek27. Utrata Dot1l u myszy prowadzi do śmierci prenatalnej w okolicach etapu rozwojowego E10.528,29. Podczas rozwoju serca i różnicowania miokardiocytów, DOT1L jest niezbędny do regulacji ekspresji genów30. W ośrodkowym układzie nerwowym funkcja DOT1L może być zaangażowana w rozwój cewy nerwowej31, bierze udział w tłumieniu ekspresji Tbr1 podczas rozwoju przodomózgowia32, i może działać w regulacji genów odpowiedzi na stres ER33. Zależne od kontekstu aktywujące lub tłumiące działanie H3K79me, szczególnie w sytuacjach in vivo, takich jak rozwój ośrodkowego układu nerwowego, jest do tej pory tylko częściowo zrozumiałe32. Ponieważ metylacja H3K79 znajduje się w domenie globularnej histonu 3, jest sterycznie mniej dostępna w porównaniu z modyfikacjami elastycznych ogonów histonów23. Aby zrozumieć funkcję metylacji H3K79, potrzebne są wiarygodne i powtarzalne metody analizy w celu określenia jego lokalizacji i środowiska genomowego. W niniejszej pracy przedstawiono metody izolacji różnych neuronalnych komórek progenitorowych (CPC dla kory mózgowej i CGNP dla móżdżku), skuteczne leczenie inhibitorem DOT1L oraz metodę ChIP do analizy metylacji H3K79 za pomocą qPCR lub sekwencjonowania w różnych punktach czasowych rozwoju kory mózgowej i móżdżku. Aby zapoznać się z przeglądem protokołu i jego możliwościami, zobacz Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Anty-GAPDH</td><td>Abcam</td><td>ab8245</td><td>Kategoria: Przeciwciało Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:5000</td></tr><tr><td>Anty-H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>Kategoria: Przeciwciało Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Diagenoda</td> <td>anty-H3K79me2</td><td>pAb-051-050</td><td>Kategoria: Przeciwciało Skrót/Komentarz: Przeciwciało ChIP</td></tr><tr><td>Anti-H3K79me2</td><td>Abcam</td><td>ab-051-050</td><td>Kategoria: Przeciwciało Skrót/Komentarz: Rozcieńczenie immunoblot 1:1000</td></tr><tr><td>Anty-królicze IgG</td><td>Diagenode</td><td>C15410206</td><td>Kategoria: Przeciwciało Skrót/Komentarz: ChIP Ctrl przeciwciało</td></tr><tr><td>Antytubulina alfa</td><td>Abcam</td><td>ab108629</td><td><silny>Kategoria:</silny> Przeciwciało <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Rozcieńczenie immunoblot 1:3000</td></tr><tr><td>Apo-Transferyna (1 mg / ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla</td></tr><tr><td>suplementu CCM B27 (50x)</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla CCM</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent technologies</td><td>G2940CA</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Do analizy chromatyny ścinanej</td></tr><tr><td>Bioruptor NextGen</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Ultrasonics</td></tr><tr><td>Kwas borowy pH 8,4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do hodowli CPC</td></tr><tr><td>CFX Connect RT PCR System wykrywania</td><td>Bio-Rad</td><td>1855201</td><td><silny>Kategoria:</silny> Analiza ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> System detekcji qPCR</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-033</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla CGM</td></tr><tr><td>Dynabeads Protein A</td><td>Invitrogen</td><td>10001D</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Koraliki magnetyczne, do ChIP</td></tr><tr><td>EPZ-5676</td><td>Selleckchem</td><td>S7062</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hamowanie DOT1L <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do hamowania DOT1L w hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>SERVA</td><td>39760.01</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca EDTA 10% (v / v)</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do izolacji CPC i CGM</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/Komentarz: Do izolacji CGNP</td></tr><tr><td>Glutation (1,25 mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla CCM</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3187</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>GoTaq mastermix</td><td>Promega</td><td>A6002</td><td>Kategoria: Analiza ChIP Skrót/Komentarz: Główna mieszanka polimerazy DNA do qPCR</td></tr><tr><td>Hank' s Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025-100</td><td>Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/Komentarz: HBSS</td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td>Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/Komentarz: Dla CCM</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do hodowli CPC</td></tr><tr><td>Chlorek litu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Suplement LiCl</td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla CGM</td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher</td><td>3300</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Fluorospektrometr do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>NEB Next Ultra Zestaw do przygotowania biblioteki dla Illumina</td><td>NEB</td><td>E7645S</td><td>Kategoria: ChIP Analysis Skrót/Komentarz: Zestaw do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos dla Illumina</td><td>NEB</td><td>E7335</td><td>Kategoria: Analiza ChIP Skrót/Komentarz: Oligotypy do przygotowania biblioteki</td></tr><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla CCM</td></tr><tr><td>NP-40 Alternatywny</td><td>Calbiochem</td><td>492016</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla bufora ChIP</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Carl Roth</td><td>335</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> PFA, do utrwalania komórek</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna-Neomycyna 1% (v/v)</td><td>Life Technologies</td><td>15640055</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> PSN, dla CCM i CGM</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> PBS, do izolacji CPC</td></tr><tr><td>PicoGreen Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>P11496</td><td>< silny>Kategoria:</silny> Analiza ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Wizualizacja barwnika do kwantyfikacji DNA</td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do izolacji CGNP</td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-L-ornityny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do hodowli CPC</td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9640G</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> KCl, dla</td></tr><tr><td>inhibitora proteazy</td> CGM <td>Roche</td><td>4693159001</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla Proteinazy</td></tr><tr><td>ChIP K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla ChIP</td></tr><tr><td>Qiagen MinElute</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Zestaw do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny> Skrót / komentarz: Dla ChIP</td></tr><tr><td>SGC0946</td><td>Selleckchem</td><td>S7079</td><td>Kategoria: Inhibicion DOT1L Skrót/Komentarz: Do hamowania DOT1L w hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Carl Roth</td><td>8551.1</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: dla buforu elucyjnego</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: NaCl, dla buforu ChIP</td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30970</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Dla</td></tr><tr><td>ChIP Sodium dodecylosiarczan</td><td>Carl Roth</td><td>183</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: SDS, dla ChIP</td></tr><tr><td>Sonic hedgehock (SHH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP6004</td><td>Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/Komentarz: Do izolacji CGNP</td></tr><tr><td>Dysmutaza ponadtlenkowa (1mg/ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7571</td><td>Kategoria: Hodowla komórkowa Skrót/Komentarz: Dla CCM</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Carl Roth</td><td>9090</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: TRIS, dla bufora ChIP</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>X100</td><td><silny>Kategoria:</silny> ChIP <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Dla bufora ChIP</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,05% (w/v)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>59417C</td><td><silny>Kategoria:</silny> Hodowla komórkowa <silny>Skrót/Komentarz:</silny> Do izolacji CPC</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Carl Roth</td><td>28320</td><td>Kategoria: ChIP Skrót/Komentarz: Do przygotowania koralików</td></tr><tr><td>Inne urządzenia laboratoryjne: Komora licząca Neubauera, Inkubator, Rotator, Wytrząsarka, Zestaw do rozwarstwiania, Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>CCM: Pożywka</td><td></td><td></td><td></td>dla komórek korowych</tr><tr><td>CGM: Pożywka</td><td></td><td></td><td></td> do hodowli komórkowych CGNP</tr></tbody></table>

izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Rozwój mózgu to złożony proces, który jest kontrolowany w sposób czasowo-przestrzenny przez gradienty morfogenów i różne programy transkrypcyjne. Ponadto modyfikacje chromatyny epigenetycznej, takie jak metylacja histonów, odgrywają ważną rolę w ustalaniu i utrzymywaniu określonych losów komórek w tym procesie. Zdecydowana większość metylacji histonów zachodzi na elastycznym ogonie histonowym, który jest dostępny dla modyfikatorów histonów, gumek i białek czytnika histonów. Natomiast metylacja H3K79 znajduje się w domenie kulistej histonu 3 i bierze udział w różnych funkcjach rozwojowych. Metylacja H3K79 jest ewolucyjnie konserwatywna i można ją znaleźć u wielu gatunków, od Homo sapiens po Saccharomyces cerevisiae. Modyfikacja zachodzi w różnych populacjach komórek w organizmach, w tym w progenitorach nerwowych. Lokalizacja metylacji H3K79 w domenie globularnej histonu 3 utrudnia jego ocenę. W tym artykule przedstawiono metody izolacji i hodowli komórek progenitorowych kory mózgowej (CPC) z embrionalnej tkanki mózgowej kory mózgowej (E11.5-E14.5) lub progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku (CGNP) z tkanki postnatalnej (P5-P7) oraz skutecznego immunoprecypitacji H3K79me2 do ilościowego PCR (qPCR) i sekwencjonowania całego genomu.

Ogólny schemat izolacji progenitorów neuronalnych, hodowli, ChIP H3K79me2 oraz metod analizy ChIP: Rysunek 1 przedstawia schemat blokowy przeprowadzania ChIP H3K79me2 w komórkach progenitorowych kory w różnych punktach czasowych podczas embrionalnego rozwoju mózgu lub w progenitorach neuronów ziarnistych móżdżku w etapach postnatalnych. W pierwszym kroku należy wyizolować mózg i pobrać telencefalon (między E11.5 a E14.5) lub móżdżek (P5-P7). ...

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...

Ogólnym celem tej procedury jest analiza modyfikacji epigenetycznych podczas rozwoju mózgu, zwłaszcza w korze mózgowej i móżdżku. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak to, w jaki sposób modyfikacje histonów, takie jak metylacja H3K79, mogą wpływać na rozwój warstw korowych i móżdżku. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy badać in vivo modyfikacje histonów, specyficzne dla locus lub całego genomu, w różnych regionach mózgu w określonych punktach czasowych rozwoju.Zacznij od mózgów od P5 do P7 i myszy MRI. Usuń wszystkie opony mózgowe i naczynia krwionośne. Następnie przenieś od trzech do pięciu móżdżku na chip do 15-mililitrowych probówek.Umyj móżdżek glukozą HBSS przed odwirowaniem. Odwirować probówki, aby zebrać tkankę. Po ostatnim płukaniu homogenizuj móżdżek, delikatnie pipetując w górę i w dół dwa do trzech razy pipetą o pojemności jednego mililitra, aż fragmenty osiągną wielkość od 0,5 do jednego milimetra sześciennego.Delikatnie usuń cały płyn, aż pozostanie 2,5 mililitra. Następnie dodaj 0,05% trypsyny do probówki z glukozą HBSS zawierającą móżdżce. I inkubuj tkankę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.Odwróć tkankę co jedną do trzech minut. Po inkubacji zatrzymaj trawienie, dodając pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowych CGNP lub CGM i zbierz tkankę przez odwirowanie, jak poprzednio. Po odwirowaniu usunąć supernatant i dodać jeden mililitr CGM.Rozcieraj tkankę za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza. Następnie dodaj pięć mililitrów CGM i inkubuj mieszaninę przez dwie minuty na lodzie, aby osadzić resztki tkanek. Gdy tkanka się uspokoi, przenieś supernatant do nowej 15-mililitrowej probówki.Następnie dodaj dwa mililitry CGM do pozostałej tkanki i powtórz procedurę rozcierania przed pobraniem supernatantu i odrzuceniem resztek tkanki. Połącz supernatanty z każdej 15-mililitrowej probówki tkanki i odwiruj, aby zebrać komórki móżdżku. Zawiesić granulat w 10 mililitrach CGM.Ponieważ astrocyty szybciej i silniej przylegają do poli-D-lizyny niż CGNP, dodaj do czterech mililitrów zawiesiny komórkowej do studzienek 6-dołkowych płytek pokrytych poli-D-lizyną i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby usunąć astrocyty. Wstrząśnij płytką, zbierz supernatant do 15-mililitrowej probówki, a następnie odwiruj supernatant jak poprzednio. Ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach CGM i policzyć komórki za pomocą komory liczącej Neubauera.Po czterech do sześciu godzinach przylegające CGNP wydają się okrągłe i proliferują. Wysiewaj komórki w CGM na płytkach pokrytych poli-L-ornityną i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% CO2 i 100% wilgotności względnej. Po jednym dniu in vitro lub DIV1 większość CGNP jest okrągła i namnaża się.Niektóre CGNP zaczną się różnicować i zaczną wyrastać z wypukłości neuronalnych. Aby utrwalić hodowane komórki, dodaj do jednego mililitra 1% PFA bezpośrednio do studzienek zawierających CGNP. Po pięciominutowej inkubacji w temperaturze 22 stopni Celsjusza dodaj 53 mikrolitry glicyny i przemyj dwukrotnie trzema mililitrami lodowatego PBS.Użyj skrobaka do komórek, aby zebrać komórki w jednym mililitrze PBS. Przenieś komórki do 1,5-mililitrowych probówek i wiruj przez pięć minut w temperaturze 1 000 g i czterech stopniach Celsjusza. Po usunięciu supernatantu dodać 700 mikrolitrów buforu do lizy zawierającego inhibitor proteazy i inkubować próbki przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W tym czasie należy wirować próbki co pięć minut. Po inkubacji podzielić probówki z próbkami, aby upewnić się, że objętość nie przekracza 400 mikrolitrów na probówkę. Następnie sonikuj przez 10 minut z maksymalną mocą, aby ścinać chromatynę komórek lizy.Po 10 minutach należy zawirować próbki, a następnie powtórzyć sonikację i wirowanie jeszcze dwa razy. Sprawdzić lizat pod kątem pozostałych jąder za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym lub mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu DAPI. Osadzaj resztki komórek, wirując przez 10 minut w temperaturze 13 000 g i czterech stopniach Celsjusza.Po zakończeniu użyć supernatantu do etapu wstępnego oczyszczania. Aby wstępnie oczyścić próbki, najpierw umyj 20 mikrolitrów niesprzężonych kulek magnetycznych na próbkę w lodowatym PBS Tween. Usuń pranie za pomocą stojaka magnetycznego.Następnie dodaj 600 mikrolitrów buforu rozcieńczającego i 20 mikrolitrów przemytych kulek magnetycznych do każdej próbki w celu wstępnego usunięcia i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze. Po inkubacji usuń koraliki za pomocą stojaka magnetycznego. Następnie weź 5% każdego lizatu jako próbki wejściowe i zamroź je w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Sprzęganie przeciwciał można przeprowadzić podczas wstępnego oczyszczania próbek. Umyj 45 mikrolitrów kulek magnetycznych białka A na chip za pomocą lodowatego PBS Tween, tak jak poprzednio. Po ostatnim umyciu dodaj jeden mililitr lodowatego PBS do kulek.Następnie dodać trzy mikrogramy przeciwciała na 45 mikrolitrów porcji kulek. Inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza na rotatorze, aby związać przeciwciała z kulkami. Po upływie czasu inkubacji ponownie zawiesić umyte kulki sprzężone z przeciwciałami w jednej objętości kulki lodowatego PBS.Podziel każdy wstępnie oczyszczony ekstrakt na dwie probówki o pojemności około 643,5 mikrolitra. Dodać taką samą objętość buforu rozcieńczającego i kulek związanych z przeciwciałami i inkubować próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc na rotatorze. Następnego dnia umyj kulki lodowatymi wiórowymi od jednego do trzech przez 10 minut każdy na rotatorze w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie wykonaj trzy pięciominutowe płukania buforem TE.Dodać bufor elucyjny i rozcieńczać przez godzinę przy 1 400 obr./min w wytrząsarce w temperaturze pokojowej. Po upływie godziny dodać 10 mikrogramów Rnazy do każdej próbki chipa i pięć mikrogramów do próbek wejściowych. Inkubować próbki na wytrząsarce przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Na koniec dodaj 100 mikrogramów proteinazy K na próbkę chipa i 50 mikrogramów na wejście. Inkubować przez noc w temperaturze 65 stopni Celsjusza przy 1,400 obr./min. Poziomy dimetylacji H3K79 są obniżone po trzech dniach hodowli CPC i zahamowania DOT1L przez SGC 0946.QCPR po analizie chipów ujawniło, że geny z wysokim poziomem metylacji histon-3-lizyny-79 na początku badania były najbardziej wrażliwe na leczenie inhibitorem. Geny o niższym pokryciu dimetylacją H3K79 nie wykazały znaczącej zmiany w poziomach metylacji. Ta mapa cieplna pokazuje, że poziomy metylacji histonów-3-lizyny-79 osiągają szczyt wokół miejsca początkowego transkrypcji i zmniejszają się w kierunku miejsca końcowego transkrypcji.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu około tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić immunoprecypitację chromatyny na modyfikacjach histonów w izolowanych komórkach mózgowych.

isolation-cultivation-neural-progenitors-followed-chromatin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Heterogeniczność komórkowa tkanki mózgowej stanowi istotne ograniczenie w badaniach nad oznaczeniami epigenetycznymi w chromatynie, ponieważ większość analiz nie zapewnia rozdzielczości na poziomie pojedynczej komórki. Neurony są zazwyczaj przemieszane z glejem i innymi komórkami nieneuronalnymi. Przedstawiamy protokół izolacji i gromadzenia jąder neuronalnych z ludzkiego mózgu.

Izolacja jąder neuronalnych z tkanki mózgowej ludzi pobranej po śmierci

W niniejszej pracy opisujemy sposób wytwarzania, namnażania i immunoznakowania postnatalnych neuralnych komórek progenitorowych (NPCs) hipokampa w kulturze trójwymiarowej (3D). Następnie, wykorzystując hybrydowe technologie wizualizacji, demonstrujemy, w jaki sposób cyfrowe obrazy immunoznakowanych kriosrezy mogą służyć do rekonstrukcji i mapowania położenia przestrzennego komórek immunopozytywnych w całej trójwymiarowej neurosferze.

Lokalizacja białek w trójwymiarowej kulturze komórek macierzystych neuronów: hybrydowa metodologia wizualizacji

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Izolacja embrionalnej grzebieni neuralnej z rurki neuralnej umożliwia zastosowanie metod in vitro do badania migracji, samoodnawiania oraz multipotencji grzebieni neuralnej.

Izolacja i hodowla komórek grzebienia neuronalnego z zarodkowej rurki nerwowej myszy

Ten film demonstruje technikę izolowania indukowanych nerwowych komórek progenitorowych (iNPC) pochodzących z dorosłych ludzkich fibroblastów. Przedstawiono w nim etapy związane z izolacją kolonii iNPC i hodowlą ich w wielodołkowych dołkach płytkowych pokrytych lamininą w obecności odpowiednich pożywek hodowlanych, które ułatwiają ciągłą proliferację i ekspansję populacji iNPC.

Izolowanie indukowanych kolonii nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z fibroblastów dorosłego człowieka

Ten film pokazuje izolację i hodowlę komórek progenitorowych móżdżku z móżdżku móżdżku. Progenitorzy neuronów ziarnistości móżdżku są izolowane i oczyszczane poprzez adhezję różnicową, skutecznie usuwając astrocyty. Ci wyhodowani przodkowie następnie różnicują się w neurony ziarniste móżdżku.

Izolowanie i hodowla mysich progenitorów neuronów ziarnistych móżdżku

Źródło: Mendez, F. M.  i inni., Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018). Ten film pokazuje izolację kompleksów białko-DNA z komórek neurosfery pochodzących z guza mózgu myszy przy użyciu natywnej immunoprecypitacji chromatyny. Szczegółowo opisuje etapy przygotowania chromatyny, immunoprecypitacji, płukania i trawienia białek w celu uwolnienia DNA do dalszej analizy.

Immunoprecypitacja chromatyny natywnej komórek neurosfery

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Mechanizmy epigenetyczne są często zmieniane w glejaku. Immunoprecypitacja chromatyny może być wykorzystana do badania konsekwencji zmian genetycznych w glejaku, które wynikają ze zmian w modyfikacjach histonów, które regulują strukturę chromatyny i transkrypcję genów. Protokół ten opisuje natywną immunoprecypitację chromatyny na neurosferach mysiego guza mózgu.

Natywna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu mysich neurosfer guza mózgu

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Naucz się izolować i hodować progenitorowe komórki nerwowe z mózgu myszy, a następnie wykonywać ChIP do analizy modyfikacji epigenetycznych H3K79me2. Ta metoda pozwala badać rozwój mózgu.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Przeglądaj więcej filmów